白屈菜紅堿可濕性粉劑的研發(fā)及對水稻激素的影響

摘要：為促進以白屈菜紅堿為原藥開發(fā)的綠色生物農藥的應用推廣，探索白屈菜紅堿影響水稻激素分泌的機制，及對農業(yè)生產和生態(tài)保護的重要意義。通過流點法選定可濕性粉劑的分散劑，并篩選出各種助劑的用量，從而確定了濕性粉劑的最佳配方，即以10%的白屈菜紅堿作為主要成分，輔以8%的Ultrazine NA、16%的TAMOL DN和8%的Atlox Metasperse 550S作為分散劑，同時使用8%的GEROPON SDS作為潤濕劑，以及10%的白炭黑HL-200和39.5%的無水葡萄糖作為填料。以Aguique Soap L 0.5%為消泡劑。應用靶向代謝組學技術探究白屈菜紅堿對水稻激素分泌的影響發(fā)現(xiàn)，白屈菜紅堿可濕性粉劑處理水稻后，代謝物有明顯差異，藥劑處理組中水楊酸含量為對照組的近3倍，同時也能夠促進水稻分泌赤霉素和吲哚乙酸，推斷白屈菜紅堿可濕性粉劑增強了水稻的抗病性。

關鍵詞：白屈菜紅堿；可濕性粉劑配方；稻曲??；植物激素

收稿日期：2024-12-11

基金項目：黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務費項目（CZKYF2023-1-C016）。

第一作者：韋慶慧（1987-），女，博士，副研究員，從事植物源農藥研究。E-mail：weiqinghuizi@126.com。

通信作者：宋偉豐（1982-），男，博士，副研究員，從事農藥學研究。E-mail：songweifeng2000@163.com。

植物天然激素，簡稱植物激素，已知的植物激素有生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯和油菜素甾醇六大類［1］，植物激素在植物生長和發(fā)育中起關鍵調節(jié)作用，尤其在激活免疫反應和調控過程中。例如，水楊酸、茉莉酸和乙烯途徑在植物超敏反應中至關重要，主要通過增加活性氧含量和激活基因表達來觸發(fā)激素信號傳導［2］。

傳統(tǒng)中草藥白屈菜（Chelidonium majus L.）系罌粟科（Papaveraceae）白屈菜屬植物。主要活性成分為生物堿，其中異喹啉類生物堿白屈菜紅堿具有較強的抗菌、殺蟲活性［3］。在醫(yī)學領域，其藥理作用已得到充分證明，包括選擇性抑制蛋白激酶C，抗炎和抗腫瘤活性［4-5］。在農業(yè)領域，范海延等［6］觀察到白屈菜紅堿對鐮刀菌、炭疽菌以及灰霉菌等農業(yè)病原菌的菌絲生長具有顯著的抑制效果。研究顯示，白屈菜紅堿能有效抑制稻綠核菌孢子萌發(fā)，抑制率高達86.7%，并促進細胞凋亡［7］。白屈菜紅堿懸浮劑在田間試驗中對稻曲病有較好的防治效果，有效成分用量為192 mL·hm-2時，防治率可達95.88%［8］。且在小鼠毒性試驗中發(fā)現(xiàn)該懸浮劑的LD50為1 580 mg·kg-1，低毒，具有殘留低、環(huán)境友好、耐藥等特點［9］。以白屈菜紅堿為原藥的綠色生物農藥的研發(fā)對于農業(yè)生產和生態(tài)保護具有重要意義。

農藥生產中關于白屈菜紅堿的研究大多集中于病害防治，關于其調節(jié)植物免疫、影響作物激素的研究較少。通過研發(fā)以白屈菜紅堿為原藥的可濕性粉劑配方，并采用盆栽試驗探究其對水稻植株激素分泌的影響，以期為白屈菜紅堿增強農作物抗病能力的實際應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 制劑及水稻材料

白屈菜紅堿提取物（含量為16%）［7］。

分散劑包括：北京格林泰姆科技有限公司生產的Greensperse 1506和Greensperse 1508、阿克蘇諾貝爾公司的MORWET D-425、鮑利葛工業(yè)有限公司的Ultrazine NA、巴斯夫有限公司的TAMOL DN、禾大化學品（上海）有限公司的Atlox Metasperse 550S和Dispersol CBZ，以及亨斯邁化工貿易（上海）有限公司的TERSPERSE 2700和索爾維集團的GEROPON T36。

潤濕劑包括：索爾維集團的GEROPON SDS、阿克蘇諾貝爾公司的Morewet EFW、索爾維集團的Geropon L-WET/P、亨斯邁化工貿易（上海）有限公司的TERWET 1004，以及國藥集團的K12。

填充劑包括：國藥集團的硫酸銨、硫酸鈉、無水葡萄糖，玉鋒集團生產的玉米淀粉，蘇州中材產出的輕質碳酸鈣、煅燒高嶺土、硅藻土、膨潤土，宜昌匯富硅材料有限公司制造的白炭黑HL-200。

消泡劑為巴斯夫有限公司生產的Aguique Soap L。

甲醇/乙腈/乙酸（安譜，色譜級）。

水稻品種為中國黑龍江省五常五優(yōu)稻4號，本次試驗在黑龍江省農業(yè)科學院內的溫室大棚試驗基地內進行。

1.1.2 儀器設備

北京瑞百麗商貿提供的多功能食品加工機、精度達0.01 g和0.000 1 g的電子天平、安捷倫HPLC1220型號高效液相色譜儀、哈納品牌的pH計，以及超微氣流粉碎機；燒杯（100 mL）、容量瓶（50 mL）、滴管、玻璃棒、藥匙、秒表、250 mL具塞量筒（分度2 mL）。盆栽桶（口徑15 cm）。Q Exactive 質譜儀（Thermo），Vanquish 超高壓液相色譜儀（Thermo），低溫高速離心機（Eppendorf 5430R），組織破碎儀（神宇龍騰），冷凍干燥機（四環(huán)）。

1.2 白屈菜紅堿可濕性粉劑助劑的篩選

1.2.1 流點法初篩分散劑

在應用流點法進行分散劑的篩選過程中，首先需準備5%濃度的分散劑水溶液。取10 g白屈菜紅堿提取物粉末，利用移液管將制備好的分散劑溶液緩慢加入粉末中，并使用玻璃棒持續(xù)攪拌，直至混合物漿液能夠順暢地從玻璃棒上滴落。記錄下所消耗的分散劑溶液量，進而計算出單位質量有效成分所需的溶液體積，此即為流點［10］。通常情況下，采用流點法進行分散劑的篩選，流點較低的分散劑更有利于懸浮率的提升［8］。利用流點法初步篩選出適合配方體系的分散劑。

對于普通的可濕性粉劑來說，關鍵在于選擇恰當?shù)臐櫇穹稚源_保產品在接觸水時能有效潤濕，并在水中保持良好的懸浮穩(wěn)定性［11-12］。在保證白屈菜紅堿化學穩(wěn)定性合格的基礎上，再考慮潤濕和分散性能，最終確定較優(yōu)助劑。根據分散劑初篩結果，選擇相對效果較好的Ultrazine NA、TAMOL DN和Atlox Metasperse 550S進行下一步試驗。

1.2.2 潤濕劑篩選

根據分散劑的篩選結果，設計5個方案進行潤濕劑的篩選，從GEROPON SDS、Morewet EFW、Geropon L-WET/P、TERWET 1004、K12中選擇性能更穩(wěn)定的潤濕劑進行下一步填料的篩選（表1）。

1.2.3 填料篩選

分別將硅藻土、膨潤土、β環(huán)糊精、白炭黑HL-200及無水葡萄糖等填充劑單獨添加，檢查是否出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，進行初步篩選試驗。選擇不產生沉淀或者相對沉淀量少的白炭黑HL-200和無水葡萄糖作為填料進行配方的優(yōu)化，設計了5個方案（表2）。并觀察入水后的分散情況，以及是否有沉淀產生。

1.2.4 白屈菜紅堿可濕性粉劑最佳配方的篩選及制備

按方案稱取原料、輔助劑和填充物，進行初步混合與粉碎。之后，用氣流粉碎機進一步粉碎混合物，確保粒度達標（D50為5.00～6.00 μm）。最終，收集制得的產品，并檢測潤濕時間、泡沫持久性、細度、熱儲穩(wěn)定性等指標。

1.3 白屈菜紅堿可濕性粉劑對水稻植株激素的影響

1.3.1 白屈菜紅堿可濕性粉劑噴灑水稻盆栽

5月中旬進行水稻秧苗的培育與維護。首先，使用自來水對盆栽土壤浸潤7 d，以促進土壤熟化，隨后進行秧苗的移植，每盆（口徑15 cm）可種植2～4株幼苗。在水稻生長的初期至中期，應持續(xù)保持水淹狀態(tài)，而到了分蘗期的后期，則需逐漸降低水淹深度，并開始實施烤田，以控制水分。

制備獲得的白屈菜紅堿可濕性粉劑對抽穗期前后3～5 d的水稻進行噴施，共噴施兩次，每次噴施劑量為0.8 mL·m-2（用水量60 mL·m-2），兩次噴施間隔時間為8～10 d。設置清水對照組CK，藥劑處理組Y。3次重復，每組10盆。第二次噴施結束后7 d，采集對照組與藥劑處理組水稻葉莖，進行植物激素含量的測定。

1.3.2 標準品溶液的配制

首先精確地量取標準品（表3），使用甲醇將其稀釋至10 mg·mL-1的標準溶液母液。隨后，從這些母液中取出適量混合，制備成100 μg·mL-1的標準品混合溶液。最后，依據給定的濃度梯度，制備出適合儀器分析的一系列標準品。

1.3.3 樣品提取程序

準確稱取100 mg樣品，加入1 mL的50%乙腈水溶液。在4 ℃條件下，對樣品執(zhí)行3 min的超聲波處理，隨后進行30 min的低溫提取。以12 000 r·min-1的速率，在4 ℃下進行離心操作10 min，取其上層清液。通過反相固相萃取柱進行凈化：依次加入1 mL的純甲醇和1 mL的去離子水進行柱平衡，再用50%乙腈水溶液進行平衡。樣品上樣后，用1 mL的30%乙腈水溶液進行沖洗，收集洗脫液。將樣品在氮氣流下蒸發(fā)至完全干燥，溶解于200 μL的30%乙腈中，并轉移至含有內插管的樣品瓶中。

1.3.4 儀器參數(shù)設置

本研究中所采用的數(shù)據采集儀器系統(tǒng)主要由美國Thermo Fisher Scientific公司生產的超高效液相色譜儀（Vanquish， UPLC）以及高分辨質譜儀（Q Exactive）構成（https：//www.thermofisher.com/）。

液相色譜分析參數(shù)設定如下：采用Waters公司生產的HSS T3色譜柱（規(guī)格為50.0 mm×2.1 mm，顆粒大小為1.8 μm）；流動相由A相超純水（含0.1%乙酸）和B相乙腈（含0.1%乙酸）組成；流速設定為0.3 mL·min-1；柱溫維持在40 ℃；進樣量為2 μL；洗脫梯度設置為：初始0 min時水和乙腈比例為90∶10（V/V），1 min后保持不變，至7 min時仍為90∶10，7.1 min時迅速調整至10∶90，并持續(xù)至9 min。QExactive質譜及ESI參數(shù)等設置參考黃燕芬等［13］的方法。

1.4 數(shù)據分析

使用DPS 15.0對數(shù)據進行統(tǒng)計與分析，顯著性檢驗采用單因素方差分析的最小極差法（Least significant ranges，LSD），設定顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 白屈菜紅堿可濕性粉劑制劑配方的確定

2.1.1 白屈菜紅堿可濕性粉劑助劑的確定

如表4所示，Ultrazine NA、TAMOL DN和Atlox Metasperse 550S的流點低，更適合作為分散劑，因此選擇它們來開展后續(xù)的試驗。

如表5所示，配方一中GEROPON SDS作為潤濕劑可以使制劑的性能更為穩(wěn)定，因此選定該潤濕劑繼續(xù)進行后續(xù)的篩選工作。

初步篩選試驗結果顯示，僅使用硅藻土、膨潤土、β環(huán)糊精等填充材料時，均觀察到沉淀現(xiàn)象。然而，白炭黑HL-200與無水葡萄糖的搭配能夠略微緩解這一問題。基于此，決定采用白炭黑HL-200和無水葡萄糖作為填充材料，進一步優(yōu)化配方。優(yōu)化配方后的結果如表6所示，對比后發(fā)現(xiàn)，配方10的分散性能最優(yōu)。以上結果已申報專利，并授權（詳見OSID碼）［14］。

2.1.2 白屈菜紅堿可濕性粉劑最佳配方的確定

在配方10的基礎中添加些許消泡劑Aguique Soap L，配方詳情見表7。檢測該白屈菜紅堿可濕性粉劑，其為能自由流動的粉末，無可見的外來雜質和硬團塊；含量為10%±1%；含水量0.78%，pH為6.53，懸浮率80.61%，潤濕時間92 s，泡沫持久性18 mL·min-1，細度99.1%，熱儲穩(wěn)定性合格，以上均符合國標要求。

2.2 水稻響應白屈菜紅堿可濕性粉劑的激素變化

如圖1所示，藥劑處理組中水楊酸含量為643.71 ng·g-1，對照組中為228.71 ng·g-1，含量明顯增加，是對照組的2.8倍。藥劑處理組Y中赤霉素A3明顯增加，含量為3.10 ng·g-1，是對照組CK含量（1.15 ng·g-1）的2.7倍。藥劑處理組Y中哚乙酸含量為801.34 ng·g-1，是對照組CK中含量（767.83 ng·g-1）的1倍多。赤霉素A1、脫落酸、茉莉酸、赤霉素A7、赤霉素A4和茉莉酸-異亮氨酸均下降。

由圖2可以看出，處理組與對照組中含量排名前8的代謝物聚集在不同區(qū)域，表明兩組之間這8種代謝物的結構組成存在顯著差異。

主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）結果如圖3，兩組點云（point cloud）在空間分布上呈現(xiàn)出明顯的分隔，揭示了兩組樣本在代謝物組成結構上存在明顯的差異。綜上，均說明白屈菜紅堿對水稻的代謝物分泌有明顯影響。

3 討論

化學農藥是控制稻曲病最有效的方法，但長期重復使用可能導致農藥抗性和環(huán)境中有害殘留物的積累［8］。因此，迫切需要開發(fā)環(huán)境兼容的方法來控制作物病害或者提高作物抗病性，植物源成分特有的環(huán)保特性具有開發(fā)為農藥的潛質。

3.1 生物源農藥白屈菜紅堿可濕性粉劑的優(yōu)勢

農藥制劑與劑型發(fā)展的目標是降低毒性，提高安全性。主要通過開發(fā)新型制劑和改良現(xiàn)有產品來實現(xiàn)［15-16］。隨著人們環(huán)保意識的提高，一部分環(huán)保安全農藥新劑型正逐步取代傳統(tǒng)農藥劑型，可濕性粉劑不使用有機溶劑，具有包裝、運輸費用低和耐儲存等優(yōu)點。白屈菜紅堿來源于中草藥白屈菜，本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)其懸浮劑的LD50為1 580 mg·kg-1，低毒［9］。

本研究針對白屈菜紅堿原藥，開發(fā)了一種新型的可濕性粉劑。粉劑配方含10%白屈菜紅堿原藥，分散劑Ultrazine NA 8%、TAMOL DN 16%和Atlox Metasperse 550S 8%，潤濕劑GEROPON SDS 8%，以及白炭黑HL-200 10%和無水葡萄糖 39.5%的填料。此外，消泡劑Aguique Soap L 0.5%也被添加到配方中。將該白屈菜紅堿可濕性粉劑稀釋后噴施于水稻能夠有效防治水稻稻曲病，當用量為2 kg·hm-2時，防治效果為70.97%［14］。同時該藥劑可以影響水稻激素的分泌，增強水稻的抗病性。

3.2 白屈菜紅堿可濕性粉劑對于水稻中水楊酸的影響

水楊酸作為植物內源性信號分子，對植物的多項生理過程具有調控作用，包括但不限于植物的免疫反應、衰老相關基因的表達以及果實產量等。研究揭示，水楊酸通過影響其他植物激素如茉莉酸、乙烯和生長素等的生物合成及信號傳導途徑，實現(xiàn)對植物多種生理過程的協(xié)同調控［17-18］。金太成等［19］揭示了植物水楊酸途徑防御基因應答非生物脅迫相關的分子機制中ROS1起重要作用，可為探索植物適應不利環(huán)境的表觀調控機制提供參考。本研究中，白屈菜紅堿可濕性粉劑處理水稻植株后，藥劑處理組水楊酸含量是對照組的2.8倍，推斷白屈菜紅堿可濕性粉劑增強了水稻的抗病性。

3.3 白屈菜紅堿可濕性粉劑對于水稻中赤霉素的影響

赤霉素作為植物生長調節(jié)劑，在種子形成過程中，能促進細胞分裂和生長，提高種子萌發(fā)率［20］。研究顯示，赤霉素信號通路是病原菌的關鍵靶點，與水楊酸、茉莉酸信號通路緊密相關。植物被活體營養(yǎng)型病原菌侵染時，若DELLA蛋白編碼基因發(fā)生突變，水楊酸信號通路的反應會加強［2］。研究人員發(fā)現(xiàn)黃單胞菌的效應因子XopDXcc8004可抑制赤霉素誘導的DELLA蛋白降解，進而抑制水楊酸信號激活［21］。本研究中，白屈菜紅堿可濕性粉劑處理水稻植株后，藥劑處理組赤霉素含量是對照組含量的近3倍，推斷白屈菜紅堿具有促進水稻植株生長的作用。

3.4 白屈菜紅堿可濕性粉劑對于水稻中吲哚乙酸的影響

陶龍興［22］的研究揭示了在抽穗前對幼穗施用吲哚乙酸，能夠減少強勢粒與弱勢粒結實率的差距。此外，他指出內源性吲哚乙酸在雜交稻籽粒灌漿過程中扮演著關鍵角色。黃升謀［23］的研究也表明吲哚乙酸的含量與干物質的積累存在正比關系，它能夠推動營養(yǎng)物質的運輸，并調節(jié)同化物在籽粒中的積累，從而提升庫的活性。本研究中，白屈菜紅堿可濕性粉劑處理水稻植株后，藥劑處理組吲哚乙酸含量是對照組的1倍多，推斷白屈菜紅堿對于水稻豐產可能有促進作用，關于產量調查的工作計劃后續(xù)開展。

4 結論

本研究篩選了白屈菜紅堿可濕性粉劑生物農藥配方，10%白屈菜紅堿原藥，分散劑Ultrazine NA 8%、TAMOL DN 16%和Atlox Metasperse 550S 8%，潤濕劑GEROPON SDS 8%，以及白炭黑HL-200 10%和無水葡萄糖 39.5%的填料，消泡劑Aguique Soap L 0.5%。水稻噴施該藥劑后，代謝物差異明顯，水楊酸含量為643.71 ng·g-1，是對照組的2.8倍；赤霉素A3含量為3.10 ng·g-1， 是對照組CK含量（1.15 ng·g-1）的2.7倍；哚乙酸含量為801.34 ng·g-1，是對照組（CK）中含量（767.83 ng·g-1）的1倍多。能夠促進盆栽水稻分泌水楊酸、赤霉素及吲哚乙酸，推斷白屈菜紅堿可濕性粉劑增強了水稻的抗病性，為植物病害的綠色防治提供理論依據。

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Research and Development of Chelerythrine Wettable Powder and Effect on Rice Hormone

WEI Qinghui， SONG Weifeng， SHI Zhenghao， LI Zhiyong， PAN Yaqing

（Institute of Plant Protection，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086，China）

Abstract：

Chelerythrine is one of the most abundant alkaloids in the traditional Chinese medicinal herb Chelidonium majus L.. This research developed green biological pesticides as the original drug， and explored the mechanism of affecting the secretion of rice hormones. The result is of great significance for agricultural production and ecological protection. The flow point method was used to determine the dispersion of wettable powder， screening the amount of each auxiliary agent， and finally the best formula of wettable powder was used as 10%， Ultrazine NA 8%， TAMOL DN 16% and Atlox Metasperse 550S 8% as dispersant， GEROPON SDS 8% as wetting agent， White Carbon Black HL-200 10% and Anhydrous Glucose 39.5% as filler， and Aguique Soap L 0.5% as defoaming agent. Application of targeted metabolomics technology to explore the influence of chelerythrine on rice hormone secretion， chelerythrine can be wet powder processing rice， metabolite differences， salicylic acid content in the treatment group was nearly 3 times of the control group， but also promoted rice secretion gibhand and acetic acid， infer chelerythrine base can be wet powder to enhance the disease resistance of rice.

Keywords：chelerythrine; wettable powder formulation; rice 1 smut; plant hormone