GC-MS法檢測嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸

林　曼,陳歷俊,董學艷,閔偉紅,姜鐵民,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品學院,吉林長春 130000；2.北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163)

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GC-MS法檢測嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸

林曼1,陳歷俊2,董學艷2,閔偉紅1,姜鐵民2,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品學院,吉林長春 130000；2.北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163)

研究建立一種高效、準確測定嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸含量的方法。采用國際標準化委員會(ISO)14156的方法提取脂肪,利用豬胰脂酶專一水解甘油三酯Sn-1,3位脂肪酸,通過氨基固相萃取柱法分離水解產(chǎn)物中單甘油酯,甲酯化后用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測Sn-2位棕櫚酸。結(jié)果表明用氨基固相萃取柱法取代傳統(tǒng)薄層層析法分離單甘油酯不僅操作簡單,分離效果好,而且回收率高,測定結(jié)果準確,GC-MS法檢測3種嬰兒配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的含量分別為40.5%、40.3%和40.8%,添加回收率范圍為91.7%～98.5%,RSD為1.56%,重現(xiàn)性良好,完全適用于嬰兒配方奶粉甘油三酯Sn-2位棕櫚酸含量的檢測。

嬰兒配方奶粉,Sn-2位棕櫚酸,氨基固相萃取柱(SPE),氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)

母乳是足月新生兒最理想、最安全的食物,是嬰兒配方乳粉的黃金標準[1-2]。母乳中含有3%～5%的脂肪,其中甘油三酯占98%以上,它們?yōu)閶雰禾峁?0%～60%的能量和必需脂肪酸[3]。母乳脂肪具有特殊的組成和結(jié)構(gòu),其中含量最高的飽和脂肪酸是棕櫚酸,是人體最重要的產(chǎn)能脂肪酸,占母乳脂肪的20%～25%,其中70%以上棕櫚酸分布在Sn-2位上[4-6]。WHO提倡在嬰兒出生后至少6個月內(nèi)進行母乳喂養(yǎng),以滿足嬰兒生長發(fā)育的需要,提高免疫力,降低感染傳染性疾病機率,但是受客觀因素影響,部分母親選擇奶粉喂養(yǎng)。國際一些大型嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)相繼推出含母乳脂肪類似物的產(chǎn)品,如荷蘭紐迪西亞乳制品公司的Nutrilon Omneo奶粉,產(chǎn)品標示富含高Sn-2位棕櫚酸油脂,能夠有效防止嬰兒便秘腹瀉,有利于鈣質(zhì)吸收。Loders Croklaan(Univer)公司取得生產(chǎn)人乳脂替代品的專利,產(chǎn)品為BetapolTM,現(xiàn)在正進行商業(yè)化生產(chǎn)。

2010年,中華人民共和國衛(wèi)生部第一號公告明確了1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(1,3-Dioleoyl-2-palmitoyl triglyceride,C52:2,簡稱OPO)擴大使用范圍及使用量,旨在模仿母乳構(gòu)成和脂肪結(jié)構(gòu)的特性,提高Sn-2位棕櫚酸相對含量。因此,亟待建立嬰兒配方奶粉Sn-2位棕櫚酸含量的檢測方法[7-8]。目前,用薄層層析法分離脂肪水解產(chǎn)物,衍生后利用氣相色譜進行分析,是最常見的Sn-2位脂肪酸檢測方法[4,9-10],此方法不僅操作復(fù)雜,耗時耗力,而且檢測結(jié)果受硅膠層析板質(zhì)量、展開劑組成、顯色方法影響很大。本文采用氨基固相萃取柱法替代薄層層析法分離甘油單酯,快速衍生后用GC-MS法檢測Sn-2位棕櫚酸的含量,以建立方便、準確測定嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸含量的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

3種不同品牌的嬰兒配方奶粉購于大型超市;豬胰酯酶(30～90 units/mg)Sigma公司;氨基固相萃取柱(500 mg/6 mL)Agela公司;薄層層析硅膠板(100 mm×200 mm,厚度0.20～0.25 mm)青島海洋化工有限公司;37種脂肪酸甲酯標準品(≥99%,10 mg/mL)、棕櫚酸甘油三酯(≥98%,1 g)Aladdin公司;去離子水;其他試劑為色譜純。

GC-MS系統(tǒng)TRACE1300-ISQ-LT系統(tǒng);超聲清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠;渦旋振蕩器SCILOGEX公司;高速冷凍離心機:Sigma公司;氮吹儀天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1脂肪提取方法采用ISO14156(IDF172)規(guī)定的方法提取嬰兒配方奶粉脂肪[11]。

1.2.2豬胰酯酶水解脂肪向提取的脂肪中加入2 mL 0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.8)、0.5 mL 0.05%(m/v)膽酸鈉溶液、0.2 mL 2.2%(m/v)CaCl2溶液,充分混勻后加入20 mg豬胰脂酶,渦旋振蕩1 min后,在40 ℃的振蕩水浴鍋中反應(yīng)2 min,恒溫環(huán)境下劇烈振蕩2 min,分兩次加入10 mL無水乙醚,4000 r/min離心5 min,合并醚層,氮吹至恒重,正己烷復(fù)容。

1.2.3 Sn-2位單甘油酯的制取氨基固相萃取柱分離法:取氨基固相萃取柱(500 mg,6 mL),分兩次加入4 mL正己烷,活化萃取柱。加入脂肪酸溶液,棄去流出液;分4次加入8 mL正己烷-乙酸乙酯淋洗液(v/v=85∶15),棄去淋洗液;分4次加入8 mL二氯甲烷-甲醇洗脫液(v/v=2∶1),收集洗脫液,氮氣吹干。

薄層層析分離法[11]:玻璃點樣毛細管將脂肪溶液點在距離薄層板底邊15 mm處,點樣后干燥5 min,展開劑為正己烷∶乙醚∶甲酸=70∶30∶1(v∶v∶v),層析結(jié)束后將層析板放入到碘蒸氣中顯色,用微型刮鏟刮下單甘油酯譜帶(Rf值約0.035),加入10 mL乙醚分兩次提取脂肪,離心后取出有機層,氮氣吹干。

1.2.4脂肪酸甲酯化方法一[12]:加入5 mL甲苯,6 mL乙酰氯-甲醇溶液,75 ℃水浴振蕩2.5 h。冷卻至室溫,將反應(yīng)液移至50 mL離心管中,用6.0 mL碳酸鈉溶液分2次清洗頂空瓶,合并清洗于離心管中,4000 r/min離心5 min,吸取1 mL上次清液于進樣瓶,檢測前于-20 ℃下保存。

方法二[13]:加入5.0 mL 0.5 N的鹽酸-甲醇溶液,2 mL正己烷,2 mL甲醇,在80 ℃下水浴2 h,冷卻后加入2 mL去離子水,4000 r/min離心5 min,取1.0 mL上層清液于進樣瓶,檢測前于-20 ℃下保存。

方法三:加入4.0 mL 1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液,劇烈振蕩4 min,加入1 mL去離子水和2 mL正己烷,充分混勻后于4000 r/min離心5 min,取1.0 mL上層清液于進樣瓶中,檢測前于-20 ℃下保存。

1.2.5GC參數(shù)色譜柱:HP-88氣相色譜柱(100 m×0.250 mm,0.20 μm);進樣口溫度:200 ℃;恒流速模式:1 mL/min;進樣量:1 μL;分流比:10∶1;載氣:N2;柱溫箱升溫程序如表:

表1　柱溫箱升溫程序

1.2.6 MS參數(shù)電子轟擊離子源:EI;離子源溫度:280 ℃;四級桿溫度:150 ℃;質(zhì)譜接口溫度:240 ℃;四級桿質(zhì)量掃描范圍:35～400 amu。采用面積歸一法對脂肪酸定量。

1.2.7數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)取平行實驗的平均值,采用SPSS,EXCEL軟件進行方差分析。

2　結(jié)果與討論

2.1單甘油脂分離方法確定

以同一次提取的2號奶粉脂肪為實驗原料,加入棕櫚酸三甘酯標準品溶液,對比研究了氨基固相萃取柱分離法和薄層層析法對單甘油酯的分離效果。結(jié)果如表2,經(jīng)過氨基固相萃取柱法分離的單甘油酯衍生后進行GC-MS分析算得回收率為91.7%～98.5%,RSD值為1.56%,經(jīng)過薄層層析法分離的單甘油酯衍生后進行GC-MS分析得回收率為81.2%～86.7%,RSD值為3.62%。韓瑞麗等[14]利用HPLC-ELSD法分離脂肪水解產(chǎn)物中單甘油酯,衍生后進行GC-MS分析回收率為83.3%～85.1%。表明氨基固相萃取柱法不僅操作簡便,而且準確度更高。

表2　SPE法和TLC法數(shù)據(jù)對比

表4　回收率及精密度實驗(n=5)

2.2甲酯化方法確定

分別采用乙酰氯法、鹽酸-甲醇法及酯交換法對Sn-2位棕櫚酸進行甲酯化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種方法都能將Sn-2位棕櫚酸甲酯化,如表3所示棕櫚酸峰面積和峰高基本一致,說明棕櫚酸的酯化程度相同。但是乙酰氯-甲醇溶液配制時具有一定危險性,反應(yīng)過程中易發(fā)生試管炸裂。鹽酸-甲醇法反應(yīng)時間長達2 h,反應(yīng)溫度高達80 ℃,容易引起多不飽和脂肪酸裂解。而酯交換法不僅反應(yīng)條件溫和,在常溫下完成酯化反應(yīng),而且操作簡單,反應(yīng)時間最短,僅為4 min,有利于下一步的分析。因此,選擇酯交換法作為Sn-2位棕櫚酸甲酯化方法。

表3　三種甲酯化方法比較(n=3)

2.3色譜條件選擇

在優(yōu)化的色譜條件下進行色譜分析,圖1為樣品脂肪酸衍生后的色譜圖,可見采用HP-88氣相色譜柱分析甘油三酯中脂肪酸組分,可以將所有脂肪酸色譜峰完全分離開,分流比為10∶1時,脂肪酸峰型良好,無拖尾峰,基線平穩(wěn),棕櫚酸響應(yīng)值高。采用面積歸一化法對標準溶液濃度作圖,建立標準曲線。確定棕櫚酸的保留時間為29.84 min,回歸方程為y=3.39643×106+6.52896×106X,R2=0.9994,線性關(guān)系良好。

圖1　GC-MS法檢測樣品色譜圖Fig.1　GC-MS Chromatogram of sample

2.4GC-MS法回收率與精密度實驗

以同一次提取的奶粉脂肪為實驗原料,加入3個不同水平的棕櫚酸三甘酯標準品溶液,水解后經(jīng)過氨基固相萃取柱分離單甘油酯,衍生后用GC-MS分析,每個實驗做5個平行,結(jié)果如表4所示,添加標準品的回收率范圍為91.7%～98.5%,準確性高。

2.5重現(xiàn)性實驗

將3個不同品牌嬰兒配方乳粉送到中國檢驗檢疫科學研究院綜合檢測中心檢測Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸百分含量,對比本實驗利用氨基固相萃取柱法制備單甘油酯,GC-MS法檢測Sn-2位棕櫚酸相對含量,結(jié)果如表5,中國檢科院與氨基固相萃取柱法分離單甘油酯三種方法檢測結(jié)果基本一致,方法的重現(xiàn)性良好,說明本實驗方法準確、可靠。

表5　Sn-2位棕櫚酸占總棕櫚酸的百分含量(%)

3　結(jié)論

本文建立了一種用氨基固相萃取柱分離水解產(chǎn)物中單甘油酯,酯交換法衍生后,用GC-MS法分析嬰兒配方奶粉甘油三酯中Sn-2位棕櫚酸的檢測方法。該方法用氨基固相萃取柱法取代薄層層析法制備純化單甘油酯,大大縮短樣品的前處理時間,操作簡單、準確度高。選擇酯交換法衍生Sn-2位棕櫚酸,不僅酯化程度高,而且反應(yīng)條件溫和,GC-MS法檢測脂肪酸精密度高,重現(xiàn)性良好,完全適用于嬰兒配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸的檢測。本實驗對于嬰幼兒配方奶粉中Sn-2位棕櫚酸的測定,為今后更深入研究結(jié)構(gòu)脂肪在配方乳粉中的應(yīng)用,研發(fā)更母乳化的母乳替代品提供參考。

[1]李靜,鄧澤元.不同母乳營養(yǎng)成分的比較[J].中國乳品工業(yè),2005,33(8):45-47.

[2]López-López A,López-Sabater M C,Campoy-Folgoso C,et al. Fatty acid and sn-2 fatty acid composition in human milk from Granada(Spain)and in infant formulas[J]. European Journal of Clinical Nutrition,2002,56(12):1242-1254.

[3]何川. 人乳脂的脂肪酸分布及人工構(gòu)造方法[J]. 食品科技,2001(5):11-14.

[4]覃小麗,楊博,王永華. 人初乳脂肪酸組成及sn-2位脂肪酸分布的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2010,31(5):81-85.

[5]商允鵬,生慶海,王貞瑜,等. 三酰甘油Sn-2位上棕櫚酸生理功能及研究概況[J]. 中國糧油學報,2010,25(10):119-124.

[6]Jiménez MJ,Esteban L,Robles A,et al. Production of triacylglycerols rich in palmitic acid at sn-2 position by lipase-catalyzed acidolysis[J]. Biochemical Engineering Journal,2010,51(3):172-179.

[7]劉臻,河光華,俞曉軍,等. 母乳脂肪特點與結(jié)構(gòu)脂肪的研究應(yīng)用(四)[N]. 中國食品學報,北京:2010-04-20.

[8]戴智勇,張巖春,劉躍輝,等. 嬰幼兒配方乳粉中蛋白質(zhì),脂肪及碳水化合物的調(diào)整[J]. 中國乳業(yè),2011(4):58-61.

[9]袁曉武,鄧澤元,李靜等.胰脂酶法測定食用油甘油三酯中脂肪酸的位置分布[J].食品科學,2009,29(11):544-547.

[10]劉亞東,宋秋,支瀟,等.馬奶和成熟母乳甘油三酯中脂肪酸組成及分布[J].食品工業(yè)科技,2012,33(3):171-174.

[11]International Organization for Standardization(ISO).14156 Milk and milk products-Extraction methods for lipids and liposoluble[S].Switzerland,2001-12-01.

[12]彭飛進,楊衛(wèi)花.GC-MS法測定嬰幼兒配方奶粉中DHA和亞油酸含量[J].食品科學,2011(14):261-263.

[13]李憲璀,范曉,韓麗君,等.中國黃、渤海常見大型海藻的脂肪酸組成[J].海洋與湖沼,2002,33(2):215-224.

[14]韓瑞麗,馬健,張佳程,等. HPLC-ELSD與GC-MS法測定牛乳甘油三酯sn-2位脂肪酸組成[J]. 分析測試技術(shù)與儀器,2009(3)：30-33.

Determination of palmitic acid in the Sn-2 position in infant formulas by GC-MS

LIN Man1,CHEN Li-jun2,DONG Xue-yan2,MIN Wei-hong1,JIANG Tie-min2,*

(1.School of Fermentation Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130000,China;2.National maternal and infant health dairy researching center of Beijing Sanyuan Foods Co. Ltd.,Beijing,100163,China)

To establish a highly efficient and accurate determination of Sn-2 palmitic acid in triglycerides of infant formulas. Lipids of milk powder were extracted by the method of ISO14156. The Sn-1,3 fatty acids in the triglycerides were specially hydrolyzed by pancreatic lipase. The 2-monoglyceride was separated and prepared by solid phase extraction(SPE),and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS). Results showed that the content of palmitic acid esterified at the Sn-2 position was 40.5%,40.3%,40.8%. The average spike recoveries for palmitic acid were 91.7%～98.5%,and the relative standard deviation was 1.56%. The developed method was proved to be simple,precise,accurate and reliable,thereby being suitable for the determination of Sn-2 palmitic acid in infant formulas.

infant formulas;Sn-2 palmitic acid;solid phase extraction(SPE);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

2015-12-14

林曼(1990-)，女，碩士，研究方向：乳制品檢測，E-mail：15210766546@sina.cn。

姜鐵民(1971-)，碩士，教授級高工，研究方向：乳品生物技術(shù)，E-mail：jiang515910@126.com。

十二五國家科技支撐計劃(2013BAD18B04)；北京市科技計劃(D141100004814001)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)11-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.049