5′- 核苷酸酶與慢性乙肝患者肝損傷的關(guān)系

陽(yáng)建華，王芬，張文崇

（1.上栗縣中醫(yī)院，江西 上栗 337000；2.奉新縣中醫(yī)院，江西 奉新 330700）

慢性乙肝是指乙肝病毒（HBV）持續(xù)感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病，世界上感染過(guò)乙肝的人數(shù)超過(guò)20 億，該病早已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。 盡管我國(guó)實(shí)施的乙肝防治策略有效的降低了HBV 感染率，但由于人口基數(shù)大，仍面臨巨大的疾病防控壓力[2]。 肝臟解剖位置及生理功能特殊，易受多種因素影響導(dǎo)致肝損傷，而慢性乙肝患者肝損傷越嚴(yán)重，其生存質(zhì)量越低[3,4]。循證醫(yī)學(xué)證明，早期篩檢、不斷診斷檢測(cè)、后續(xù)追蹤治療等方法可有效控制慢性乙肝病情發(fā)展，甚至可逆轉(zhuǎn)肝硬化進(jìn)程[5]。 肝穿刺活檢是目前評(píng)估慢性乙肝肝損傷的金標(biāo)準(zhǔn)，有創(chuàng)的穿刺活檢可能導(dǎo)致大出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，患者常常難以接受[6]；目前常用血清學(xué)指標(biāo)敏感性和特異性仍存在不足[7]。 因此，尋找可以反應(yīng)組織學(xué)形態(tài)的變化，并且具備一定靈敏度及特異性的指標(biāo)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。 研究表明，肝病患者血清中可檢測(cè)到5’-核苷酸酶（5’-NT）活性明顯增高，但其應(yīng)用于肝損傷的報(bào)道仍然較少[8]。 本研究檢測(cè)并分析了慢性乙肝患者血清5’-NT 水平對(duì)肝損傷的預(yù)測(cè)效果，以期找到慢性乙肝肝損傷潛在預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 一般資料 選擇2020年4月至2021年6月我院收治的慢性乙肝患者300 例進(jìn)行研究，其中男性184 例，女性116 例，平均年齡41.02±11.31歲，根據(jù)相關(guān)癥狀及生物化學(xué)檢查結(jié)果，將其分為輕度損傷組104 例、 中度損傷組139 例及重度損傷組57 例；對(duì)照組為同期治療的非活動(dòng)性乙肝表面抗原（HBsAg）攜帶者/慢性乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者80 例，其中男性48 例，女性32 例，平均年齡39.63±10.56歲。 納入研究的慢性乙肝患者和對(duì)照組的性別、年齡等一般資料具有可比性（P＞0.05），所有病例均經(jīng)充分知情并簽署知情同意書(shū)，研究通過(guò)我院倫理委員會(huì)審批。

1.1.2 入選和排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：⑴根據(jù)《慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)（2015年版）》[9]進(jìn)行診斷，①輕度損傷：ALT≤3×ULN（正常上限升高倍數(shù)），膽紅素（BIL）17.1～34.2 mol/L，白蛋白（ALB）≥35 g/L，凝血酶原活動(dòng)度（PTA） 79～71（%）；②中度損傷：ALT 3～10×ULN，BIL 34.2～85.5 mol/L，ALB 33～34 g/L，PTA 61～70（%）；③重度損傷：ALT＞10×ULN，BIL＞85.5 mol/L，ALB≤32 g/L，PTA 40～60（%）；中、重度損傷認(rèn)為具有顯著肝損傷。 ⑵既往未接受抗乙肝病毒治療； ⑶此次發(fā)病就診前未接受護(hù)肝降酶等治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴乙肝病毒感染病史不明確者；⑵出現(xiàn)腹膜炎等嚴(yán)重感染的并發(fā)癥患者； ⑶合并HIV、寄生蟲(chóng)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒及其他嗜肝病毒等感染者；⑷合并藥物性肝炎、 酒精性肝病、 自身免疫性肝炎、肝臟腫瘤等肝臟疾病患者；⑸合并妊娠、甲狀腺功能亢進(jìn)、精神性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、心腎功能不全、自身免疫性疾病等其他系統(tǒng)疾??；⑹近1年內(nèi)曾接受或正在接受免疫調(diào)節(jié)藥物治療，或存在其他原因引起免疫系統(tǒng)功能異常者。

1.2 血清指標(biāo)檢測(cè) 所有病例于就診治療初采集清晨空腹新鮮外周血送檢，采用AU480 全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司） 檢測(cè)ALT、AST 等肝功能指標(biāo)；同時(shí)抽取外周血4 ml 于含分離膠促凝管，3000 r/min 離心10 min 后，分別取上層血清4 份，每份200 μl，置于Eppendof 管中，-80℃條件下存放，待檢。 采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)定HBV DNA，設(shè)備為Veriti7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI Thermo 賽默飛世爾）；采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)所有患者血清5’-NT。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，多組采用單因素方差分析進(jìn)行比較，兩組則采用t 檢驗(yàn)比較；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以n（%）標(biāo)示，應(yīng)用卡方（χ2）檢驗(yàn)進(jìn)行分析。采用Pearson 相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析；通過(guò)單因素及多因素Logistic 回歸考察肝損傷的影響因素； 繪制ROC 曲線確定5'-NT 的對(duì)肝損傷的診斷效能。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝損傷影響因素分析 將所有慢性乙肝患者分為顯著肝損傷和輕度肝損傷并進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平存在差異（P＜0.05），而不同肝損傷患者的性別和年齡無(wú)明顯差異（P＞0.05）。 見(jiàn)表1。

表1 不同肝損傷影響因素分析

2.2 各組病例ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平比較 單因素方差分析可知，不同肝損傷病例的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平具有顯著差異（P＜0.05），發(fā)生肝損傷的病例的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平均顯著高于對(duì)照組病例（P＜0.05），且隨損傷程度加深，各指標(biāo)水平呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。 見(jiàn)表2。

表2 不同肝損傷病例ALT、AST、HBV DNA 及5′- NT 水平比較

2.3 5'-NT 與ALT、AST 及HBV DNA的相關(guān)性Pearson 相關(guān)顯示，5'-NT與慢性乙肝ALT（r=0.506，P＜0.001）及AST（r=0.524，P＜0.001）呈顯著正相關(guān)，而與HBV DNA 無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 5′- NT 與ALT、AST 及HBV DNA 的相關(guān)性

2.4 多因素Logistic 回歸分析 以不同肝損傷情況為因變量（顯著肝損傷=1，輕度肝損傷=0），自變量為單因素分析中具有顯著影響的因素，其賦值分別為：ALT （＞3×ULN=1，≤3×ULN=0）、AST （＞3×ULN=1，≤3×ULN=0）、HBV DNA （＞5.3 lg copies/ml=1，≤5.3 lg copies/ml=0）及5'-NT（＞12.20 U/L=1，≤12.20 U/L=0） 進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果ALT （OR=3.813，95%CI 1.281-11.350）、AST（OR =4.512，95% CI 1.540 ～13.220）、HBV DNA（OR=3.624，95%CI 1.215～10.808）及5'-NT（OR =3.936，95%CI 1.341～11.554） 是影響顯著肝損傷發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 見(jiàn)表4。

表4 多因素Logistic 回歸分析

2.5 各參數(shù)對(duì)肝損傷的診斷效能 以發(fā)生顯著肝損傷賦值為1，輕度肝損傷則賦值0，繪制各參數(shù)預(yù)測(cè)肝損傷的ROC 曲線，結(jié)果顯示5'-NT 的ROC曲線下面積為0.876，約登指數(shù)為0.65，其敏感度和特異性均達(dá)到80%以上，對(duì)肝損傷具有最高的診斷效能。 見(jiàn)圖1 和表5。

圖1 各參數(shù)對(duì)肝損傷的診斷效能的ROC 曲線

表5 各參數(shù)對(duì)肝損傷的診斷效能表5 各參數(shù)對(duì)肝損傷的診斷效能

3 討論

肝損傷常見(jiàn)類(lèi)型有藥物性、 酒精性及免疫性肝損傷，其中免疫性肝損傷表現(xiàn)為機(jī)體開(kāi)始排斥自身肝組織，一旦肝組織出現(xiàn)炎癥性損傷時(shí)，會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的抗體在血清中出現(xiàn)；目前，對(duì)于免疫性肝損傷病因尚不清楚，但有很多患者可以迅速發(fā)展為肝硬化和肝衰竭[10]。 HBV 引起的肝損傷屬于免疫性肝損傷；HBV 是一種非細(xì)胞毒性病毒，并不直接引起肝損傷，而是由于感染HBV 后引起人體細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答造成的，是由機(jī)體針對(duì)HBV 特異性抗原的免疫反應(yīng)所引起，因此，機(jī)體的免疫狀態(tài)變化會(huì)使得HBV 感染所致的臨床結(jié)果發(fā)生變化[11]。 故慢性乙肝難以從單獨(dú)的臨床表現(xiàn)確診，需綜合病史、特定的實(shí)驗(yàn)室檢查及組織學(xué)觀察予以診斷。 因此，篩查出與慢性乙肝發(fā)生肝損傷相關(guān)的生物標(biāo)志物具有極大的臨床意義。

5’-NT 是一種分布于肝臟的膽小管、 竇狀隙以及各種組織細(xì)胞膜內(nèi)的特異性磷酸酶，可通過(guò)炎癥抑制、A2A 受體調(diào)控、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞等多種途徑參與機(jī)體免疫，免疫抑制活性廣泛；5’-NT 在肝細(xì)胞受損或肝內(nèi)外受阻時(shí)才能釋放入血，而其他細(xì)胞組織不會(huì)釋放5’-NT，且其他合并系統(tǒng)臟器疾病并不能影響血中5’-NT 的濃度，故血清5’-NT 對(duì)于肝臟疾病具有重要的診斷價(jià)值[12,13]。劉少平等[14]研究表明，5’-NT 在肝癌組織中水平高于良性肝病患者，二者均較健康人高；鄧霽紅等[15]研究發(fā)現(xiàn)，乙肝患者的血清5’-NT 水平顯著高于健康人群，且隨著HBV-DNA 載量增加，5’-NT 水平有所增加，但其研究中并未發(fā)現(xiàn)血清5’-NT 和HBVDNA 間的明顯關(guān)系。 而本研究不同程度肝損傷病例的5'-NT 水平差異顯著，發(fā)生肝損傷的病例的5'-NT 水平均顯著高于對(duì)照組病例（P＜0.05），且隨損傷程度加深，5'-NT 水平呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，提示不同程度的慢性乙肝導(dǎo)致的肝損傷引起血清5'-NT水平發(fā)生了明顯變化，這也再次證明血清5'-NT可能是慢性乙肝肝損傷的診斷標(biāo)志物。

ALT 和AST 是臨床上應(yīng)用最廣泛的肝損傷生化指標(biāo)，當(dāng)致病因子導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生變形，細(xì)胞膜通透性進(jìn)而改變則會(huì)引起ALT 的升高，而AST 上升會(huì)晚于ALT，一般需肝損傷波及到線粒體時(shí)才會(huì)出現(xiàn)[10]。 HBV DNA 是HBV 感染的特異性指標(biāo)，其水平高低可用于直接評(píng)估HBV 復(fù)制程度[16]。HBV 病毒的反復(fù)入侵導(dǎo)致免疫清除/激活長(zhǎng)期持續(xù)出現(xiàn)，進(jìn)而誘發(fā)肝硬化，而血清HBV DNA 水平可預(yù)測(cè)HBV 慢性感染者的肝硬化發(fā)病率，肝硬化的發(fā)病率以劑量依賴(lài)方式，隨HBV DNA 水平的增加而升高[17,18]。 Pearson 相關(guān)顯示，5'-NT 與慢性乙肝ALT （r=0.506，P＜0.001） 及AST （r=0.524，P＜0.001）呈顯著正相關(guān)，而與HBV DNA 無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05）。說(shuō)明5'-NT 與肝功能有良好的的相關(guān)性，可能是反映肝臟炎癥及其他損傷程度，但并未證明HBV-DNA 與肝功能間明顯聯(lián)系，故5'-NT與HBV 復(fù)制能力無(wú)明顯關(guān)系，具體仍有待進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

研究還發(fā)現(xiàn)，顯著肝損傷患者的ALT、AST、HBV DNA 及5'-NT 水平顯著高于輕度肝損傷患者（P＜0.05）； 多因素Logistic 回歸結(jié)果可知ALT（OR =3.813，95% CI 1.281 -11.350）、AST （OR =4.512，95% CI 1.540 -13.220）、HBV DNA （OR =3.624，95% CI 1.215 -10.808） 及5' -NT （OR =3.936，95%CI 1.341-11.554） 是導(dǎo)致慢性乙肝患者出現(xiàn)顯著肝損傷的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 由此可知，5'-NT 可用于慢性乙肝肝損傷的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。 為確定其診斷效能，以血清5'-NT 水平12.20 U/L 作為預(yù)測(cè)的臨界值繪制ROC 曲線，結(jié)果5'-NT 的曲線下面積為0.876，敏感度和特異性均超過(guò)80%，與ALT、AST 及HBV DNA 相比具有最大的約登指數(shù)，說(shuō)明5'-NT 對(duì)于慢性乙肝肝損傷表現(xiàn)出較高的診斷效能。 但慢性乙肝影響因素眾多，常需結(jié)合多種指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)估，有報(bào)道5'-NT 聯(lián)合其他多項(xiàng)指標(biāo)可提高肝癌的陽(yáng)性診斷率[19]，故5'-NT 在實(shí)際應(yīng)用時(shí)亦可借鑒參考。

綜上，血清5'-NT 水平升高可能提示慢性乙肝患者肝損傷加重，可作為預(yù)測(cè)慢性乙肝肝損傷的新型生物標(biāo)志物。