酸菜中一株產(chǎn)氣芽孢桿菌的分離鑒定及耐受性研究

摘要：文章以酸菜為原料，對其中一株產(chǎn)氣芽孢桿菌進行分離鑒定和產(chǎn)氣驗證，并構(gòu)建基因發(fā)育樹；再利用酸菜中可使用的防腐劑進行抑菌試驗和耐受性測試。序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建結(jié)果表明，酸菜中產(chǎn)氣芽孢桿菌為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。6種防腐劑抑菌試驗結(jié)果顯示，焦亞硫酸鈉的抑菌效果最佳，脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉次之，而Nisin（乳酸鏈球菌素）的抑菌效果最差。耐受性測試結(jié)果顯示，NaCl濃度低時抑制效果不明顯，當NaCl濃度高于14 g/100 g時菌株幾乎不再生長；菌株在低酸性環(huán)境下生長良好，而在高酸性環(huán)境下生長受到抑制，幾乎不生長；菌株在95 ℃下處理30 min還能繼續(xù)生長，說明該菌株具有耐熱性。該研究可為酸菜的生產(chǎn)加工提供一定的參考依據(jù)和理論指導(dǎo)，對酸菜制品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；分離鑒定；耐受性；抑菌效果

中圖分類號：TS255.54文獻標志碼：A文章編號：1000-9973（2025）03-0120-05

Isolation， Identification and Tolerance of a Strain of Aerogenic

Bacillus in Sauerkraut

LIU Li^1，2， JIN Huai-kang^1，2， KONG Lei^1，2， WEI Jin-huan^1，2， YANG Can^1，2， GAO Hui-fang^1，2

（1.Honghe Hopen Food Co.， Ltd.， Honghe 651400， China; 2.Key Laboratory of

Fermented Vegetables in Yunnan Province， Honghe 651400， China）

Abstract： In this paper， with sauerkraut as the raw material， a strain of aerogenic Bacillus is isolated， identified and verified for gas production， and a gene phylogenetic tree is constructed. The preservatives that can be used in sauerkraut are used to conduct antibacterial test and tolerance test. The results of phylogenetic tree constructed by sequence analysis show that aerogenic Bacillus in sauerkraut is Bacillus velezensis. The antibacterial test results of six preservatives show that sodium metabisulfite has the best antibacterial effect， followed by sodium dehydroacetate and sodium benzoate， and Nisin has the worst antibacterial effect. The tolerance test results show that the inhibition effect is not obvious when the NaCl concentration is low， and the strain almost no longer grows when the NaCl concentration is higher than 14 g/100 g. The strain grows well in low acidic environment， while the growth is inhibited in high acidic environment and the strain almost does not grow. The strain treated at 95 ℃ for 30 min can continue to grow， indicating that the strain has heat resistance. This study can provide a certain reference basis and theoretical guidance for the production and processing of sauerkraut， and is of vital significance for the industrialization development of sauerkraut products.

Key words： Bacillus; isolation and identification; tolerance; antibacterial effect

收稿日期：2024-10-28

基金項目：云南省科技人才與平臺計劃項目（202205AG070001）;云南省生物種業(yè)和農(nóng)產(chǎn)品精深加工專項（202102AE090025，202202AE090017）;云南省基礎(chǔ)研究專項（202401AS070025）

作者簡介：劉力（1989—），男，工程師，碩士，研究方向：發(fā)酵蔬菜技術(shù)。

酸菜是以生鮮蔬菜為原料，經(jīng)自然或人工接菌發(fā)酵制成，是我國歷史悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵食品。但受氣候、風俗和飲食習慣的影響，以及選料和工藝的不同分為四川酸菜、江西腌菜和東北酸菜等^[1-2]。其營養(yǎng)豐富、風味獨特，還具有開胃健脾等功能^[3]。在酸菜生產(chǎn)中產(chǎn)生大量微生物^[4-5]，導(dǎo)致菌群組成復(fù)雜，易受外源性微生物污染，其中有害微生物產(chǎn)氣、產(chǎn)酸等情況難以控制，在貯藏期間可能出現(xiàn)脹袋、過酸化等問題，致使品質(zhì)下降，貨架期縮短，因此需添加防腐劑以提升產(chǎn)品的貨架期品質(zhì)^[6-7]。

防腐劑是指能抑制微生物生長繁殖、防止食品腐敗變質(zhì)的一類食品添加劑^[8-9]。實踐證明，采用防腐劑是延長食品貨架期最經(jīng)濟、最有效的辦法之一^[10-11]，其種類繁多，主要分為天然防腐劑^[12-13]、化學防腐劑^[14]、復(fù)合防腐劑^[15]等，而酸菜中常用焦亞硫酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀等作為防腐劑。曹秋閣等^[16]將山梨酸鉀等幾種防腐劑按一定比例混合，結(jié)果表明其可以抑制酸菜中的病原微生物生長，延長貨架期。姜紹通等^[17]研制出的復(fù)合防腐劑可使酸菜中致腐菌抑制率達到96%。古麗帕麗·買明等^[18]將山梨酸鉀與雙乙酸鈉復(fù)配，可以使巴哈利的保質(zhì)期顯著延長。李共國等^[19]在芥菜腌制過程中添加焦亞硫酸鈉、檸檬酸，使腌制芥菜的品質(zhì)有所提升。Plesoianu 等^[20]采用山梨酸對新鮮藍莓進行浸泡，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制微生物生長，延長保質(zhì)期。Homa等^[21]制備了負載山梨酸、BHA和BHT組合活性復(fù)合膜包裝甜甜圈，顯著延長了貨架期。胡春紅等^[22]利用山梨酸鉀與苯甲酸鈉復(fù)配，結(jié)果表明對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有較好的抑制效果。

目前大多數(shù)研究偏向于酸菜發(fā)酵過程中的品質(zhì)變化和影響因素等，而對脹包酸菜中產(chǎn)氣菌株篩選鑒定等相關(guān)研究較少。本文先對貨架期內(nèi)酸菜產(chǎn)品中產(chǎn)氣芽孢桿菌進行分離鑒定，分析不同耐受條件（NaCl濃度、pH、溫度）對芽孢桿菌生長周期OD600的影響，再利用酸菜中常用的6種防腐劑（EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）、焦亞硫酸鈉、脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀）對該菌株的抑制效果進行比較分析，旨在為酸菜的工業(yè)化生產(chǎn)加工提供一定的參考依據(jù)和理論指導(dǎo)，對酸菜及其系列產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

1材料與方法

1.1材料與試劑

貨架期內(nèi)脹氣酸菜樣品：由紅河宏斌食品有限公司提供。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖；NaCl（純度≥99%）、檸檬酸、EDTA、焦亞硫酸鈉、脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉、Nisin（乳酸鏈球菌素）、山梨酸鉀（均為食品級）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

LYZ-211C恒溫搖床上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；HWS-26型恒溫水浴鍋常州智博瑞儀器制造有限公司；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；HX3002Z型電子分析天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；X-6紫外可見分光光度計上海元儀儀器科技有限公司；游標卡尺（0～200 mm）得力集團有限公司；牛津杯（7.8 mm×6 mm×10 mm）上海三麝香實業(yè)有限公司；玻璃培養(yǎng)皿如皋市華宇玻璃制品廠。

1.3試驗方法

1.3.1產(chǎn)氣芽孢桿菌菌株分離及形態(tài)學鑒定

1.3.1.1分離純化

將分離出的菌株根據(jù)顯微形態(tài)選擇LB液體培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)，對富集后的菌液進行分離純化和顯微檢驗，并將獲得的優(yōu)勢菌株于甘油管中-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2形態(tài)學初步鑒定

將分離純化后的菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，在（30±1） ℃下倒置培養(yǎng)48 h，觀察記錄培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)，取典型單一菌落進行鏡檢，并于10×100倍油鏡下觀察菌體形態(tài)^[23]。根據(jù)菌株的生理生化結(jié)果，查閱《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，按照書中提到的鑒定方法分析篩選得到的菌株的生理生化特征。

1.3.1.3產(chǎn)氣驗證

將分離擴培的菌懸液接種于LB液體培養(yǎng)基中觀察；其中一組于121 ℃滅菌20 min作為對照組，另一組不做處理。將兩個處理組于（30±1）℃恒溫倒置培養(yǎng)48～72 h，觀察杜氏小管產(chǎn)氣情況。

1.3.2產(chǎn)氣芽孢桿菌16S rDNA分子生物學鑒定

將篩選出的目標產(chǎn)氣芽孢桿菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech （Shanghai） Co.， Ltd.）檢測，先使用Ezup柱式細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（B518255）提取基因組DNA，上、下游引物分別為27F（5′-AGAGTTTGATC-MTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGA-CTT-3′）。將獲得的菌株基因組DNA進行PCR（polymerase chain reaction）擴增，反應(yīng)體系：酶Mix（1×TSE102金牌）45 μL，正向引物2 μL（濃度10 mol/L），反向引物2 μL（濃度10 mol/L），DNA模板1 μL。擴增程序：98 ℃預(yù)變性2 min，運行35次，每次循環(huán)10 s，72 ℃延伸5 min。

1.3.3產(chǎn)氣芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將擴增后的菌株基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，參照Guo等^[24]的方法將PCR產(chǎn)物進行基因序列測定，將最終所得菌株的DNA序列信息輸入NCBI（National Center for Biotechnology Information（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫進行BlastN分析，以此確定分離菌株的種屬，構(gòu)建基因發(fā)育樹。

1.3.4產(chǎn)氣芽孢桿菌耐受性試驗

1.3.4.1耐鹽性試驗

將純化菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，于（30±1） ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h，得到活化純培養(yǎng)菌體，將單菌落接種于適宜的LB液體培養(yǎng)基中，于（30±1） ℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。根據(jù)吸光度值，使其菌懸液濃度為1×10⁷ ～5×10⁷ CFU/mL，得到菌株懸液（下同）。

耐鹽性能供試培養(yǎng)基：選擇適宜的LB液體培養(yǎng)基，不添加NaCl，初始培養(yǎng)基鹽分不得超過0.5%（以NaCl質(zhì)量分數(shù)計算）。

參考連鑫等^[25]的方法，將菌懸液接種于不同NaCl濃度的LB液體培養(yǎng)基中，于（30±1） ℃恒溫培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)過程中，每間隔4 h測定OD600，繪制生長曲線。

1.3.4.2耐酸性試驗

酸性培養(yǎng)基配制：取300 mL三角瓶，準確稱量LB液體培養(yǎng)基100 g，緩慢添加檸檬酸使其溶解，靜置5 min測定并調(diào)整pH，做好標記并封口，于121 ℃滅菌15 min，冷卻后備用。其余酸性培養(yǎng)基同法配制。

參考熊建等^[26]的方法，將菌株懸液接種于不同pH條件下的LB液體培養(yǎng)基中，置于搖床上，于（30±1） ℃恒溫培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)過程中，每4 h取樣測定OD600，繪制生長曲線。

1.3.4.3耐溫性測試

參考盧曉^[27]的方法，將菌懸液接種于LB液體培養(yǎng)基中（1 mL/管），將接種菌株的試管置于85～95 ℃下分別處理10，20，30 min后，恒溫培養(yǎng)72 h，測試其溫度耐受性。

1.3.5防腐劑對芽孢桿菌抑菌效能評估

參照國標GB/T 39101—2020《多肽抗菌性測定 抑菌圈法》^[28]中的抑菌圈法進行測定。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計結(jié)果；采用SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）和Duncan多水平檢驗各組間差異；結(jié)果表示為平均值±標準差，當P＜0.05時表示差異顯著，每組試驗重復(fù)3次。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)氣芽孢桿菌的分離鑒定

2.1.1菌株顯微形態(tài)學初步鑒定

本文從貨架期內(nèi)脹氣酸菜包中均勻取樣，經(jīng)過富集培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)觀察，從樣品中篩選得到菌株。經(jīng)平板涂布、劃線分離培養(yǎng)，共得到1株代表性的優(yōu)勢菌株，富集并培養(yǎng)形成菌液后進行分離純化和顯微檢驗，獲得的純培養(yǎng)微生物菌落形態(tài)見圖1中A，顯微鏡鏡檢結(jié)果見圖1中B，通過觀察對比，菌株單個或鏈狀排列，著色均勻，無莢膜，芽孢囊不明顯膨大，且菌落粗糙，不透明，不閃光，擴張，呈污白色或微帶黃色，與蔡高磊等^[29]的描述相似，說明該菌株為芽孢桿菌。

2.1.2菌株產(chǎn)氣試驗驗證

在酸菜的工業(yè)化生產(chǎn)中，常出現(xiàn)由微生物大量繁殖而引起的酸菜制品脹包等現(xiàn)象，給工廠造成巨大的經(jīng)濟損失。由于芽孢桿菌具有較強的耐受性，因此，對目標菌株進行產(chǎn)氣檢測試驗非常有必要。通過對菌株進行產(chǎn)氣試驗，觀察杜氏小管的產(chǎn)氣情況，結(jié)果見表1。

由表1可知，在試驗組試管中有氣泡產(chǎn)生，說明菌株具有產(chǎn)氣能力。綜上所述，可以推斷出從脹包酸菜中分離純化得到的菌株為產(chǎn)氣芽孢桿菌。

2.1.3芽孢桿菌生物學分子鑒定

將純化的產(chǎn)氣芽孢桿菌進行16S rDNA基因測序，菌株基因序列片段大小為1 381 bp，在NCBI上進行BlastN比對，結(jié)果顯示該鑒定菌株HPSC001與Bacillus velezensis（GeneBank No.：MK208528.1）有100%相似性，初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

2.1.4芽孢桿菌序列分析系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，用GeneBank登錄號下載序列，保存為Fasta格式，使用BioEdit分析軟件進行多序列對位排序，采用MEGA 7.0軟件中的N-J（Neighbor-Joining）算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖2。

由圖2可知，菌株HPSC001與Bacillus velezensis聚為一支，可信度為100%，因此可將菌株HPSC001鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

2.2產(chǎn)氣芽孢桿菌耐受性試驗分析

2.2.1不同NaCl濃度對芽孢桿菌生長周期OD600的影響

不同NaCl濃度對芽孢桿菌生長周期OD600的影響見圖3。由圖3可知，隨著含鹽量的增加，菌株的活性逐漸降低，生長繁殖受到抑制。鹽濃度低時抑制效果不明顯，鹽濃度高時幾乎不生長，與袁先鈴等^[30]在酸菜中篩選出的乳酸菌生長情況類似，都是在低濃度時生長較好，在高濃度條件下幾乎不生長。當NaCl濃度為6，8，10，12 g/100 g時，隨著鹽濃度升高，調(diào)整期也逐漸延長，說明高鹽環(huán)境對菌株的生長有較大的抑制作用，而當NaCl濃度≥14 g/100 g時，菌株幾乎不再生長，這可能是高滲透壓導(dǎo)致菌株停止生長或失水死亡，也可能是菌株對高鹽較敏感，抑制了菌株生長，而在實際生產(chǎn)中可根據(jù)需要，采用高鹽抑制此類微生物生長，保證產(chǎn)品質(zhì)量，延長貨架期。

2.2.2不同pH條件對芽孢桿菌生長周期OD600的影響

不同pH條件對菌株生長周期的影響見圖4。

由圖4可知，菌株在低酸性環(huán)境下生長良好，而在高酸性環(huán)境下生長受到抑制，幾乎不生長。在低酸性條件下，菌株生長調(diào)整期相對較短，影響較小。菌株在pH 4.5時的生長活性降低，與低酸性pH 5.5，6.5兩組相比，調(diào)整期有所延長，而當pH低于4.5時，菌株在強酸性環(huán)境下生長受到抑制，幾乎不再生長，因此說明菌株在高酸性環(huán)境下耐受性能較差，不適宜在高酸性環(huán)境下生長，生產(chǎn)中可以適量調(diào)整pH來抑制其生長，保證產(chǎn)品品質(zhì)。

2.2.3耐溫性測試分析

通過不同溫度對芽孢桿菌耐溫性能進行測試，結(jié)果見表2。

由表2可知，在處理時間為10，20，30 min的條件下，隨著處理溫度的升高和處理時間的延長，菌株對溫度的耐受性無太大差異，均能正常生長；綜上所述，說明該菌株的耐溫性較強，具有較強的抗逆性，一般的低溫殺菌工藝（≤95 ℃）不能將其殺死，如巴氏殺菌，因此對于有此類菌株生長的產(chǎn)品，不適宜使用低溫殺菌處理此類產(chǎn)品以達到延長貨架期的目的，必須采用高溫滅菌等其他手段。

2.36種防腐劑對芽孢桿菌抑菌效果的影響

將篩選出的產(chǎn)氣芽孢桿菌進行抑菌試驗，采用牛津杯法測定6種防腐劑的抗菌效價，結(jié)果見表3。

由表3可知，通過抑菌圈直徑與相關(guān)性方程計算可以看出每種防腐劑對菌株均有抑制作用，除山梨酸鉀和Nisin的抗菌效果較差外，其余結(jié)果均具有顯著性差異（P＜0.05），其中焦亞硫酸鈉的抗菌效價最高，為513.65 AU/mg，最低的是Nisin，為9.13 AU/mg，這可能與每種防腐劑的化學性質(zhì)和所處環(huán)境等因素有關(guān)，如脫氫乙酸鈉對霉菌、酵母菌等具有較好的抑制作用，而對其他微生物的抑制效果相對較差^[31]。田靜等^[32]研究表明，使用焦亞硫酸鈉溶液處理貯藏期葡萄，可使貨架期延長，微生物數(shù)量降低，當pH為4.0時貯藏效果最佳。本試驗中焦亞硫酸鈉的抑菌效果最好，為513.65 AU/mg，可能是菌株所處環(huán)境pH為4.0左右所致。山梨酸鉀類防腐劑對霉菌和酵母菌的抑制效果優(yōu)異^[33]，但其溶解后溶液呈酸性，抑菌活性受環(huán)境pH水平的影響較大，在酸性環(huán)境下抑菌效果更好，反之效果較差^[34]。Razavi等^[35]研究表明山梨酸在低pH時比高pH時對真菌的抑制效果更好，而在pH為7.0時抑菌效果較好，本試驗中可能是菌株所處的環(huán)境pH較高或較低，導(dǎo)致其抑菌效果較差，抗菌效價為9.30 AU/mg。對于Nisin，研究表明它在酸性pH水平下具有抗菌活性，但在中性或pH高于7.0時活性幾乎喪失^[36]。本試驗中可能是因為菌株所處環(huán)境pH水平較高，導(dǎo)致Nisin的抑菌效果在6種防腐劑中最差，抗菌效價僅為9.13 AU/mg。

3結(jié)論

本文對貨架期內(nèi)酸菜產(chǎn)品中的一株產(chǎn)氣芽孢桿菌進行分離鑒定，再利用酸菜中可使用的6種防腐劑（EDTA、焦亞硫酸鈉、脫氫乙酸鈉、苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀）對該菌株的抑菌效果和耐受性進行測試。通過對酸菜中一株產(chǎn)氣菌株進行富集培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)觀察、產(chǎn)氣測試，確定了該菌株為產(chǎn)氣芽孢桿菌，序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和分子鑒定結(jié)果顯示，該菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。利用6種防腐劑對其進行抑菌試驗，結(jié)果顯示焦亞硫酸鈉的抑菌效果最佳，而Nisin的抑菌效果最差。通過耐受性試驗得出，鹽濃度低時抑制效果不明顯，鹽濃度高于14 g/100 g時菌株幾乎不再生長；菌株在低酸性環(huán)境下生長良好，而在高酸性環(huán)境下生長受到抑制，且?guī)缀醪簧L；通過不同溫度對芽孢桿菌的耐溫性能進行測試，結(jié)果顯示該菌株在95 ℃下處理30 min還能繼續(xù)生長，說明該菌株具有一定的耐熱性。因此，在酸菜的工業(yè)化生產(chǎn)中可根據(jù)實際需要添加防腐劑、調(diào)整pH、適當提高鹽濃度等來防止這類產(chǎn)氣芽孢桿菌引起的酸菜產(chǎn)品產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象，延長貨架期，保證其品質(zhì)。本研究可為酸菜工業(yè)化生產(chǎn)提供參考，對酸菜產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

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