層粘連蛋白α3亞基（LAMA3）對胰腺癌上皮間質轉化、侵襲和轉移能力的影響

摘要：目的探索層粘連蛋白α3亞基（LAMA3）對胰腺癌（PC）上皮間質轉化（EMT）、侵襲和轉移能力的影響。方法綜合分析腫瘤和EMT相關數(shù)據(jù)庫，篩選出與PC相關的EMT基因LAMA3。通過qRT-PCR和Western Blot檢測LAMA3在PC組織和細胞系中的表達水平，免疫熒光確定LAMA3在PANC-1細胞中的定位，Transwell實驗評估LAMA3對PC細胞侵襲和遷移能力的影響。計量資料組間比較采用t檢驗。結果利用TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出3個EMT相關PC致癌因子LAMA3、AREG和SDC1。LASSO-Cox回歸模型顯示，LAMA3對PC預后影響最為顯著（風險評分=0.256 1×LAMA3+0.043 1×SDC1+0.071 4×AREG）。Cox回歸模型和列線圖顯示，LAMA3的高表達是PC不良預后的獨立危險因素（HR=1.32，95%CI：1.07～1.62，Plt;0.01）。實驗結果顯示，相對于正常胰腺組織，LAMA3在PC組織中的表達顯著上調。相對于HPDE細胞株，LAMA3在PC細胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2、SW1990中的表達均有不同程度的升高，其中在PANC-1細胞中的表達最高。富集分析表明，LAMA3與EMT、膠原代謝、細胞外基質降解、TGF-β通路和PI3K通路等生物過程和信號通路相關。敲低LAMA3后，N-Cadherin、Vimentin和Snail的表達水平下降，而E-Cadherin的表達水平上升。Transwell實驗結果顯示，LAMA3敲低后，PANC-1細胞的侵襲和遷移能力明顯減弱。結論LAMA3在PC中高表達，促進PC細胞EMT、侵襲和遷移，可能是PC的新型診斷標志物和基因治療靶點。

關鍵詞：胰腺腫瘤；層粘連蛋白；上皮-間質轉化；腫瘤浸潤；腫瘤轉移

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合基礎-ZK〔2024〕一般230）；貴州省衛(wèi)健委科學技術基金項目（gzwkj2024-373）

Effect of laminin subunitα3 on epithelial-mesenchymal transition，invasion，and metastasis abilities of pancreaticcancer

YANG Nenghong1，REN Likun2，TIAN She1，HAN Min1，LI Zhu1，ZHAO Yuxiang1，LIU Peng1

1.Department of Hepatobiliary Surgery，The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550000，China；2.Clinical School of Medicine，Guizhou Medical University，Guiyang 550000，China

Corresponding author：LIU Peng，liupeng5061@126.com（ORCID：0000-0003-0471-3836）

Abstract：Objective To investigate the effect of laminin subunitα3（LAMA3）on the epithelial-mesenchymal transition（EMT），invasion，and metastasis abilities of pancreatic cancer（PC）.Methods A comprehensive analysis was performed for tumor-and EMT-related databases to identify the EMT genes associated with PC，especially LAMA3.The methods of qRT-PCR and Western blot were used to measure the expression level of LAMA3 in PC tissue and cell lines；immunofluorescence assay was used to determine the localization of LAMA3 in PANC-1 cells；Transwell assay was used to investigate the effect of LAMA3 on the invasion and migration abilities of PC cells.The t-test was used for comparison of continuous data between groups.Results The analysis of the TCGA database identified 3 EMT-related oncogenes for PC，i.e.，LAMA3，AREG，and SDC1.The LASSO-Cox regression model showed that LAMA3 had the most significant impact on the prognosis of PC（risk score=0.256 1×LAMA3+0.043 1×SDC1+0.071 4×AREG）.The Cox model and nomogram showed that the high expression of LAMA3 was an independent risk factor for the poor prognosis of PC（hazard ratio=1.32，95%confidence interval：1.07—1.62，Plt;0.01）.Experimental results showed that there was a significant increase in the expression of LAMA3 in pancreatic cancer tissue compared with the normal pancreatic tissue.Compared with the HPDE cell line，there were varying degrees of increase in the expression of LAMA3 in pancreatic cancer AsPC-1，BxPC-3，PANC-1，MIA PaCa-2，and SW1990 cell lines，with the highest expression level in PANC-1 cells.The enrichment analysis showed that LAMA3 was associated with the biological processes and signaling pathways such as EMT，collagen metabolism，extracellular matrix degradation，the TGF-βpathway，and the PI3K pathway.After the knockdown of LAMA3，there were significant reductions in the expression levels of N-Cadherin，Vimentin，and Snail，while there was a significant increase in the expression level of E-Cadherin.Transwell assay showed that there were significant reductions in the invasion and migration abilities of PANC-1 cells after the knockdown of LAMA3.Conclusion LAMA3 is highly expressed in PC and can promote the EMT，invasion，and migration of PC cells，and therefore，LAMA3 may be used as a novel diagnostic marker and a new therapeutic target for PC.

Key words：Pancreatic Neoplasms；Laminin；Epithelial-Mesenchymal Transition；Neoplasm Invasiveness；Neoplasm Metastasis

Research funding：Guizhou Provincial Science and Technology Program（QKH-JC2024-ZK［2024］230）；Guizhou Provincial Health Commission Science and Technology Fund Project（gzwkj2024-373）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種具有高度侵襲性和致死率的惡性腫瘤，常在晚期才被診斷出來且治療難度大，患者生存率極低［1］。PC細胞的強侵襲性和高度轉移能力是治療失敗的主要原因之一。在PC擴散和轉移過程中，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）起著至關重要的作用［2］。EMT使上皮細胞轉變?yōu)殚g質細胞，使其脫離原有組織結構，獲得更強的運動和侵襲能力，從而顯著加速癌細胞的擴散與轉移［3］。

層粘連蛋白是一種由α、β和γ鏈組成的異三聚體蛋白［4］，廣泛存在于基底膜中，通過與細胞表面受體結合，在細胞外基質和細胞之間形成橋梁，幫助腫瘤細胞在體內擴散，在細胞黏附、遷移和信號傳導等過程中發(fā)揮重要作用。層粘連蛋白α3亞基（laminin subunit alpha 3，LAMA3）是層粘連蛋白-332復合物的一部分，在組織結構支架的形成以及多種細胞功能中起著重要作用［5］，其突變或表達異常與多種疾病相關。例如，LAMA3基因缺陷與交界性表皮松解型大皰癥有關，這種遺傳性皮膚病表現(xiàn)為皮膚和黏膜脆弱、易損傷［6］。此外，LAMA3可以與整合素等多種細胞表面受體結合調節(jié)癌細胞活性，在腫瘤細胞侵襲和遷移中起著關鍵作用［7-8］。然而，LAMA3在PC中的作用尚不清楚。本研究旨在探討LAMA3在調節(jié)PC細胞EMT、侵襲和遷移中的作用。

1材料與方法

1.1細胞PC細胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1、MIA PaCa-2、SW1990及正常人胰腺導管上皮細胞HPDE購買于中國科學院細胞庫。通過細胞STR鑒定，無細菌、支原體污染。

1.2藥品與試劑DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、青/鏈霉素均購自Gibco公司（美國）；10%胎牛血清購自Gemini公司（美國）。0.25%胰蛋白酶購自上海奕杉生物科技有限公司（中國）。cDNA逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix ExTaq?購自TaKaRa公司（日本）。LAMA3、α-Tubulin引物及LAMA3小干擾RNA由上海生工生物工程有限公司（中國）設計并合成。RIPA裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、EDTA抗原修復液、牛血清白蛋白購自北京索萊寶科技有限公司（中國）。ECL化學發(fā)光試劑購自Millipore公司（美國）。Lipofectamine 3000試劑盒購自Invitrogen公司（美國）。DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司（中國）。LAMA3、α-Tubulin、E-Cadherin、N-Cadherin、Snail和Vimentin抗體購自武漢三鷹生物工程公司（中國）。

1.3儀器NanoDrop微量紫外分光光度計購自美國Thermo Fisher公司；倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)購自日本Nikon公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)和實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.4篩選EMT相關PC基因首先，從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫［9］中獲取并整理TCGA-PAAD項目的RNAseq數(shù)據(jù)及相應的臨床資料。利用R軟件（版本4.2.1）中的“DESeq2”包對原始Counts矩陣進行差異表達分析。根據(jù)LAMA3表達量進行分組，定義標準為：表達量在0～50%為低表達組，表達量在51%～100%為高表達組，使用“survival”包進行批量擬合Cox回歸分析。整理并獲取298個PC基因在PC中高表達，并引起較差的總生存期（overall survival，OS）、疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）和無進展生存期（progression-free interval，PFI））。在基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）數(shù)據(jù)庫［10］中下載并整理了200個EMT相關基因。將298個PC基因與200個EMT相關基因取交集。

1.5利用LASSO回歸構建PC預后模型基于TCGA-PAAD數(shù)據(jù)庫的信息，將LAMA3、AREG和SDC1的表達數(shù)據(jù)納入LASSO回歸模型中進行特征選擇。使用“glmnet”包的算法，應用10倍交叉驗證來確定最優(yōu)正則化參數(shù)（λ），以確保模型的稀疏性。選定的特征通過LASSO回歸得到后，進一步利用“survival”包構建多因素Cox回歸分析模型。使用“step”函數(shù)進行逐步回歸，以選擇最有意義的變量，進而確定最終的預后模型。利用Log-rank檢驗和單變量Cox回歸分析評估該模型的預測性能。繪制Kaplan-Meier生存曲線，并計算風險比（HR）及95%CI。利用“timeROC”包生成不同時間點的受試者操作特征曲線（ROC曲線），以評估模型在1年、3年和5年的預測準確性。

1.6利用列線圖構建PC預后模型基于TCGA數(shù)據(jù)庫進行單變量Cox回歸分析，以評估每個參數(shù)在總生存率中的影響。將顯著變量納入多變量Cox回歸模型。利用“forestplot”包，將上述Cox回歸分析結果在森林圖中進行可視化。應用“rms”包構建列線圖模型，預測患者總生存率。

1.7探究LAMA3表達與PC患者臨床預后的關系從TCGA數(shù)據(jù)庫和基因型-組織表達（genotype-tissue expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫［11］中獲取179個PC組織樣本和171個癌旁組織樣本的LAMA3基因表達數(shù)據(jù)，以及這些患者的臨床信息。從基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫［12］中獲取了四個微陣列表達數(shù)據(jù)集：GSE62452、GSE16515、GSE28735和GSE15471。使用“ggplot2”包分析LAMA3在PC中的表達情況及其與臨床病理參數(shù)的關系。使用“survival”包進行比例風險假設檢驗和生存回歸模型擬合，并利用“ggplot2”和“survminer”包對結果進行可視化處理。此外，從人類蛋白質圖譜（human protein atlas，HPA）數(shù)據(jù)庫［13］中獲取PC和癌旁組織切片樣本中LAMA3基因的蛋白表達情況和亞細胞定位信息。使用單因素Cox回歸模型評估每個變量對生存時間的影響。使用多因素Cox回歸模型，在控制其他變量的影響后，評估每個變量的獨立作用，計算HR、95%CI和P值。

1.8組織樣本收集和免疫組織化學染色（IHC）在貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院收集了10例PC患者的PC組織和癌旁組織。所有患者術前均未接受過放化療、靶向或免疫治療。收集的組織樣本固定超過24 h后，進行梯度脫水、包埋、制備組織切片。切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟及水化處理，然后進行抗原修復。5%牛血清白蛋白封閉后，添加一抗孵育過夜。二抗孵育完成后，DAB顯色、蘇木素核染。最后進行脫水、透明處理和封片。IHC評分由兩位病理學家根據(jù)染色強度和陽性細胞比例評估得出。染色強度按4分制評估（0分：陰性，1分：弱陽性，2分：陽性，3分：強陽性）。陽性細胞的占比按5分制評估：lt;1%記0分，1%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，gt;75%記4分。染色強度分數(shù)×陽性細胞比例分數(shù)=最終評分。

1.9細胞培養(yǎng)HPDE、PANC-1、MIA PaCa-2細胞株培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，AsPC-1、BxPC-3、SW1990細胞株培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中均添加10%FBS和1%青/鏈霉素。所有細胞均放置在37℃5%CO2+95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.10實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）提取總RNA后，將其逆轉錄獲得cDNA，然后進行qRT-PCR實驗。利用實時熒光定量PCR儀進行檢測。設置參數(shù)：95℃30 s，預變性；95℃5 s變性，60℃30 s退火，72℃20 s延伸，40個循環(huán)。反應得到的各個孔的CT值，以α-Tubulin為內參，檢測各組細胞中LAMA3擴增效率，使用2?ΔΔCt方法計算細胞LAMA3的相對表達量。

1.11蛋白質印跡檢測（Western Blot）提取總蛋白后，將等量的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉移到PVDF膜上。封閉完成后置于一抗中，4℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜后，利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影蛋白并保存圖像。

1.12細胞轉染與分組按照使用說明將siRNA使用無酶水溶解，配置成工作液。選用LAMA3內源性表達相對高的PANC-1細胞作為實驗對象，當細胞密度生長至60%～70%時，利用相應的siRNA和lipofectamine 3000進行轉染。將PANC-1細胞分為4個組：si-Control組、si-LAMA3#1組、si-LAMA3#2組、si-LAMA3#3組。使用qRT-PCR、Western Blot驗證轉染效率。

1.13 Transwell侵襲和遷移實驗Transwell遷移實驗：根據(jù)分組將細胞懸液加入Transwell上室，同時加入DMEM培養(yǎng)基至Transwell小室的下室，然后將Transwell小室置于37℃5%CO2+95%空氣的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～48 h后取出小室，無菌棉簽小心擦除上室內的細胞，0.3%結晶紫室溫下染色10～15 min，PBS清洗后，將小室放入烘箱，烘干小室。在倒置顯微鏡下進行拍照和計數(shù)。在Transwell侵襲實驗中，提前在小室內鋪設基質膠（Matrigel膠∶無血清DMEM=1∶8）。上下振動以確保膠體鋪勻，其余操作方法同Transwell遷移實驗。

1.14細胞免疫熒光實驗細胞爬片后，PBS清洗、甲醛溶液固定爬片30 min，PBST液浸洗爬片3次，加入適量0.5%TritonX-100室溫破膜20 min。封閉后，加入LAMA3抗體置于4℃環(huán)境下孵育過夜。第二天加入同種屬的熒光二抗室溫避光孵育2h。DAPI室溫避光孵育10min。熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄熒光染色情況。

1.15統(tǒng)計學方法采用R軟件（版本4.2.1）、GraphPad Prism 8.0或SPSS 25.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。計量資料采用±s表示，2組間比較采用t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1篩選EMT相關PC基因為了篩選出與EMT相關的PC基因，首先利用TCGA-PAAD的數(shù)據(jù)，鑒定出在PC中過表達并導致患者預后不良的基因。結果顯示，共有298個潛在的PC相關基因（圖1a）。隨后，將GSEA數(shù)據(jù)庫中與EMT相關的200個基因與上述298個潛在的PC基因取交集。結果顯示，LAMA3、AREG和SDC1可能是與EMT相關的PC基因（圖1b）。

2.2利用LASSO回歸構建PC預后模型為了研究上述3個基因對PC患者預后的影響，將LAMA3、AREG和SDC1納入LASSO-Cox回歸模型以篩選出最佳候選基因。結果顯示，LAMA3、AREG和SDC1在LASSO-Cox模型中的對數(shù)λ值均達到最佳區(qū)域（圖2a、b）。將這3個基因作為特征構建基于OS的預測模型。風險評分=0.256 1×LAMA3+0.043 1×SDC1+0.071 4×AREG。根據(jù)該模型繪制了風險評分分布圖和Kaplan-Meier生存曲線圖（圖2c、d）。結果顯示，患者的生存情況根據(jù)其風險評分顯著分層。根據(jù)風險評分的高低，分為高風險評分組和低風險評分組。高風險評分組患者的OS顯著降低，低風險評分組患者的OS顯著增加（Log-rank檢驗：Plt;0.05，高風險組HR=2.195，95%CI：1.431～3.367）。時間相關的ROC曲線分析顯示，該模型在1年、3年和5年時間點的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.719、0.692和0.824（圖2e），表明模型在這些時間點上具有較高的預測準確性。以上結果表明，以LAMA3、AREG和SDC1構建的預后模型可以有效評估PC患者的預后風險，其中LAMA3的權重最高，對PC預后影響最為顯著。

2.3利用列線圖構建PC預后模型單因素Cox回歸分析顯示，AREG、LAMA3、SDC1的高表達和臨床病理分級均與PC患者較差的預后相關（P值均lt;0.05），對應的HR分別為1.272 15、1.457 19、1.297 06和1.453 34（圖3a）。進一步多因素Cox回歸分析顯示，LAMA3基因的高表達是PC的獨立預后因素（HR=1.32，95%CI：1.07～1.62，Plt;0.01）（圖3b）。C指數(shù)為0.644（Plt;0.05），表明該模型具有較好的預后預測能力（圖3c）。通過對患者1年和3年生存率預測發(fā)現(xiàn)，列線圖模型預測生存率與實際觀察到的生存率高度一致（圖3d）。綜上所述，LAMA3基因在預后預測中表現(xiàn)出明確且獨立的預測作用，這進一步強化了LAMA3作為潛在預后標志物的價值。

2.4 LAMA3與PC臨床病理和預后之間的關系進一步分析顯示，LAMA3在PC中的表達水平顯著升高（圖4a～f）。此外，LAMA3表達水平越高，PC的T分期（Plt;0.05）（圖4g）、N分期（圖4h）和M分期（圖4i）均顯示出晚期趨勢。同時，Ⅱ期PC患者LAMA3表達水平顯著高于Ⅰ期（Plt;0.05）（圖4j），Ⅳ期PC患者LAMA3表達水平高于Ⅲ期（圖4k）。LAMA3表達水平與PC患者的病理分級程度也呈正相關（Plt;0.05）（圖4l）。然而，由于PC病例數(shù)量有限，N1/N0、M1/M0以及StageⅣ/StageⅢ之間未顯示出顯著的統(tǒng)計學差異。LAMA3基因高表達與患者的不良OS（圖4m）、DSS（圖4n）和PFI（圖4o）相關（P值均lt;0.05）。同時，單因素Cox回歸分析示，臨床分期、病理分級和LAMA3的表達水平與PC患者較差的OS相關（P值均lt;0.05）；多因素Cox回歸分析示，LAMA3的高表達和臨床N分期與PC患者較差的OS相關（Plt;0.05）（表1）。綜上所述，LAMA3的高表達與PC患者的臨床分期、病理分級及預后密切相關，LAMA3可能是PC中有潛在研究價值的致癌因子。

2.5 LAMA3在PC組織和細胞系中高表達收集10例PC組織及配對的癌旁胰腺組織進行IHC實驗發(fā)現(xiàn)，LAMA3在PC組織中的表達水平高于配對的癌旁組織（圖5a、b），這與HPA數(shù)據(jù)庫中的信息一致（圖5c）。此外，與HPDE細胞相比，LAMA3在幾種PC細胞系中的表達均顯著增加，其中，PANC-1細胞的LAMA3表達水平最高（圖5d、e）。因此，后續(xù)選擇PANC-1細胞進行實驗。

2.6 LAMA3的亞細胞定位情況在PANC-1細胞中進行免疫熒光實驗以了解LAMA3基因的亞細胞定位情況。結果顯示，在PANC-1細胞中，LAMA3主要定位于細胞質（圖6a）。這一觀察與HPA數(shù)據(jù)庫中A-431細胞LAMA3的亞細胞定位數(shù)據(jù)一致（圖6b～g）。紅、藍、綠三色通道合并后的結果顯示，LAMA3在細胞內的定位主要集中在內質網(wǎng)區(qū)域。既往研究顯示，LAMA3在細胞外基質中發(fā)揮重要作用，包括參與細胞與細胞外基質的黏附、信號傳導和細胞遷移等過程［14］。上述結果表明，LAMA3可能主要在內質網(wǎng)中完成自身的合成、折疊和組裝，隨后被分泌到細胞外基質中，發(fā)揮其功能。

2.7 LAMA3調節(jié)PC細胞EMT、侵襲和遷移能力首先，利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的信息，通過ssGSEA算法，計算每條通路上LAMA3的富集分數(shù)，得到LAMA3和EMT相關通路之間的聯(lián)系（圖7a～f）。結果表明，LAMA3與EMT、膠原代謝、細胞外基質降解等相關。TGF-β通路、PI3K通路在EMT過程中扮演關鍵的調控角色，LAMA3基因與這些通路存在明顯的正相關性。這些結果初步提示LAMA3可能參與PC細胞的EMT、侵襲和遷移。其次，設計3條小干擾RNA并轉染至PANC-1細胞中，以研究LAMA3對PC細胞的調控作用。結果表明，si-LAMA3#3的沉默效果最好（圖7g、h）。LAMA3敲低后，N-Cadherin、Vimentin和Snail的表達水平下降，E-Cadherin的表達水平升高（圖7i），PANC-1的侵襲和遷移能力減弱（圖7j、k）。綜上所述，LAMA3可能通過調控EMT從而影響PC細胞的侵襲和遷移能力。

3討論

早期PC通常缺乏明顯癥狀，患者往往在診斷時已處于晚期，導致治療變得更加復雜和困難［15］。傳統(tǒng)治療方式在晚期PC中的效果有限［16］。為了有效應對這一重大挑戰(zhàn)，探索可靠的PC生物標志物和治療靶點，并深入揭示其疾病機制不僅有助于早期診斷，還為個性化治療提供了新的方向。

EMT是腫瘤轉移過程中的一個關鍵生物學過程。在EMT過程中，上皮細胞失去極性和緊密連接，獲得了間質細胞的遷移和侵襲特性［17］，這種轉變使腫瘤細胞能夠突破基底膜，侵入周圍組織和血流，進而在身體其他部位形成轉移灶。此外，EMT還與腫瘤細胞的干細胞特性和耐藥性密切相關［18］。這些特性不僅提高了腫瘤細胞的惡性度，還使其在應對化療和靶向治療時更具抵抗力。因此，EMT在腫瘤的多階段進程中起到了不可或缺的推動作用。在PC的發(fā)展過程中，EMT被認為是其高度侵襲性和早期轉移能力的重要機制［19-20］。EMT過程中的關鍵調控因子，如Twist1［21］，能夠促進EMT過程，加速癌細胞遷移和侵襲。其他EMT相關因子如Snail1［22］和Vimentin［23］在PC中也表達上調，與患者的不良預后顯著相關。這表明在PC進展中EMT顯著影響其生物學行為和臨床結局。因此，探索EMT在PC中的調控機制變得尤為重要。

基于TCGA數(shù)據(jù)庫的研究結果顯示，LAMA3、AREG和SDC1可能是PC中調控EMT過程的關鍵靶點。相比之下，EMT相關基因LAMA3可能是PC預后中最關鍵的靶點。層粘連蛋白是一個龐大的異源三聚糖蛋白家族，由5條α鏈（LAMA1～5）、3條β鏈（LAMB1～3）和3條γ鏈（LAMC1～3）的不同組合組裝成交叉樣結構［24］。例如，層粘連蛋白-332由α3、β3和γ2鏈組成，與整合素α6β1結合后，可導致p190 RhoGAP的酪氨酸磷酸化，從而刺激侵襲所需的突起形成和對細胞外基質的降解［25］。大量證據(jù)表明，層粘連蛋白的異常表達與多種癌癥的生物學特征和臨床預后相關。Ning等［26］發(fā)現(xiàn)，LAMA3與METTL3互作，促進口腔鱗狀細胞癌的惡性進展。沉默LAMA3可以抑制膽管癌細胞的增殖、遷移和EMT過程［27］。此外，LAMA3的表達水平和堿基突變可以改變層粘連蛋白的水平，從而對卵巢癌的發(fā)病和預后產(chǎn)生影響［28］。然而，LAMA3在PC中的作用尚不清楚。通過實驗表明，LAMA3在PC組織和細胞系中高表達，在細胞內的定位主要集中在內質網(wǎng)區(qū)域，這表明LAMA3可能主要在內質網(wǎng)中完成自身的合成、折疊和組裝，隨后被分泌到細胞外基質中，參與細胞與細胞外基質的黏附、信號傳導和細胞遷移等過程。進一步的ssGSEA分析顯示，LAMA3與EMT相關通路存在顯著正相關。通過Western Blot實驗發(fā)現(xiàn)，敲低LAMA3使EMT間質標志物的表達增加，而上皮標志物的表達減少，抑制了PC細胞的侵襲和遷移能力。因此，LAMA3可能通過影響EMT過程，調控PC細胞的侵襲和遷移能力，是一個潛在的基因治療靶點。

雖然本研究揭示了LAMA3在PC中的重要性，但依然仍存在一些局限性。首先，本研究主要依賴于生物信息學分析。此外，雖然在臨床樣本中測量了LAMA3的表達水平，但缺乏其與患者預后的深入關聯(lián)研究。最后，LAMA3如何具體影響PC的EMT過程仍需進一步探討。

綜上所述，本研究利用生物信息學手段篩選了EMT相關PC基因LAMA3。LAMA3在PC中表達上調，可能通過調控EMT過程進而影響PC細胞的侵襲和遷移能力。因此，LAMA3有望成為一種新的診斷標志物和基因治療靶點。

倫理學聲明：本研究方案于2023年6月14日經(jīng)由貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2023倫審第494號。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：楊能紅、李鑄、趙宇翔負責課題設計，資料分析，撰寫論文；任笠坤、田舍、韓民參與細胞培養(yǎng)、實驗操作、收集數(shù)據(jù)和修改論文；劉鵬負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-06-05；錄用日期：2024-07-11

本文編輯：王亞南