沙子嶺豬與大約克夏豬背最長(zhǎng)肌miRNA-mRNA共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

摘 "要：微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類非編碼核糖核酸（ribonuclei acid，RNA）小分子，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。本研究對(duì)沙子嶺豬和大約克夏豬背最長(zhǎng)肌組織表達(dá)譜芯片和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，旨在揭示這兩個(gè)豬種的miRNA與信使RNA（messenger RNA，mRNA）的差異表達(dá)特征及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。試驗(yàn)通過(guò)小RNA測(cè)序共鑒定出307個(gè)miRNA，其中9個(gè)顯著差異表達(dá)（5個(gè)上調(diào)，4個(gè)下調(diào)），并分別在沙子嶺豬和大約克夏豬中鑒定出4個(gè)和5個(gè)特異性miRNA；轉(zhuǎn)錄組分析顯示鑒定出553個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），其中341個(gè)上調(diào)，212個(gè)下調(diào)。整合分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)差異表達(dá)miRNA（differentially expressed miRNAs，DEMs）與59個(gè)DEGs形成70對(duì)調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建了關(guān)鍵共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?；虮倔w論（gene ontologo，GO）富集分析表明，靶基因顯著參與肌肉收縮調(diào)控、脂肪酸氧化等生物過(guò)程；京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析揭示絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路、FoxO（Forkhead box O，F(xiàn)oxO）信號(hào)通路和鐵死亡等代謝調(diào)控途徑的顯著富集，其中MAPK14基因同時(shí)參與內(nèi)分泌抵抗與免疫調(diào)控，ACOX1基因在丙酸和碳代謝中發(fā)揮雙重作用。這些發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)解析了沙子嶺豬與大約克夏豬肌肉組織在電生理特性、能量代謝和分子調(diào)控水平的關(guān)鍵差異，為解析豬種質(zhì)特性形成的分子機(jī)制提供了新見(jiàn)解。

關(guān)鍵詞：背最長(zhǎng)肌；miRNA芯片；Solexa測(cè)序沙子嶺豬；約克夏豬

中圖分類號(hào)：S813.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-0769（2025）01-0044-06

骨骼肌發(fā)育與肉質(zhì)性狀的形成受多層分子調(diào)控，其中信使RNA（messenger RNA，mRNA）與微小RNA（microRNA，miRNA）的分子作用機(jī)制日益受到關(guān)注。沙子嶺豬作為中國(guó)地方豬種的典型代表，以耐粗飼、肉質(zhì)細(xì)嫩著稱；而大約克夏豬作為我國(guó)引進(jìn)的瘦肉型品種，則以高瘦肉率和優(yōu)良生長(zhǎng)性能而聞名于世[1]。這兩個(gè)豬種在肌纖維類型、肌內(nèi)脂肪（intramuscular fat，IMF）含量及代謝通路上存在顯著差異，但其骨骼肌發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。

近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)miRNA通過(guò)靶向調(diào)控肌肉發(fā)育的相關(guān)基因，如肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MYH）家族和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族在骨骼肌分化與脂代謝中具有關(guān)鍵作用[2]。miR-27a/b和miR-378等已被證實(shí)可通過(guò)抑制脂肪沉積影響胴體性狀[3]，而let-7 miRNA家族則參與Wnt、PI3K-Akt等信號(hào)通路的調(diào)控[4]。然而，現(xiàn)有研究多聚焦單一分子或組織類型，對(duì)豬種間mRNA-miRNA互作網(wǎng)絡(luò)的系統(tǒng)性分析仍較匱乏。

本研究以兩種斷奶仔豬（沙子嶺豬與大約克夏豬）背最長(zhǎng)肌為對(duì)象，整合表達(dá)譜芯片與miRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，通過(guò)篩選兩個(gè)品種間差異表達(dá)的mRNA與miRNA，并解析其富集的信號(hào)通路及功能關(guān)聯(lián)，構(gòu)建關(guān)鍵miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示品種特異性肌肉發(fā)育的分子基礎(chǔ)，以期為豬遺傳改良及肉質(zhì)性狀分子標(biāo)記的挖掘提供理論依據(jù)。

1 "材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)豬分別選自湖南正虹科技發(fā)展股份有限公司正虹原種豬場(chǎng)的大約克夏豬和湖南省湘潭沙子嶺豬原種場(chǎng)的沙子嶺豬。所選豬均為25日齡的健康去勢(shì)公豬，組內(nèi)為半同胞，每個(gè)品種各3頭，飼養(yǎng)條件相同。屠宰后，在胸腰椎間最后一根肋骨處采集背最長(zhǎng)肌樣本，用磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）溶液沖洗后，速凍于液氮中，以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 總RNA提取和文庫(kù)構(gòu)建

采用TRIzol法提取總RNA；通過(guò)Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定；通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100和1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA完整性。每個(gè)樣本取1 μL RNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，測(cè)序工作由上海生物芯片有限公司采用Illumina Genome Analyzer測(cè)序平臺(tái)完成。

1.3 miRNA的鑒定和數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)濾除低質(zhì)量序列、ploy-N和污染序列后，保留長(zhǎng)度為18～30 nt的序列。通過(guò)Bowtie軟件依次比對(duì)Rfam（Vol.14.1）和Repbase（Vol.24.03）數(shù)據(jù)庫(kù)，系統(tǒng)剔除核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）、小胞質(zhì)RNA（small cytoplasmic RNA，scRNA）及重復(fù)元件等非靶序列。將過(guò)濾后的序列通過(guò)Bowtie（Vol.1.3.0）比對(duì)豬參考基因組（Sus scrofa 11.1），參數(shù)允許最大錯(cuò)配數(shù)為2（不含空位錯(cuò)配）。已知miRNA注釋采用miRBase（Vol.22）數(shù)據(jù)庫(kù)，新miRNA預(yù)測(cè)通過(guò)miRDeep2（Vol.2.0.1.2）完成，設(shè)置自由能閾值－20 kcal/mol且前體序列讀深≥10。各樣本miRNA表達(dá)量采用可信平臺(tái)模塊（Trusted Platform Module，TPM）算法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化?；诟咄繙y(cè)序數(shù)據(jù)，以|log2FC（log2 fold change，log2FC）|≥1.0且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選DEMs，篩選結(jié)果通過(guò)miRBase（Vol.22）注釋miRNA成熟體序列。

1.4 表達(dá)譜芯片測(cè)定與數(shù)據(jù)分析

采用Affymetrix豬全基因組表達(dá)芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，每個(gè)處理組設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用GeneChip 3' IVT Express試劑盒對(duì)6個(gè)樣本（總RNA）進(jìn)行擴(kuò)增、標(biāo)記及純化，獲得生物素標(biāo)記的互補(bǔ)RNA（complementary RNA，cRNA），嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。芯片雜交與洗滌通過(guò)GeneChip? Hybridization Wash and Stain Kit在Hybridization Oven 645雜交儀和Fluidics Station 450洗染工作站完成。采用Command Console Software 3.1控制GeneChip Scanner 3000掃描儀進(jìn)行芯片掃描。原始數(shù)據(jù)經(jīng)RMA算法和GeneSpringl軟件（Vol.11.0）進(jìn)行背景校正及標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)DESeq2（Vol.1.10.1）進(jìn)行各樣本中mRNA的差異分析篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|＞1.0且P＜0.05。

1.5 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

聯(lián)合TargetScan（Vol.8.0）、miRDB（Vol.6.0）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)注釋后的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)；預(yù)測(cè)到的靶基因與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的差異表達(dá)mRNAs（篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2FC|＞1.0且P＜0.05）進(jìn)行維恩圖分析，獲取顯著共調(diào)控靶基因集。Cytoscape（Vol.3.7.2）構(gòu)建包含DEMs及其共調(diào)控靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.6 差異表達(dá)分析和富集分析

通過(guò)DESeq2（Vol.1.10.1）進(jìn)行各樣本中mRNA的差異分析篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|＞1.0且P＜0.05。參照DAVID和KOBAS 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRNA靶基因結(jié)果進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，顯著富集的標(biāo)準(zhǔn)均為P＜0.05。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR驗(yàn)證分析

采用SYBR Green熒光染料法對(duì)樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）驗(yàn)證。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以豬U6 snRNA、甲硫氨酸t(yī)RNA（Met-tRNA）及5S RNA作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)。引物序列見(jiàn)表1和表2。采用2?ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，組間差異通過(guò)SPSS Vol.26.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（P＜0.05為顯著差異）。

2 "結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

原始數(shù)據(jù)（raw reads）經(jīng)去接頭和低質(zhì)量讀長(zhǎng)過(guò)濾后，兩個(gè)cDNA文庫(kù)分別獲得31 862 145 " "（大約克夏豬）條和37 186 633（沙子嶺豬）條有效序列（clean reads），其中已知miRNA注釋比例分別達(dá)78.6％和77.78％（表3），表明測(cè)序數(shù)據(jù)以miRNA為主。少量序列被注釋為核仁小RNA（small nucleolar RNA，snoRNA）、核內(nèi)小RNA（small nuclear RNA，snRNA）、rRNA和假基因（pseudogene）等非靶向RNA，占比較低（＜5％），表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

2.2 miRNA和mRNA的差異表達(dá)分析

在沙子嶺豬和大約克夏豬的背最長(zhǎng)肌樣本中共鑒定出307個(gè)miRNA，其中298個(gè)miRNA為大約克夏豬與沙子嶺豬共表達(dá)的，兩個(gè)品種中分別有5個(gè)（大約克夏豬）和4個(gè)（沙子嶺豬）miRNA為品種特異性表達(dá)miRNA。以大約克夏豬為對(duì)照，篩選出9個(gè)顯著差異表達(dá)的DEMs，包含5個(gè)上調(diào)的和4個(gè)下調(diào)的。

在沙子嶺豬和大約克夏豬背最長(zhǎng)肌中的mRNA表達(dá)模式中，以大約克夏豬為對(duì)照組，共篩選出553個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中上調(diào)基因341個(gè)（62％），下調(diào)基因212個(gè)（38％）。

2.3 miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其靶基因富集分析

將預(yù)測(cè)到的DEMs靶基因與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的539個(gè)DEGs進(jìn)行韋恩圖分析（Venn diagram），共獲取8個(gè)DEMs的59個(gè)基因，形成了70對(duì)調(diào)控關(guān)系（表4）。對(duì)現(xiàn)有的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，生物過(guò)程顯著富集于肌肉收縮調(diào)控、肌肉系統(tǒng)過(guò)程調(diào)節(jié)及脂肪酸氧化等通路；細(xì)胞組分主要富集于細(xì)胞器膜內(nèi)在成分和離子通道復(fù)合體，其中電壓門控通道相關(guān)基因，如TF基因，呈顯著差異表達(dá)。在分子功能層面，蛋白激酶活性、電壓門控通道活性及磷酸肌醇結(jié)合等功能顯著富集，提示沙子嶺豬和大約克夏豬在肌肉電生理特性方面存在重要調(diào)控差異。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異基因顯著富集于MAPK信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路及鐵死亡等代謝調(diào)控通路。其中，MAPK14基因同時(shí)參與內(nèi)分泌抵抗和Fcε受體I信號(hào)通路調(diào)控，而ACOX1基因在丙酸代謝與碳代謝通路中均發(fā)揮重要作用。

2.4 RT-qPCR驗(yàn)證

為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，隨機(jī)選取4個(gè)差異miRNA（ssc-miR-127、ssc-let-7e、ssc-miR-204、ssc-miR-29a）及8個(gè)DEGs（GADD45G、MYH1、MAPK14、SYMPK、SRPX、NRAP、EEA1和IL17RD）進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示其表達(dá)趨勢(shì)與測(cè)序數(shù)據(jù)高度一致。

3 "討論

脂肪型豬種（中國(guó)地方品種）與瘦肉型豬種（歐洲品種）在肌肉特征上存在顯著差異[5]。以沙子嶺豬為代表的脂肪型豬種相較于瘦肉型品種具有更高的肌內(nèi)脂肪[6]。肌內(nèi)脂肪作為肉質(zhì)的重要遺傳指標(biāo)，可顯著提高肉品的嫩度、多汁性、風(fēng)味和持水能力[7]，同時(shí)降低滴水損失和蒸煮損失[8]。沙子嶺豬作為華中地區(qū)代表性品種，于2014年被中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為重要遺傳資源保護(hù)品種，具有適應(yīng)亞熱帶氣候、耐粗飼、早熟及肉質(zhì)細(xì)嫩等特點(diǎn)[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)miRNA在沙子嶺豬和大約克夏豬骨骼肌中差異表達(dá)，如miR-210和miR-183可能通過(guò)調(diào)控骨骼肌肌細(xì)胞增殖與分化參與骨骼肌發(fā)育[10-11]。其中，let-7e（屬于10個(gè)亞型的let-7家族[4]）和miR-127在大約克夏豬中的表達(dá)量是沙子嶺豬的2倍，尤其是miR-127在差異miRNA中豐度最高。盡管其在豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中的功能尚未明確，但已有研究證實(shí)let-7家族可通過(guò)抑制血小板反應(yīng)蛋白抑制劑-1和金屬蛋白酶組織抑制因子-1等抗血管生成因子促進(jìn)腫瘤血管生成[12]。而與之前研究不同的是[13]，本研究發(fā)現(xiàn)miR-210、miR-183和miR-204在沙子嶺豬背最長(zhǎng)肌中高表達(dá)，提示這些miRNA可能參與保育豬肌肉功能調(diào)控。

在本研究中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所鑒定出的539個(gè)差異基因中，共有59個(gè)差異基因受到DEMs的調(diào)控，靶基因富集分析結(jié)果表明，大約克夏與沙子嶺斷奶仔豬在肌生成和脂肪代謝方面可能存在顯著差異。GO富集分析顯示，靶基因顯著富集在涉及肌肉收縮調(diào)控、肌肉系統(tǒng)過(guò)程調(diào)節(jié)和脂肪酸氧化等多個(gè)肌生成相關(guān)通路。KEGG通路分析顯示，5個(gè)差異基因（ELK4/GADD45G/MKNK1/IGF1R/MAPK14）富集于MAPK信號(hào)通路。該通路不僅是骨骼肌成肌細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控通路[14]，還可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞連接相關(guān)通路與脂代謝通路的交互作用影響肌內(nèi)脂肪沉積[15-16]。其中，Gadd45a基因編碼一種小型肌核蛋白，以刺激蛋白質(zhì)分解、減少蛋白質(zhì)合成、減少線粒體、抑制合成代謝信號(hào)傳導(dǎo)的方式改變骨骼肌基因表達(dá)，可最終導(dǎo)致肌纖維萎縮[17]。此外，也有研究表明，胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ受體基因編碼的受體蛋白可結(jié)合胰島素和胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ，通過(guò)抑制FoxO轉(zhuǎn)錄因子來(lái)維持肌肉質(zhì)量和線粒體功能[18]。

4 "結(jié)論

沙子嶺豬與大約克夏豬背最長(zhǎng)肌中miRNA及mRNA表達(dá)存在顯著差異，共篩選出9個(gè)差異miRNA（DEMs）和553個(gè)差異基因（DEGs），并構(gòu)建了包含8個(gè)DEMs與59個(gè)DEGs的共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（70對(duì)互作關(guān)系）。差異表達(dá)基因進(jìn)行了miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及miRNA靶基因的搜尋，對(duì)上述靶基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，篩選出了多個(gè)與豬骨骼肌生成相關(guān)且可能受到miRNA調(diào)控的關(guān)鍵基因。其關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及通路可為豬種遺傳改良及肉質(zhì)性狀的分子育種提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] YANG H，XU X L，MA H M，et al．Integrative analysis of transcriptomics and proteomics of skeletal muscles of the Chinese indigenous Shaziling pig compared with the Yorkshire breed[J]．BMC Genetics，2016，17（1）：80.

[2] BARTEL D P．MicroRNAs genomics， biogenesis， mechanism， and function[J]．Cell，2004，116（2）：281-297.

[3] WU F，WANG F，YANG Q，et al．Upregulation of miRNA-23a-3p rescues high glucose-induced cell apoptosis and proliferation inhibition in cardiomyocytes[J]．In Vitro Cellular amp; Developmental Biology-Animal，2020，56（10）：866-877.

[4] DE ALMEIDA B C，DOS ANJOS L G，UNO M，et al． " " " " " " " " " " " " " " " " " " " " "Let-7 miRNA's expression profile and its potential prognostic role in uterine leiomyosarcoma[J]．Cells，2019，8（11）：1452.

[5] TANG Z L，LI Y，WAN P，et al．LongSAGE analysis of skeletal muscle at three prenatal stages in Tongcheng and Landrace pigs[J]．Genome Biology，2007，8（6）：R115.

[6] SUN Y M，CAI R，WANG Y Q，et al．A newly identified LncRNA LncIMF4 controls adipogenesis of porcine intramuscular preadipocyte through attenuating autophagy to inhibit lipolysis[J]．Animals，2020，10（6）：926.

[7] LIU J，NONG Q，WANG J，et al．Breed difference and regulatory role of CRTC3 in porcine intramuscular adipocyte[J]．Animal Genetics，2020，51（4）：521-530.

[8] GERBENS F，VERBURG F J，VAN MOERKERK H T，et al．Associations of heart and adipocyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fat content in pigs[J]．Journal of Animal Science，2001，79（2）：347-354.

[9] XING X W，XUE L Q，HUANG S Q，et al．Research of porcine endogenous retrovirus in Shaziling pigs[J]．Yi Chuan，2006，28（7）：799-804.

[10] ISMAEEL A，F(xiàn)LETCHER E，MISERLIS D，et al．Skeletal muscle MiR-210 expression is associated with mitochondrial function in peripheral artery disease patients[J]．Translational Research，2022，246：66-77.

[11] ZHANG L Y，ZHONG D D，YAO C X，et al．Buffalo bbu-miR-493-5p promotes myoblast proliferation and differentiation[J]．Animals，2024，14（4）：533.

[12] OTSUKA M，ZHENG M，HAYASHI M，et al．Impaired microRNA processing causes corpus luteum insufficiency and infertility in mice[J]．The Journal of Clinical Investigation，2008，118（5）：1944-1954.

[13] CHEN C，DENG B，QIAO M，et al．Solexa sequencing identification of conserved and novel microRNAs in backfat of Large White and Chinese Meishan pigs[J]．PLoS One，2012，7（2）：e31426.

[14] KEREN A，TAMIR Y，BENGAL E．The p38 MAPK signaling pathway： A major regulator of skeletal muscle development[J]．Molecular and Cellular Endocrinology，2006，252（1/2）：224-230.

[15] KOKTA T A，DODSON M V，GERTLER A，et al．Intercellular signaling between adipose tissue and muscle tissue[J]．Domestic Animal Endocrinology，2004，27（4）：303-331.

[16] CUI H X，LIU R R，ZHAO G P，et al．Identification of differentially expressed genes and pathways for intramuscular fat deposition in pectoralis major tissues of fast-and slow-growing chickens[J]．BMC Genomics，2012，13：213.

[17] BONGERS K S，F(xiàn)OX D K，EBERT S M，et al．Skeletal muscle denervation causes skeletal muscle atrophy through a pathway that involves both Gadd45a and HDAC4[J]．American Journal of Physiology．Endocrinology and Metabolism，2013，305（7）：E907- E915.

[18] BHARDWAJ G，PENNIMAN C M，KLAUS K，et al．Transcriptomic regulation of muscle mitochondria and calcium signaling by insulin/IGF-1 receptors depends on FoxO transcription factors[J]．Frontiers in Physiology，2022，12：779121.