心理應(yīng)激對SD大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細胞凋亡及Caspase-3表達的影響

[摘要]目的：本研究旨在探討單純心理應(yīng)激對大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細胞凋亡及Caspase-3表達的影響。方法：通過建立大鼠的單純心理應(yīng)激動物模型，并采用HE染色、TUNEL法和免疫組織化學等實驗方法觀察不同時間點下大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨的組織學變化、軟骨細胞凋亡情況以及Caspase-3在軟骨中的表達變化。結(jié)果：與對照組相比，在心理應(yīng)激1周、3周和5周后，實驗組大鼠出現(xiàn)顯著的行為學改變，體重增長量略有減少但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；曠場實驗和高架實驗表明心理應(yīng)激組大鼠的焦慮水平增高（P＜0.05）；組織學分析發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激導致軟骨結(jié)構(gòu)損傷，軟骨細胞凋亡率增加，且隨應(yīng)激時間延長而加?。≒＜0.05）；Caspase-3的表達也隨應(yīng)激時間的延長而增加，但在恢復(fù)期有所下降（P＜0.05）。結(jié)論：單純心理應(yīng)激可引起顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨病理性改變，可能與關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Caspase-3表達增加及軟骨細胞過度凋亡有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]心理應(yīng)激；顳下頜關(guān)節(jié)；顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病；髁突軟骨；細胞凋亡；Caspase-3

[中圖分類號]R782.6" " [文獻標志碼]A" " [文章編號]1008-6455（2025）03-0007-07

The Effects of Psychological Stress on Apoptosis of Condylar Chondrocytes in Temporomandibular Joint and Expression of Caspase-3 in Rats

ZHENG Chengdong1，2，3， ZHANG Yuanyuan4， ZHANG Haijuan1，2，3， HAN Yandong1，2， YU Chuanlei1，2， CHEN Heling1，2，3， WANG Shuang1，2，3

（ 1.Key Laboratory of Shaanxi Province for Craniofacial Precision Medicine Research， College of Stomatology， Xi'an Jiaotong University， Xi'an 710004， Shaanxi， China; 2.Clinical Research Center of Shaanxi Province for Dental and Maxillofacial Diseases， College of Stomatology， Xi'an Jiaotong University， Xi'an 710004， Shaanxi， China; 3.Department of Orthodontics， College of Stomatology， Xi'an Jiaotong University， Xi'an 710004， Shaanxi， China; 4. ClearMed Technology Co.， Ltd，

Changzhou 213145， Jiangsu， China ）

Abstract： Objective" This study aimed to explore the effects of simple psychological stress on the apoptosis of condylar chondrocytes and the expression of Caspase-3 in rats. Methods" The histological changes in rat TMJ cartilage， chondrocyte apoptosis， and Caspase-3 expression post-stress will be examined using a psychological stress model in rats with HE staining， TUNEL assay， and immunohistochemistry." Results" The results showed that compared with the control group， significant behavioral changes were observed in the experimental group rats after 1 week， 3 weeks， and 5 weeks of psychological stress（P＞0.05）. There was a slight reduction in body weight gain but no statistical difference， open field and elevated tests indicated that the anxiety level of rats in the psychological stress group increased（P＜0.05）. Histological analysis found that psychological stress led to damage of cartilage structure and increase in chondrocyte apoptosis rate， which worsened with the extension of stress time（P＜0.05）. The expression of Caspase-3 also increased with the extension of stress time， but decreased in the recovery period（P＜0.05）. Conclusion" This indicates that simple psychological stress can cause pathological changes in the condylar cartilage of the temporomandibular joint， which may be related to increased expression of Caspase-3 in the articular cartilage and excessive apoptosis of chondrocytes.

Key words： psychological stress; temporomandibular joint; temporomandibular joint disorder; condylar cartilage; apoptosis; Caspase-3

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂?。═emporomandibular disorders，TMD）是指在顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)周圍主要特征為疼痛、異常關(guān)節(jié)音及下頜運動功能障礙。顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病是一種病因復(fù)雜的多因素疾病，與咬合關(guān)系紊亂、損傷、自身免疫、心理因素不良、咀嚼習慣、關(guān)節(jié)局部解剖異常等多種因素相關(guān)[1]。TMD的發(fā)生還與患者持續(xù)的精神緊張、焦慮、抑郁、憤怒等心理應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。應(yīng)激是指機體在受到各種內(nèi)外環(huán)境因素刺激時所出現(xiàn)的非特異性全身反應(yīng)。適當?shù)拇碳ひ蛩赜幸嬗谏眢w健康，然而當心理應(yīng)激過度或慢性應(yīng)激時，則可以導致代謝紊亂、器官功能失調(diào)，誘發(fā)心血管疾病、糖尿病、腫瘤、消化系統(tǒng)疾病等多種疾病[2-7]。

流行病學調(diào)查和動物實驗均表明心理應(yīng)激可以引起顳下頜關(guān)節(jié)的病理性改變[8]。顳下頜關(guān)節(jié)紊亂常伴有關(guān)節(jié)軟骨破壞，軟骨下骨改變等器質(zhì)性病變。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一的細胞成分，其數(shù)目和功能決定了軟骨健康與否。軟骨細胞的正常凋亡是調(diào)控軟骨生長發(fā)育、控制軟骨細胞功能、穩(wěn)定關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境所必需的一種生理過程。正常情況下，軟骨細胞處于增殖和凋亡的動態(tài)平衡中，然而一旦由于某些因素導致細胞發(fā)生病理性過度凋亡，則會打破這一平衡，導致軟骨結(jié)構(gòu)和功能異常[9]。軟骨細胞過度凋亡是引起骨關(guān)節(jié)炎的一個重要機制。Caspase是引起細胞凋亡的關(guān)鍵，在細胞凋亡機制網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位[10-11]。Caspase-3是各種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分[12-13]，在細胞凋亡的過程中具有重要作用[14-17]。

心理應(yīng)激導致TMD病理性改變的分子生物學機制目前尚無定論。凋亡分子Caspase-3的表達變化及軟骨細胞的凋亡在心理應(yīng)激引發(fā)TMD中的作用目前少見報道。本研究通過建立大鼠的單純心理應(yīng)激動物模型，探討單純心理應(yīng)激對大鼠的顳下頜關(guān)節(jié)軟骨組織及軟骨細胞凋亡和Caspase-3表達的影響，為TMD分子生物學發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1" 材料和方法

1.1 實驗動物：選取72只7周齡SPF級SD大鼠，雄性，體重160～200 g，由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。檢查SD大鼠精神行為無異常，咬合無異常，可正常進食，無明顯全身疾患。

1.2 實驗設(shè)備及試劑：脫水機（武漢俊杰電子有限公司JJ-12J）、包埋機（武漢俊杰電子有限公司JB-P5）、病理切片機（上海徠卡儀器有限公司RM2016）、凍臺（武漢俊杰電子有限公司JB-L5）、組織攤片機（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司KD-P）、烤箱（天津市萊玻瑞儀器設(shè)備有限公司GFL-230）、載玻片（Servicebio）、正置光學顯微鏡（日本尼康Nikon Eclipse E）、成像系統(tǒng)（日本尼康Nikon DS-U3）、掌上數(shù)字萬用表（UT33B+，優(yōu)利德電子有限公司）、調(diào)壓器（TDGC-0.5K）、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司100092683）、二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司10023418）、HE染液（Servicebio G1005）、分化液（Servicebio G1005-3）、返藍液（Servicebio G1005-4）、中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司 10004160）

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組：將72只SD大鼠隨機分為心理應(yīng)激組（Psychological Stress Group）、足部電擊組（Foot Shock Group）和空白對照組，每組24只，其中心理應(yīng)激組又分為心理應(yīng)激1周組、心理應(yīng)激3周組、心理應(yīng)激5周組和應(yīng)激恢復(fù)組（應(yīng)激5周后停止應(yīng)激，自然恢復(fù)4周），每組6只；空白對照組分為空白對照1周組、空白對照3周組、空白對照5周組和應(yīng)激恢復(fù)空白對照組（連續(xù)9周均不進行心理應(yīng)激的空白對照組），每組6只；剩余24只足部電擊組作為心理應(yīng)激組的刺激源進行足部電擊。

1.3.2 單純心理應(yīng)急模型建立：心理應(yīng)激交流箱最早由Gomita Y[18]設(shè)計制作，本實驗所采用的交流箱是由賈克然等[19]所設(shè)計的小鼠心理應(yīng)激交流箱改進而來的。相比較其他造模方法而言，單純心理應(yīng)激交流箱法可以有效避免動物軀體應(yīng)激，能夠更準確地模仿人類情緒。心理應(yīng)激交流箱用透明有機玻璃板分為36個小室。臨近應(yīng)激組大鼠可以看到其他大鼠被電擊的過程，板上設(shè)置透氣孔可以接收到足部電擊組大鼠的聲音和氣味信息。心理應(yīng)激交流箱的底板鋪有導電絲，調(diào)壓器控制電擊強度，導電絲電壓為30 V，足部電擊組大鼠直接與底板接觸，心理應(yīng)激組大鼠所處的小室底部放置絕緣有機玻璃板。

實驗開始前1周，各組動物分籠飼養(yǎng)，6只/籠，保證相同的飼養(yǎng)條件，每日放入心理應(yīng)激箱中適應(yīng)環(huán)境，不進行電擊刺激。實驗開始后，將三組大鼠分別放入到心理應(yīng)激箱相應(yīng)的格子中。每天上午9：00～11：00進行實驗，電壓30 V，通電持續(xù)5 s，兩次通電間隔30 s，每天實驗共持續(xù)30 min。

1.3.3 體重測量：各組SD大鼠分別于實驗前及實驗開始后1、3、5、9周末測量體重，計算體重增長量。

1.3.4 曠場實驗箱：大鼠曠場反應(yīng)箱邊長100 cm，高35 cm，由黑色不反光板制成。實驗時需防止噪音干擾。每只大鼠結(jié)束后需徹底打掃曠場內(nèi)余留物。SMART 3.0軟件對其中央停留時間和曠場內(nèi)移動總距離進行統(tǒng)計并分析。當大鼠在曠場內(nèi)中央停留時間和曠場內(nèi)移動總距離發(fā)生顯著性改變時，即可認為造模成功，大鼠處于心理應(yīng)激的狀態(tài)。

1.3.5 高架十字迷宮：由兩條開放臂和兩條閉合臂及中央?yún)^(qū)連接而成，開放臂周圍無圍欄阻擋，開放臂和閉合臂底面為長方形。將SD大鼠放入高架十字迷宮的中央?yún)^(qū)域，同時進行攝像和計時，每只大鼠觀察5 min，用SMART 3.0軟件對大鼠進入開放臂的次數(shù)（Open arm entry，OE），進入閉合臂的次數(shù)（Closed arm entry，CE），分別記錄在開放臂停留的時間（Open arm time，OT）和閉合臂停留的時間（Closed arm time，CT）。OE%=OE/（OE+CE）×100%、OT%=OT/（OT+CT）×100%。OE%及OT%減少反映大鼠焦慮情緒加重。

1.3.6 髁突組織HE染色：分別于實驗開始1周、3周和5周、9周末處死相應(yīng)的空白對照組、心理應(yīng)激組和應(yīng)激恢復(fù)組大鼠。每只大鼠取單側(cè)顳下頜關(guān)節(jié)，編號單數(shù)取左側(cè)，雙數(shù)取右側(cè)。將所得關(guān)節(jié)用生理鹽水沖洗后放入4%多聚甲醛固定液，固定48 h。固定結(jié)束后使用15%的EDTA脫鈣8周。依次放入不同濃度（75%、85%、90%、95%）的酒精中4 h、2 h、2 h、1 h。取出后再放入到無水乙醇和二甲苯中繼續(xù)脫水。脫水后包埋浸蠟組織，切片4μm。脫蠟并蘇木素染色和伊紅染色，使用中性樹膠用來封片。

1.3.7 TUNEL染色：染色前對石蠟切片進行脫蠟，依次放入有機溶劑中并使用蒸餾水仔細清洗。確保液體甩干，使用蛋白酶K工作液修復(fù)組織，使用破膜工作液破膜，修復(fù)和破膜操作后都需要使用PBS洗滌3次，每次3 min。將Tunel試劑盒中TdT和DUTP按照1∶9的比例進行混合，覆蓋組織，37°孵育2 h，PBS洗片，方法同上，使用DAPI復(fù)染細胞核，室溫下避光孵育10 min。再次使用PBS清洗，甩干，用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡下觀察，掃描并分析圖像。

1.3.8 Caspase-3免疫組化染色：石蠟切片脫蠟，依次放入有機溶劑中并使用蒸餾水仔細清洗甩干，使用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（PH 6.0）抗原修復(fù)。3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。3%BSA室溫封閉組織，一抗稀釋比例為1∶500，4℃過夜。二抗室溫孵育。DAB顯色液，在顯微鏡下觀察組織內(nèi)棕黃色表達，控制染色時間，水洗終止染色。Harris蘇木素復(fù)染細胞核，流水沖洗后再用1%的鹽酸酒精進行分化，重復(fù)沖洗，氨水返藍后再沖洗。染色完成后進行封片，鏡下觀察，掃描并分析圖像。

1.4 統(tǒng)計學分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行，相同時段組間比較采用獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2" 結(jié)果

2.1 大鼠行為表現(xiàn)：所有大鼠放入心理應(yīng)激箱中且未通電時，大鼠鼻嗅四周，直立探索，未見跳躍，喊叫情況（見圖1A）。通電后，足部電擊組大鼠在小室內(nèi)跳躍次數(shù)明顯增加，呼吸急促，大聲尖叫（見圖1B）。心理應(yīng)激組大鼠受到四周相鄰電擊鼠行為刺激后，直立、探索行為消失，蜷縮，豎毛，處于明顯恐懼狀態(tài)（見圖1C）。

2.2 大鼠體重增長量：大鼠體重增長量為各時間點所測得體重減去實驗開始前大鼠初始體重。結(jié)果顯示，隨著時間增加，各組大鼠平均體重均呈增加趨勢，總體來看心理應(yīng)激組1、3、5周及應(yīng)激恢復(fù)期大鼠與同期空白對照組大鼠相比，體重增量略有減少，但結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 曠場實驗：曠場中央?yún)^(qū)域停留時間心理應(yīng)激1周組、3周組、5周組的曠場中央?yún)^(qū)域停留時間與空白對照1周組、3周組、5周組相比明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），心理應(yīng)激恢復(fù)組與應(yīng)激恢復(fù)對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見圖2）。

2.4 高架實驗結(jié)果

2.4.1 開臂進入次數(shù)百分比：心理應(yīng)激1周組、3周組、5周組的大鼠開臂進入次數(shù)百分比與空白對照1周組、3周組、5周組相比明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），心理應(yīng)激恢復(fù)組與應(yīng)激恢復(fù)對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4.2 開臂停留時間百分比：心理應(yīng)激組1周組、3周組、5周組的開臂停留時間百分比與空白對照1周組、3周組、5周組相比明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），心理應(yīng)激恢復(fù)組與應(yīng)激恢復(fù)對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.5 髁突組織學觀察結(jié)果：鏡下觀察，對照組大鼠髁突軟骨內(nèi)細胞層次清楚，由表及里分別為纖維層、增殖層、過渡層、肥大層、鈣化軟骨層。軟骨表面平滑整齊，纖維層呈粉色均質(zhì)狀，膠原纖維致密，連續(xù)性好，排列方向與軟骨表面平行，纖維內(nèi)散在分布少量梭形細胞，方向與纖維走向一致；增殖層細胞數(shù)量較多，約8～10層，呈橢圓形，胞漿嗜堿性，核呈圓形或梭形，核仁清晰；過渡層細胞體積比增殖層略大，呈橢圓形，胞質(zhì)淡染；肥大層細胞體積最大，呈圓形，部分染色極淡，核仁偏位，部分胞核固縮溶解，呈空泡狀（見圖4A、C、E、G）。心理應(yīng)激1周組軟骨膠原纖維排列紊亂（見圖4B），3周組破壞最明顯，軟骨結(jié)構(gòu)進一步損傷，表面纖維層斷裂為大小不一的裂隙甚至脫離，軟骨層變薄，增殖層細胞層數(shù)明顯減少（見圖4D），應(yīng)激5周時情況略有好轉(zhuǎn)，可見軟骨表面纖維松解，出現(xiàn)裂隙，連續(xù)性遭到破壞，增殖層細胞較對照組稍有減少（見圖4F），應(yīng)激恢復(fù)組可見軟骨表面纖維破壞情況得到較大改善，纖維間裂隙減少，增殖層細胞數(shù)目增加（見圖4H）。

2.6 TUNEL染色結(jié)果：本實驗采用TUNEL法檢測軟骨細胞的凋亡情況，陽性凋亡細胞核為綠色，對照組正常軟骨細胞也存在凋亡現(xiàn)象，極少數(shù)軟骨細胞的細胞核呈綠色（見圖5）；心理應(yīng)激1周組軟骨細胞凋亡數(shù)目較對照組略增多，細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；隨著應(yīng)激時間的增加，結(jié)果顯示心理應(yīng)激3周時軟骨細胞凋亡數(shù)目最多，與對照組相比細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；心理應(yīng)激5周后軟骨細胞凋亡數(shù)目與應(yīng)激3周相比略有減少，但與對照組相比細胞凋亡率仍差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而心理應(yīng)激恢復(fù)組比對照組細胞凋亡數(shù)目多，但細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖6、表2。

2.7 Caspase-3免疫組化染色結(jié)果：結(jié)果顯示，正常對照組軟骨細胞僅有微弱的Caspase-3表達（見圖7），心理應(yīng)激1周組細胞Caspase-3陽性表達率升高，陽性率為（13.96±3.45）%，與同期對照組相比（4.57±2.30）%差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。心理應(yīng)激3周時細胞Caspase-3高表達，細胞內(nèi)可見大量棕黃色顆粒[陽性率為（30.73±5.05）%]，與同期對照組（9.35±3.35）%相比具差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。心理應(yīng)激5周組細胞內(nèi)Caspase-3陽性表達略低于應(yīng)激3周組，陽性率為（25.92±5.40）%，與同期對照組（10.60±4.45）%相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。心理應(yīng)激恢復(fù)組可見細胞內(nèi)Caspase-3陽性表達明顯減少，陽性率為（22.67±4.74）%，與同期對照組（12.16±6.09）%相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這表明一定時間內(nèi)細胞內(nèi)Caspase-3的表達隨應(yīng)激時間的增加而增加，在心理應(yīng)激第3周時達到峰值，隨后隨應(yīng)激時間的增加，細胞內(nèi)Caspase-3表達開始減少。心理應(yīng)激5周后自然恢復(fù)組細胞內(nèi)Caspase-3表達較恢復(fù)前進一步減少。見圖8、表3。

3" 討論

單純心理應(yīng)激交流箱法可以有效避免動物軀體應(yīng)激，能夠更準確地模仿人類情緒。由于電擊的時間、強度可量化，這種方法有較好的可重復(fù)性，但由于交流箱法應(yīng)激方式比較單一，隨著應(yīng)激時間增加動物可能會產(chǎn)生適應(yīng)性和耐受性，所以該方法不適用于建立長期心理應(yīng)激模型。處在心理應(yīng)激狀態(tài)下的實驗組大鼠體重增長量較同期對照組低，個別應(yīng)激組大鼠甚至出現(xiàn)了體重負增長現(xiàn)象，這可能與心理應(yīng)激使大鼠情緒緊張、抑郁焦慮繼而導致的進食減少有關(guān)，這一現(xiàn)象與人類患有抑郁癥或焦慮癥時短期內(nèi)體重減輕現(xiàn)象[20]相一致。應(yīng)激組大鼠體重增長量雖減少，但與同期對照組大鼠相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這可能是由于大鼠體重增量為累積變量，而本實驗中所設(shè)計的組間時間間隔較短所致。

曠場試演和高架實驗是公認有效評價動物應(yīng)激模型的方法之一[21]。與同期對照組相比，心理應(yīng)激1周組、3周組、5周組大鼠在中央?yún)^(qū)域停留時間更長，總移動距離更短，差異具有顯著性（P＜0.05），這表明心理應(yīng)激1、3、5周后動物自主探究行為減少，精神緊張度增加，抑郁程度較高，處于應(yīng)激狀態(tài)；心理應(yīng)激恢復(fù)組與同期對照組大鼠的曠場中央?yún)^(qū)域停留時間、總移動距離相比，結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這說明去除刺激恢復(fù)四周后，大鼠心理應(yīng)激狀態(tài)消失。

高架實驗結(jié)果顯示，與同期對照組相比，心理應(yīng)激1周組、3周組、5周組大鼠進入開放臂次數(shù)少，開放臂停留時間短，結(jié)果均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），這表明動物恐懼心態(tài)增加，探究行為減少，焦慮程度較高。心理應(yīng)激恢復(fù)組與同期對照組大鼠的開放臂進入次數(shù)、開放臂停留時間相比，結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明去除刺激自行恢復(fù)四周后，大鼠焦慮得到緩解，應(yīng)激狀態(tài)得到有效改善。因此，心理應(yīng)激引起大鼠顯著的行為學改變，表現(xiàn)為焦慮水平的顯著增加，體重增長量略有減少但差異無統(tǒng)計學意義

顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨是下頜骨重要的生長發(fā)育中心之一，作為軟骨內(nèi)唯一的細胞成分，軟骨細胞的數(shù)目和功能至關(guān)重要。增殖層間充質(zhì)細胞可增殖分化為成軟骨細胞層內(nèi)的成軟骨細胞和軟骨細胞，經(jīng)過軟骨內(nèi)骨化形成鈣化軟骨，最終形成新骨。髁突軟骨引導髁突乃至整個關(guān)節(jié)發(fā)生適應(yīng)性改建。心理應(yīng)激1周組，3周組，5周組髁突軟骨均出現(xiàn)了不同程度的破壞。心理應(yīng)激1周，由于時間較短，軟骨表面膠原纖維僅出現(xiàn)輕微排列紊亂。應(yīng)激時間增加至3周時，軟骨結(jié)果破壞最明顯，可見表面纖維層斷裂甚至脫離，軟骨層變薄，增殖層細胞層數(shù)也明顯減少，隨著應(yīng)激時間進一步延長，應(yīng)激5周時較3周時病變程度略減輕，表面纖維仍有松解，連續(xù)性破壞明顯，增殖層細胞較對照組稍有減少。可見心理應(yīng)激對顳下頜關(guān)節(jié)的影響是一個累積的過程，隨著應(yīng)激時間的延長，當刺激累積超過了機體自身的調(diào)節(jié)能力時，便會造成組織比較明顯的病理性損傷，在應(yīng)激開始后的前3周內(nèi)隨時間的延長而加重。然而當心理應(yīng)激種類和強度保持不變時，隨著應(yīng)激時間的進一步延長，動物可能對該刺激產(chǎn)生了一定的適應(yīng)性，雖從行為學來看此時動物仍處于應(yīng)激狀態(tài)，但軟骨損傷不再進一步惡化。去除刺激源后應(yīng)激恢復(fù)組髁突軟骨病變顯著減輕，這表明該損傷具有一定自愈性。由于心理應(yīng)激對髁突軟骨造成的損傷僅限于軟骨中上層，并未出現(xiàn)嚴重的軟骨下骨損傷，故其更容易修復(fù)，與文獻報道一致[22-24]。結(jié)論為心理應(yīng)激導致大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為軟骨纖維層斷裂、增殖層細胞層數(shù)減少等，且隨著應(yīng)激時間的延長，損傷加劇。

細胞凋亡是一種細胞程序性死亡。其中有Caspase級聯(lián)反應(yīng)參與的細胞凋亡是最凋亡的主要途徑。本實驗采用Tunel法評估軟骨細胞凋亡情況，可以看到，在正常對照組中也存在細胞凋亡現(xiàn)象，但凋亡率極低，僅有個別細胞被綠色熒光標記。心理應(yīng)激組在1周、3周和5周時的Caspase-3陽性表達百分率顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。這表明心理應(yīng)激顯著增加了Caspase-3的表達，提示應(yīng)激可能誘導了細胞凋亡的增加，表明心理應(yīng)激后軟骨細胞的凋亡率明顯提高。在一定時間內(nèi)，軟骨細胞凋亡率隨心理應(yīng)激時間延長而增加，在細胞應(yīng)激3周時細胞凋亡率達到峰值，之后隨著應(yīng)激時間的延長5周組Caspase-3陽性率較3周組減小，這可能與機體對應(yīng)激產(chǎn)生耐受性有關(guān)。在恢復(fù)階段，心理應(yīng)激組的Caspase-3陽性表達百分率有所下降，但仍高于空白對照組，說明盡管心理應(yīng)激的影響在恢復(fù)期有所減弱，但其對細胞凋亡的影響仍然存在。Caspase-3的陽性表達率與軟骨細胞凋亡率和髁突軟骨破壞的嚴重程度呈正相關(guān)。軟骨細胞凋亡率改變的趨勢與髁突軟骨組織學變化的趨勢一致。凋亡的軟骨細胞大多分布在軟骨的表層和中層，與文獻報道一致。結(jié)論為心理應(yīng)激組大鼠的軟骨細胞凋亡率顯著增加，尤其在應(yīng)激3周時凋亡率最高，表明心理應(yīng)激誘導了軟骨細胞的過度凋亡。在心理應(yīng)激停止后，自然恢復(fù)期大鼠的軟骨組織結(jié)構(gòu)和細胞凋亡情況有所改善，表明心理應(yīng)激的部分損傷在停止應(yīng)激后可以恢復(fù)。

綜上所述，說明心理應(yīng)激可以引起顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的病理性改變，并且在軟骨病理性進程中軟骨細胞出現(xiàn)過度凋亡的現(xiàn)象。本研究表明單純心理應(yīng)激可引起顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的病理性改變，可能與軟骨細胞內(nèi)Caspase-3表達增加及軟骨細胞過度凋亡有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)為理解心理應(yīng)激對顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病（TMD）病理機制提供了重要理論依據(jù)，并提示在TMD的治療和預(yù)防中應(yīng)考慮心理因素的影響。

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[收稿日期]2024-06-26

本文引用格式：鄭程東，張媛媛，張海娟，等.心理應(yīng)激對SD大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細胞凋亡及Caspase-3表達的影響[J].中國美容醫(yī)學，2025，34（3）：7-13