超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定酵素梅中12種酚?。ǚ佣。?、酚酞及其酯類衍生物或類似物?

摘 要：目的：建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀法測(cè)定酵素梅中非法添加的酚?。ǚ佣。?、酚酞及其酯類衍生物或類似物。方法：樣品經(jīng)水、甲醇超聲提取，采用C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速0.2 mL·min-1；通過ESI源（正離子）選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性、定量監(jiān)測(cè)。結(jié)果：12種非法添加組分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)性系數(shù)均大于0.997。在1倍檢出限、2倍檢出限、5倍檢出限3種添加濃度下的平均回收率在93.0%～123.0%，精密度在0.26%～8.58%。結(jié)論：該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、測(cè)定快速，可用于酵素梅中12種非法添加藥物的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）；非法添加；酚??；酚酞；酯類衍生物或類似物

Determination of 12 Oxyphenisatin， Phenolphthalein and Their Ester Derivatives or Analogues in Enzyme Plum by UPLC-MS/MS

LI Xiaofei

（Dalian Product Quality Inspection and Testing Institute Co.， Ltd.， Dalian 116023， China）

Abstract： Objective： To establish a ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of illegally added oxyphenisatin， phenolphthalein， and their ester derivatives or analogues in enzyme plum. Method： The sample was extracted by ultrasound with water and methanol， and separated using a C18 （50 mm×2.1 mm， 1.8 μm） chromatographic column. The mobile phase was 0.1% formic acid aqueous solution-0.1% formic acid methanol， with gradient elution at a flow rate of 0.2 mL·min-1; the detector selected a reaction monitoring mode for qualitative and quantitative monitoring using ESI source （positive ions）. Result： The results showed that the 12 illegally added components had good linear relationships within their respective concentration ranges， with correlation coefficients greater than 0.997. The average recovery rate of the three added concentrations of detection limit， 2-fold detection limit， and 5-fold detection limit is between 93.0% to 123.0%， precision between 0.26% to 8.58%. Conclusion： This method has high sensitivity， simple operation， and fast determination， and can be used for the determination of 12 illegal added drugs in enzyme plum.

Keywords： ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; illegal addition; oxyphenisatin; phenolphthalein; ester derivatives or analogues

酚汀（酚?。⒎犹捌漉ヮ愌苌锘蝾愃莆锞鶠榕R床上使用的緩瀉劑，通過促排達(dá)到減肥的目的。這些藥物一旦過量使用便會(huì)改變?nèi)梭w機(jī)能，造成人體器官衰竭。2023年10月國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布了《關(guān)于打擊食品中非法添加酚?。ǚ佣。⒎犹捌漉ヮ愌苌锘蝾愃莆镞`法行為的通知》，列舉了我國(guó)多地區(qū)查辦的宣稱“減肥”功能食品非法添加藥品、藥品衍生物或類似物系列案件，并指出在食品中檢出酚?。ǚ佣。?、酚酞及其酯類衍生物或類似物（如4-氯雙醋酚丁），均屬于非法添加。

目前，檢測(cè)非法添加化學(xué)藥物的方法主要有高效液相色譜法[1]，液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[2-3]，液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[4]等。對(duì)于新型的非法添加化合物，國(guó)家補(bǔ)充檢驗(yàn)方法有利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）對(duì)雙醋酚丁進(jìn)行定性及定量分析[5]，對(duì)于其他酚丁類化合物及衍生物現(xiàn)階段沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或檢測(cè)方法進(jìn)行技術(shù)支撐，因此有必要盡早建立起酚?。ǚ佣。?、酚酞及其酯類衍生物或類似物的檢測(cè)方法，為食品藥品監(jiān)管部門打擊非法添加行為提供技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，以保障公眾健康。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀（ESI源）；超聲波清洗器；甲醇（色譜級(jí)）；乙腈（色譜級(jí)）；超純水；甲酸（色譜級(jí)）、甲酸銨（色譜級(jí)）。

標(biāo)準(zhǔn)品：酚酞、百里香酚酞、雙辛酚丁、4-氯雙醋酚丁、雙丙酚丁、雙戊酚丁、4-氯酚丁、雙丁酚丁、酚汀、雙醋酚丁、雙己酚丁、雙庚酚丁，濃度為1 000 μg·mL-1。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液A（百里香酚酞濃度為10 mg·L-1、雙辛酚丁濃度為5 mg·L-1，其余化合物濃度均為2 mg·L-1）：取百里香酚酞標(biāo)準(zhǔn)原液100 μL、雙辛酚丁標(biāo)準(zhǔn)原液50 μL，其余各標(biāo)準(zhǔn)原液20 μL于同一容量瓶中（10 mL），用甲醇稀釋定容至刻度。

混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：分別取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液A 0.005、0.010、0.020、0.050 mL和0.100 mL于5個(gè)10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容至刻度，混勻。最終配制成百里香酚酞濃度為5、10、20、50、100 ng·mL-1；雙辛酚丁濃度2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 ng·mL-1；其余化合物濃度為1、2、4、10、20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

1.2 樣品的前處理方法

稱取樣品1.00 g，置于10 mL刻度管中，加入2 mL水，渦旋混勻，再加入8 mL甲醇，超聲提取30 min，放冷后，離心后2 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后，供超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3 UPLC-MS/MS條件

1.3.1 UPLC條件

色譜柱：C18（50 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.20 mL·min-1；流動(dòng)相A：0.1%甲酸；流動(dòng)相B：0.1%甲酸甲醇；流動(dòng)相梯度：0～0.2 min，5% B；0.2～5.0 min，5%→15%B；5.0～10.0 min，15%→90% B；10.0～12.0 min，90%→100% B；12.0～13.0 min，100% B；13.0～13.5 min，100%→10% B，采集時(shí)間為16 min。

1.3.2 MS/MS條件

電噴霧離子源（Electrospray Ionization，ESI），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM），正離子模式，毛細(xì)管電壓：2.0 kV；錐孔反吹氣：10 L·Hr-1；脫溶劑溫度：450 ℃；離子源溫度：150 ℃。定性離子對(duì)、定量離子對(duì)及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.3.3 結(jié)果計(jì)算

按外標(biāo)法制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并據(jù)此得到樣品中各化合物含量。樣品中各化合物的含量計(jì)算公式如下。

（1）

式中：X為樣品中各化合物的含量，μg·kg-1；C為上機(jī)待測(cè)液中各化合物的濃度，ng·mL-1；V1為最終定容體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

將各化合物配制成濃度為100 ng·mL-1的單標(biāo)溶液，采用針泵持續(xù)進(jìn)樣的方式，利用儀器自動(dòng)調(diào)諧功能，依次對(duì)各化合物進(jìn)行自動(dòng)優(yōu)化，得到各化合物的錐孔電壓與碰撞能量的最佳參數(shù)，見表1。

2.1.2 液相色譜條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室常用的甲醇、乙腈、甲酸水、甲酸銨水溶液的兩兩搭配作為流動(dòng)相，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸銨、乙腈同時(shí)使用時(shí)會(huì)對(duì)百里香酚酞、酚汀、雙丁酚丁、4-氯雙醋酚汀、雙丙酚汀、4-氯酚丁、雙醋酚汀有明顯的抑制效應(yīng)，使用0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水體系時(shí)，12種化合物的色譜峰型良好，檢測(cè)靈敏度較高，因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.1% 甲酸甲醇-0.1% 甲酸水作為流動(dòng)相。

在優(yōu)化的儀器條件下，12種化合物在14 min內(nèi)均能得到較好的分離，有些非同分異構(gòu)化合物保留時(shí)間接近，由于質(zhì)荷比的不同，不影響定性與定量，各化合物定量離子掃描圖見圖1。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)是三重四極桿質(zhì)譜法中影響定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。本研究對(duì)酵素梅樣品基質(zhì)進(jìn)行研究，樣品按本方法進(jìn)行測(cè)定，12種化合物均為陰性，將其樣品提取液作為空白基質(zhì)溶液，用空白基質(zhì)溶液和甲醇分別配制同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測(cè)定，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液各平行測(cè)定3次，記錄其各化合物的峰面積，求其平均值。相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)=待測(cè)物在基質(zhì)中的平均峰面積/待測(cè)物在純?nèi)軇┲械钠骄迕娣e×100%。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在酵素梅樣品基質(zhì)中，12種化合物相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)均在80%～125%，沒有強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)的出現(xiàn)，又由于此類化合物均為非法添加物，在食品中不得檢出，綜合考慮，酵素梅樣品的測(cè)定中可用溶劑曲線進(jìn)行定量分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液按上述方法進(jìn)行儀器測(cè)定，以化合物濃度為橫坐標(biāo)，以化合物定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)性系數(shù)r評(píng)價(jià)其相關(guān)性，各化合物的相關(guān)性系數(shù)如表2。結(jié)果符合《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》（GB/T 32465—2015）中相關(guān)性系數(shù)不小于0.997的要求。

2.4 方法檢出限

在酵素梅樣品空白基質(zhì)中采用逐級(jí)遞減的方法加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行測(cè)定，以信噪比≥3作為依據(jù)確定各個(gè)化合物的檢出限，最終確定百里香酚酞的檢出限為50 μg·kg-1；雙辛酚丁的檢出限為25 μg·kg-1；其余化合物的檢出限為10 μg·kg-1。

2.5 準(zhǔn)確度與重復(fù)性驗(yàn)證

針對(duì)各基質(zhì)，添加濃度分別在檢出限、2倍檢出限、5倍檢出限的水平下，進(jìn)行回收測(cè)定，12種化合物的回收率為93.0%～123.0%，各水平下的6平行樣品加標(biāo)回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.26%～8.58%，各化合物在不同濃度的回收率及精密度詳見表3。

2.6 提取溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)考慮12種酚汀（酚?。⒎犹捌漉ヮ愌苌锘蝾愃莆镌诩状贾腥芙庑瘦^高，又因?yàn)橐合鄺l件使用甲醇作為流動(dòng)相，為增加溶劑匹配度，減小溶劑效應(yīng)，所以使用甲醇作為提取試劑；加少量的水是因?yàn)橛械臉悠匪州^少，直接加入甲醇，樣品分散性不好，提取效率低，所以先加少量水，使樣品分散后加甲醇，保證方法的回收率。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀法測(cè)定酵素梅中12種非法添加藥物（包括百里香酚酞、雙辛酚丁、4-氯雙醋酚丁、雙丙酚丁、雙戊酚丁、4-氯酚丁、雙丁酚丁、酚汀、雙醋酚丁、雙己酚丁、酚酞、雙庚酚丁）的方法。經(jīng)驗(yàn)證，該方法在基質(zhì)效應(yīng)、線性、檢出限、回收率、重復(fù)性等方面均滿足相關(guān)要求，并且其具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可作為檢測(cè)酵素梅中非法添加12種藥物的方法。

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作者簡(jiǎn)介：李肖斐（1986—），女，遼寧大連人，本科，高級(jí)工程師。研究方向：食品檢測(cè)。