海蘭褐蛋雞痘病毒的分離與鑒定

姜紹全 （山東省海陽市畜牧獸醫(yī)站 265100）

王金亮 秦 燕 （山東省臨沂市動物疫病控制中心）

禽痘病毒病主要發(fā)生于雞和火雞，鴿子偶有發(fā)病，鴨、鵝不易感。不同性別、年齡、品種的雞均易感染。本病一年四季均可發(fā)生，尤以秋季和冬季多發(fā)。病雞脫落的痘痂，為病毒散播的主要形式，皮膚或者粘膜上的傷口、蚊蟲叮咬亦可傳染該病，但不經(jīng)健康皮膚及口腔感染。雞群過于擁擠，雞舍通風不良、陰暗潮濕，雞群打架、啄毛、交配等造成的外傷，雞群感染寄生蟲，營養(yǎng)不良，維生素缺乏，飼養(yǎng)管理差等皆可導(dǎo)致該病的發(fā)生。若繼發(fā)其他感染可引起大批死亡，尤其對雛雞可造成極為嚴重的損失。2014年9月18號，海陽一蛋雞養(yǎng)殖場送檢一批12周齡疑似雞痘病毒感染的海蘭褐蛋雞。本實驗室從流行病學(xué)、解剖學(xué)和實驗室診斷出發(fā)對該病進行了綜合診斷，并成功分離出雞痘病毒。

1 材料與方法

1.1 病料來源 海陽某養(yǎng)殖場的海蘭褐蛋雞群，于12周齡左右一些雞只開始出現(xiàn)消瘦，下痢，精神沉郁，縮頸，食欲減退，個別有呼吸道癥狀，每日發(fā)病數(shù)量呈不斷增長趨勢并伴有零星死亡。剖檢病雞可見肝臟出血，胰臟萎縮，脾臟表面有大小不等的壞死點，喉頭有黃色滲出物;腺胃腫大，腺胃乳頭出血，肌胃角質(zhì)層出現(xiàn)糜爛，肺臟出血。收集病變明顯的肝、脾、肺組織作為病原分離的病料。

1.2 材料與試劑 9～12日齡SPF雞胚購自山東省濟南市家禽研究所，健康成年蛋雞為本實驗室飼養(yǎng)，未接種任何病毒?？股?注射用青霉素鈉、注射用硫酸鏈霉素)購自山東魯抗醫(yī)藥有限公司；PmD18-T 載體試劑盒購自TaKaRa公司；感受態(tài)DH5ɑ細胞由本實驗室制備并保存。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 病料處理 無菌取病雞肝臟、脾臟、肺臟，加入4倍體積的生理鹽水震蕩充分，反復(fù)凍融3次，離心，取上清，加入終濃度為1萬IU的青、鏈霉素，4℃作用4h，待菌檢陰性，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒分離 將上述準備材料接種于9日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜(CAm)，采用側(cè)面“開天窗”法，共接種15枚，每胚接種0.2ml；同時設(shè)置6枚接種等量生理鹽水作為對照。連續(xù)觀察一周，觀察胚的死亡情況及死亡雞胚絨毛尿囊膜變化，棄去24h以內(nèi)的死亡雞胚，收取死亡和未死雞胚的絨毛尿囊膜。將絨毛尿囊膜病料處理，繼續(xù)接種9日齡SPF雞胚，盲傳3代。

1.5 病毒的鑒定 病毒的PCR鑒定。（1）PCR引物設(shè)計：雞痘病毒引物根據(jù)GenBank已發(fā)表序列用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計并由英濰捷基生物有限公司負責合成。引物序列如下：上游引物：ATACTTTACGATACA AACCT，下游引物：GTGCCTATGGAATCTGGT。（2）模板的制備：取第三代死亡雞胚的尿囊膜放于離心管中剪碎，每管加入8ul蛋白酶K 、500ul 10% SDS震蕩混勻，放入56℃水浴鍋中過夜。次日，將消化好的組織離心，取上清約400ul轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積苯酚、氯仿抽提，震蕩充分，12000r/min，離心10min，并重復(fù)此步驟一次。取上清約300ul加入2倍體積的無水乙醇混 勻，-20℃靜置30min，離心棄上清。以預(yù)冷的75%乙醇洗滌2次：12000r/min，離心15min，棄上清，沉淀通風干燥，最后以50ul滅菌雙蒸水溶解。（3）PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為20ul，2×Es Taq mastermix 10ul，上、下游引物各1ul，模板2ul，雙蒸水6ul?；痉磻?yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，54℃30s，72℃30s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀察擴增片段的大小。

1.6 測序鑒定 按照DNA凝膠回收試劑盒的說明回收PCR產(chǎn)物，與PmD 18-T載體連接后，轉(zhuǎn)入DH5ɑ E.coli 感受態(tài)細胞，挑取克隆子進行今夜PCR鑒定，將陽性克隆子送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序，并與GenBank中發(fā)表的相關(guān)序列進行比較。

1.7 動物回歸試驗 按照病料處理方法處理第3代死亡雞胚絨毛尿囊膜，以上清液作雞冠劃痕，每組10只，同時以無菌生理鹽水以相同途徑對對照組作雞冠劃痕。接種后每天觀察接種雞的劃痕處變化及接種雞的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離 傳至第3代時雞胚死亡情況較為嚴重，死亡雞胚絨毛尿囊膜明顯增厚水腫，且尿囊膜上形成灰白色痘斑，而對照組雞胚均生長良好。

2.2 病毒的鑒定 （1）PCR鑒定結(jié)果：利用合成的引物對第3代雞胚絨毛尿囊膜病毒進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳可見在約306bp處有一條帶，與預(yù)期一致(見圖1)。而H9型禽流感病毒，呼腸孤病毒等家禽常見疾病的檢測均為陰性。（2）測序結(jié)果：將擴增引物回收、連接轉(zhuǎn)化、鑒定后測序，結(jié)果顯示，該序列與GenBank中發(fā)表的雞痘病毒p4b核心蛋白基因序列的同源性在90%以上。（3）動物回歸實驗：將病毒上清對健康雞作雞冠劃痕，3～4d時，接種雞的接種部位陸續(xù)出現(xiàn)出現(xiàn)明顯的痘腫；而對照組雞冠劃痕處只有輕微結(jié)痂，無任何病變。

3 討論

圖1 PCR 鑒定電泳圖

禽痘是家禽及鳥類的一種接觸性傳染病，擴散緩 慢。其特征是在羽毛稀少或無毛處有痘疹，或在口腔、咽喉等粘膜處形成纖維素性壞死性偽膜，易在大型雞場造成流行，致使病雞減食、消瘦，蛋雞產(chǎn)蛋下降。雞痘可分為皮膚型、粘膜型、混合型和敗血型。一旦感染禽痘病毒，養(yǎng)殖業(yè)將會蒙受巨大損失，且目前為止禽痘病毒病尚無特效藥物可以治療，故而對該疾病的預(yù)防十分重要。雞痘的預(yù)防除加強雞群的衛(wèi)生、管理等一般性措施外，較為可靠地方法是接種疫苗。接種雞痘疫苗后，應(yīng)于7～8d對接種雞群進行抽查，檢查局部是否結(jié)痂或毛囊有無腫脹。若局部出現(xiàn)反應(yīng)則表示接種成功，否則應(yīng)予補種。本研究結(jié)合臨床癥狀、剖檢變化和實驗室診斷方法對一起疑似雞痘病毒感染的病例進行了確診并成功對雞痘病毒進行了分離鑒定。首先對雞群的發(fā)病情況進行大體了解：發(fā)病雞精神沉郁，食欲減退，消瘦，并伴有零星死亡。剖檢可見胰腺萎縮，腺胃水腫萎縮等癥狀。利用雞痘病毒特異性引物可擴增出于預(yù)期基因片段大小一致的條帶，測序、動物回歸試驗結(jié)果都表明此次病雞確為雞痘病毒感染所致。利用雞胚絨毛尿囊膜方法接種病毒，盲傳3代后收取死胚絨毛尿囊膜，經(jīng)實驗室方法檢測可以確定此次成功分離出了雞痘病毒。