西伯利亞杏花芽酵母cDNA文庫構(gòu)建及質(zhì)量評價(jià)

摘 要：【目的】西伯利亞杏Prunus sibirica是我國重要的生態(tài)兼木本糧油樹種，由于其花期早，易受春季“倒春寒”影響，導(dǎo)致其產(chǎn)量不穩(wěn)，嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究利用西伯利亞杏花芽為材料構(gòu)建酵母雜交cDNA文庫，該文庫可用于西伯利亞杏花芽分化及休眠的轉(zhuǎn)錄因子和互作蛋白的篩選，為今后西伯利亞杏花芽分化及休眠分子調(diào)控機(jī)制研究提供技術(shù)支撐?！痉椒ā恳晕鞑麃喰踊ㄑ糠只靶菝哌^程中15個時(shí)期的花芽為材料，進(jìn)行總RNA提取以及mRNA的分離與純化，并利用SMART同源重組技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫。將cDNA文庫轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞中，即得到cDNA酵母文庫。【結(jié)果】鑒定結(jié)果表明，cDNA文庫庫容為5.24×107 CFU/mL，插入片段長度主要分布在750～2 000 bp，且平均插入長度在1 000 bp以上，重組率為95.83%，24個陽性克隆經(jīng)測序比對后，成功檢測到20個功能注釋基因，其中有3個序列（鈣結(jié)合蛋白CML31、組蛋白H3.3、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ADA2）與植物休眠及低溫脅迫相關(guān)?！窘Y(jié)論】西伯利亞杏花芽分化及休眠過程的酵母雜交cDNA文庫構(gòu)建質(zhì)量較高，具有完整的基因信息，且符合酵母文庫的篩選標(biāo)準(zhǔn)。該文庫的構(gòu)建能夠?yàn)榻馕鑫鞑麃喰踊ㄑ糠只靶菝呦嚓P(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：西伯利亞杏；花芽；酵母雜交；cDNA文庫

中圖分類號：S727.32 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-923X（2025）02-0131-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32360400）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2023YFD220030202，2018YFD1000606-3）。

Construction and quality evaluation of cDNA library of flower bud yeast from Prunus sibirica

CHEN Junxing1，2， BAO Wenquan2， AO Dun2， LIN Yue2， CHEN Yixiao2， YI Ru2， XU Wanyu3， WANG Lin1

（1.Research Institute of Non-Timber Forestry， Chinese Academy of Forestry， Zhengzhou 450003， Henan， China； 2. College of Forestry， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010000， Inner Mongolia， China； 3. College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract：【Objective】Prunus sibirica is an important ecological and woody food and oil tree species in China. Due to its early flowering period， it is susceptible to the freezing damage of spring “inverted spring cold”， which results in unstable yield and seriously restricts the development of its industry. In this study， a yeast hybrid cDNA library was constructed from Prunus sibirica flower buds， which can be used for the molecular regulation of bud differentiation and dormancy and the screening of interacting proteins. The construction of this yeast library can provide technical support for future research on the molecular regulation of bud differentiation and dormancy in Prunus sibirica.【Method】In this study， total RNA was extracted and mRNA was isolated and purified from flower buds of Prunus sibirica during 15 periods of flower bud differentiation and dormancy， and cDNA libraries were constructed by using SMART homologous recombination technology. The cDNA library was transformed into yeast receptor cells to obtain the cDNA yeast library.【Result】The results of quality identification showed that the library capacity of the cDNA library was 5.24×10？ CFU/mL， the length of insert fragments was mainly distributed between 750-2 000 bp， and the average insert length was above 1 000 bp， the recombination rate was 95.83%， and 20 functionally annotated genes were successfully detected in the 24 positive clones by sequencing and comparison， and three of these Three sequences （calcium-binding protein CML31， histone H3.3， and transcriptional regulator ADA2） were related to plant dormancy and low-temperature stress.【Conclusion】The yeast hybrid cDNA library of Prunus sibirica flower buds differentiation and dormancy was constructed with high quality， complete gene information， and met the criteria for yeast library selection. The construction of this library can lay the foundation for analyzing the molecular regulatory network mechanism related to bud differentiation and dormancy in Prunus sibirica.

Keywords： Prunus sibirica； flower buds； yeast hybrid； cDNA library

西伯利亞杏Prunus sibirica為薔薇科Rosaceae李亞科Prunoideae杏屬Armeniaca植物，具有防風(fēng)固沙、耐寒、耐旱、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為我國“三北”地區(qū)固沙保土、涵養(yǎng)水源和荒漠化治理的重要造林樹種[1]；西伯利亞杏不僅在生態(tài)功能上發(fā)揮著重要作用，同時(shí)在食品、醫(yī)療和工業(yè)等領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用，其杏仁中含有豐富營養(yǎng)成分，含油率可達(dá)50%～60%，蛋白質(zhì)含量可達(dá)30%，可用于榨油或加工成食品或飲料[2]。西伯利亞杏仁中含有許多微量元素，如磷、鋅、鈣、硒等，其中硒為世界公認(rèn)的可防癌、抗癌的天然活性物質(zhì)[3]，且其杏仁中含有較豐富的苦杏仁苷（平均5.56%），具有鎮(zhèn)咳消喘、消炎等作用，是良好的中藥材[4]。因此西伯利亞杏是當(dāng)之無愧的生態(tài)兼經(jīng)濟(jì)型樹種。然而西伯利亞杏花芽分化周期長、分化速度不一，且其休眠期短，開花較早，易受到“倒春寒”凍害的影響，導(dǎo)致西伯利亞杏落花落果嚴(yán)重，使得西伯利亞杏產(chǎn)量大幅下降，嚴(yán)重阻礙其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[5]。

花芽分化是植物生長發(fā)育中至關(guān)重要的過程，也是植物生殖發(fā)育的基礎(chǔ)[6]。西伯利亞杏花芽分化主要集中在6—9月[7]。相關(guān)研究表明，花芽分化時(shí)間及休眠時(shí)長可直接影響花期，其中花芽分化是開花的先決條件[8]；花芽休眠則是其遺傳特性[9]。由于對西伯利亞杏花芽分子生物學(xué)的研究起步較晚，花芽分化及休眠解除的分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，因此展開對西伯利亞杏花芽分化及休眠調(diào)控機(jī)制的研究，對于合理調(diào)控花期和提高西伯利亞杏產(chǎn)量具有重要意義。

隨著功能基因組學(xué)研究的逐步深入，基因調(diào)控及互作網(wǎng)絡(luò)分析已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[10]。酵母雜交技術(shù)則是探索基因調(diào)控的重要手段，是一種用于檢測和鑒定互作方式的研究方法，通過對cDNA文庫進(jìn)行篩選，進(jìn)而得到與靶基因互作的蛋白[11]。構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫是高效運(yùn)用酵母雜交技術(shù)的重要前提[12]，該技術(shù)因具有靈敏性高、適用范圍廣被運(yùn)用于眾多領(lǐng)域[13]。相關(guān)研究人員以桃休眠花芽為材料構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫，并通過酵母雜交技術(shù)篩選出與PpDAM6互作的蛋白，從而為更加深入了解PpDAM6如何調(diào)控桃花芽休眠分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)[14]。但目前尚未見到有關(guān)西伯利亞杏花芽分化及休眠酵母雜交cDNA文庫構(gòu)建的報(bào)道，在一定程度上限制了對西伯利亞杏花芽分化及休眠解除的研究進(jìn)展。因此，本研究利用SMART技術(shù)構(gòu)建了高質(zhì)量西伯利亞杏花芽分化及休眠解除時(shí)期的cDNA文庫，該文庫可用于分析西伯利亞杏花芽分化及休眠解除關(guān)鍵調(diào)控基因的互作蛋白篩選等工作，能夠更加深入而系統(tǒng)地了解其分化及休眠調(diào)控機(jī)制，為合理調(diào)控花芽發(fā)分化及休眠進(jìn)程奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)供試材料為內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市良種繁育中心采集的分化開始至休眠解除的西伯利亞杏花芽，采集時(shí)間為2021年6月中旬至2022年4月下旬共計(jì)15個時(shí)期，主要包括未分化期（2021年6月28日）、分化初期（2021年7月3日和2021年7月8日）、花萼分化期（2021年7月27日）、花瓣分化期（2021年8月15日）、雄蕊分化期（2021年9月5日）、雌蕊分化期（2021年9月16日）、雌蕊原基伸長及幼期花藥發(fā)育期（2021年10月7日）、生理休眠期（2021年12月12日和2022年1月13日）、生態(tài)休眠期（2022年1月20日、1月27日和2月18日）、休眠解除期（2022年3月26日）、花芽膨大期（2022年4月16日）。

菌株：大腸桿菌Eschrichia coli菌株TOP10于LB培養(yǎng)液搖菌后保存成20%的甘油菌于-80 ℃冷凍保存。大腸桿菌于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 西伯利亞杏花芽各時(shí)期總RNA的提取及mRNA的純化

以西伯利亞杏花芽分化及休眠解除過程中的15個關(guān)鍵時(shí)期花芽為供試材料，并將每5個時(shí)期的花芽均勻混合，共分為3組。在每組中取2～3 g混合花芽置于液氮中并研磨至粉末狀，采用Trizol法分別對各組西伯利亞杏花芽進(jìn)行RNA提取。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，使用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的質(zhì)量和濃度，并將各組RNA稀釋至200 ng/μL，并在各時(shí)期RNA中取10 μL進(jìn)行混勻。參考VAHTS mRNA Capture Beads利用Oligo（dT）磁珠法對mRNA進(jìn)行純化分離。

1.3 三框cDNA的合成及純化

參照逆轉(zhuǎn)錄說明書將取500 ng純化的mRNA，并向其中加入CDS III/3′ PCR Primer和SMART IV Oligonucleotide各1 μL，補(bǔ)充DEPC H2O至5 μL，將各組分充分混勻置于72 ℃孵育3 min后立即置于冰上；繼續(xù)向上述組分中加入2 μL的5×First-Strand Buffer、1 μL DTT （20 mmol）、1 μL dNTP Mix （10 mmol）、1 μL MMLV Reverse Transcriptase混合均勻，42 ℃ 60 min，然后72 ℃15 min后終止反應(yīng)，待至室溫，加入1 μL RNase H，置于PCR儀中37 ℃ 30 min 即獲得第1鏈cDNA，通過LD-PCR反應(yīng)進(jìn)行第2鏈cDNA合成，取上述單鏈cDNA產(chǎn)物2 μL、2×PCR Mix 25 μL、P1/ P2/P3-F 2 μL、P4-R 2 μL，將各組分混合均勻。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 6 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min后終止反應(yīng)，即得到雙鏈cDNA產(chǎn)物。并采用DNA Clean Beads對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.4 cDNA文庫的均一化

1.4.1 雜 交

參考Trimmer-2 cDNA normalization kit說明書進(jìn)行cDNA均一化處理。取1 mg的雙鏈cDNA，8 μL 2×Hybridization buffer加水至16 μL體系的PCR小管中混勻后均分為4份，置于PCR儀中98 ℃保溫2 min后，迅速將PCR管轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的68 ℃ PCR儀中持續(xù)5 h后進(jìn)行DSN消化。

1.4.2 DSN消化及PCR放大

將DSN master buffer進(jìn)行68 ℃提前預(yù)熱，并取4 μL雜交后的cDNA、5 μL 2×DSN master buffer（68 ℃預(yù)熱）和1 μL的DSN solution（DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control）于4個PCR小管中混勻，置于PCR儀中68 ℃保存25 min，并在各管中加入10 μL 2×DSN stop buffer混勻，室溫下放置5 min后于-20 ℃中保存用于后續(xù)試驗(yàn)。并取5 μL的10×Advantage 2 PCR Buffer、1 μL的50×dNTP Mix、1.5 μL的Primer M1、1 μL的50×Advantage 2 Polymerase Mix，以及1 μL的消化產(chǎn)物（DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control）加水至50 μL，混勻放置在PCR儀中，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、66 ℃ 20 s、72 ℃ 3 min持續(xù)11個循環(huán)。并使用Clontech CHROMA SPIN？+TE-1000 Columns（TAKARA，636079）試劑盒對其進(jìn)行小片段去除。

1.5 雙鏈cDNA與pGADT7同源重組

取2 μL雙鏈cDNA、200 ng pGADT7-vector、4 μL 5×CE II Buffer、2 μL Exnase II溶液并加水至20 μL，置于PCR儀中37 ℃保存30 min后放置于冰上，并向上述反應(yīng)體系中加入2 μL核酸助沉劑，55 μL無水乙醇，吹打均勻，放置于-20 ℃冰箱中保存20 min，取出后13 000 rpm離心15 min，棄去上清液，并加入1 mL 75%無水乙醇洗滌沉淀，8 000 rpm離心2 min，棄去上清液。室溫下晾干5～10 min，加入10 μL TE buffer反復(fù)吸打溶解沉淀，即獲得cDNA文庫。

1.6 西伯利亞杏花芽酵母文庫轉(zhuǎn)化與克隆鑒定

參照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒說明書，取5 μL cDNA文庫質(zhì)粒與100 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行混合，并依次加入Camier DNA（95～100 ℃，5 min，快速冰浴，并重復(fù)一次）10 μL，PEG/LiAc 500 mL并吸打混勻，30 ℃水浴30 min（15 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6～8次），42 ℃水浴15 min（7.5 min時(shí)翻轉(zhuǎn)6～8次），5 000 rpm離心1 min后棄上清液，加入400 μL ddH2O進(jìn)行重懸，離心30 s并棄上清液，再次加入100 μL ddH2O將沉淀吹打均勻，取10 μL菌液稀釋10 000倍后，從中取100 μL均勻的涂布于SD/-Leu平板，30 ℃倒置培養(yǎng)2～4 d后即可獲得酵母文庫轉(zhuǎn)化子。對平板中的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，并完成庫容鑒定。隨機(jī)挑選24個單克隆并參照酵母PCR mix試劑盒說明書（Yeast Colony Rapid DetectionKit，RY8001），對其進(jìn)行PCR反應(yīng)。先吸取3 μL Yeast lysis buffer到PCR管中，用無菌槍頭或牙簽蘸取適量單克隆酵母菌至PCR管中，吸打混勻后，置于98 ℃下反應(yīng)20 min，模板制備完成。另準(zhǔn)備新PCR小管，并配制反應(yīng)體系：每個PCR小管中加入25 μL 2*Yeast PCR mix、1 μL模板、2 μL primer F、2 μL primer R、20 μL ddH2O混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃ 3 min、95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃1 min、共計(jì)28個循環(huán)、72 ℃ 5 min，終止反應(yīng)。用1%瓊脂凝膠電泳檢測插入片段長度，并將陽性克隆送至測序公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行序列對比與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 西伯利亞杏花芽總RNA提取的質(zhì)量評價(jià)

為鑒定所提取的RNA能否用于下游建庫工作，對其進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)檢測，結(jié)果如圖1顯示，主條帶清晰，且28S比18S條帶亮，無明顯彌散現(xiàn)象，表明所提取的RNA完整性好，無降解。利用紫外分光光度計(jì)對RNA進(jìn)行檢測，如表1所示，各時(shí)期RNA濃度及純度較高，綜上所述，總RNA的提取符合建庫工作要求。

2.2 mRNA分離、純化及雙鏈cDNA合成

將提取的各個時(shí)期RNA進(jìn)行mRNA的分離與純化，并將純化的mRNA進(jìn)行雙鏈cDNA的合成。取5 μL純化雙鏈cDNA進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果如圖2所示，純化后的雙鏈cDNA呈現(xiàn)彌散條帶分布，主要富集在100～5 000 bp，表明合成的雙鏈cDNA質(zhì)量較好，符合后續(xù)建庫要求。

2.3 雙鏈cDNA均一化與小片段去除

將西伯利亞杏花芽休眠的3個關(guān)鍵時(shí)期的雙鏈cDNA混樣，并采用雙鏈cDNA均一化和小片段去除的方法來降低因轉(zhuǎn)錄水平差異給文庫篩選及分析帶來的影響。為驗(yàn)證雙鏈cDNA均一化與小片段是否去除成功，在純化后的反應(yīng)液中吸取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示，雙鏈cDNA條帶呈彌散狀態(tài)，主要富集在750～4 000 bp，且無明顯亮帶，說明均一化成功。小于500 bp的條帶幾乎消失，表明小片段去除比較干凈，綜上所述，雙鏈cDNA均一化與小片段去除效果較好，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.4 西伯利亞杏花芽cDNA文庫質(zhì)量分析

將雙鏈cDNA與pGADT7-Rec進(jìn)行重組，并共同轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于SD/-Leu平板上培養(yǎng)2～3 d，即可獲得西伯利亞杏花芽cDNA文庫。cDNA文庫轉(zhuǎn)化成功后，取10 μL酵母轉(zhuǎn)化菌液稀釋10 000倍，從中吸取100 μL涂布于SD/-Leu平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，待長出單菌落并對其個數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4所示，單菌落共計(jì)524個，因此計(jì)算得出文庫的克隆總數(shù)為1.048×10⁸個，庫容為5.24×10⁷ CFU/mL>1×10⁶ CFU/mL，表明構(gòu)建的cDNA文庫包含的基因信息較完整，文庫質(zhì)量較好，覆蓋度較廣，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.5 cDNA文庫插入片段大小及重組率鑒定

為了檢測文庫重組序列的完整性，在平板上隨機(jī)挑選24個單克隆進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳（圖5）擴(kuò)增出23個條帶，由此計(jì)算得出cDNA文庫重組率為95.83%，且插入片段大小主要集中于750～2 000 bp，表明所構(gòu)建的cDNA文庫多態(tài)性較好，空載率較低，cDNA重組序列的完整性較好。

2.6 酵母文庫構(gòu)建質(zhì)量評價(jià)

將PCR產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果提交至NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行對比分析后闡述其基因功能，結(jié)果如表2所示。共成功檢測到20個功能注釋基因，分別為超氧化物歧化酶（銅-鋅）、磷脂酰磷脂酶C2類、磷酸葡聚糖磷酸酶LSF2、假定核酸酶HARBI1、肌鈣蛋白還原酶同源物、蛋白酶體亞基α-7型、ATP合酶亞基、新生多肽相關(guān)復(fù)合體亞基α樣蛋白、ALPHA亞復(fù)合物亞基、含CRAL-TRIO結(jié)構(gòu)域的類YKL091C蛋白、質(zhì)膜相關(guān)陽離子結(jié)合蛋白、金屬硫蛋白、鈣結(jié)合蛋白CML31、組蛋白H3.3、TMV抗性蛋白、核糖體蛋白S3a-2、核糖體蛋白S2-4、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ADA2。

3 討論與結(jié)論

西伯利亞杏花芽分化和休眠是果樹生長發(fā)育中十分重要的階段，是形成產(chǎn)量的基礎(chǔ)[15]。研究其發(fā)生規(guī)律，對生產(chǎn)中合理調(diào)控花期，進(jìn)而保證花的質(zhì)量，提高果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)等具有重要意義[16]。目前有關(guān)花芽分化及休眠分子調(diào)控的研究大多集中在基因挖掘等方面，并圍繞候選基因在花芽分化及休眠解除等過程中的表達(dá)及功能層面進(jìn)行鑒定[17]，但其關(guān)鍵基因的作用機(jī)制及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的研究仍然十分有限。隨著科技水平的發(fā)展，利用酵母雜交技術(shù)可實(shí)現(xiàn)篩選與候選基因互作的靶蛋白[18]，這一方法可為深入探究花芽分化及休眠解除機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)或提供廣泛研究思路，而構(gòu)建一個高質(zhì)量的酵母雜交cDNA文庫是實(shí)現(xiàn)構(gòu)建西伯利亞杏花芽分化及休眠網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制的基本前提。

文庫質(zhì)量的鑒定標(biāo)準(zhǔn)通常由其插入片段大小、重組率和庫容等方面共同決定[19]。文庫庫容一般指原始cDNA中所包含的獨(dú)立重組基因數(shù)量，且?guī)烊莺恳话愦笥?×10⁶ CFU/mL才能確保低豐度mRNA的篩選工作[20]。本研究通過SMART擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建的cDNA文庫庫容為5.24×10？ CFU/mL大于1×10⁶ CFU/mL，符合文庫的庫容標(biāo)準(zhǔn)。插入片段大小也是衡量文庫質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)，一般情況下，植物cDNA文庫片段長度應(yīng)在500～3 000 bp，當(dāng)文庫插入片段大小無限接近c(diǎn)DNA全長時(shí)才能體現(xiàn)cDNA文庫的完整遺傳信息[21]，本研究的文庫插入片段大小在750～2 000 bp，符合建庫要求；重組率指cDNA文庫中插入片段在克隆中所出現(xiàn)的比率，一般情況該重組率應(yīng)大于90%，若重組率過低則表明出現(xiàn)空載的頻率較高，從而大大降低篩庫的工作效率[22]，本研究中重組率達(dá)到95.83%，表明文庫構(gòu)建效果符合應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，本研究所構(gòu)建的cDNA文庫構(gòu)建質(zhì)量效果較好，能夠滿足后續(xù)篩庫試驗(yàn)要求。

cDNA文庫的完整性以及覆蓋度也是揭示建庫質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。因此，為保障所建文庫涵蓋了整個花芽分化及休眠進(jìn)程的完整信息，并進(jìn)一步對該文庫進(jìn)行驗(yàn)證，將陽性單克隆進(jìn)行測序比對，進(jìn)而驗(yàn)證此cDNA文庫的完整性。目前已有研究通過酵母雜交cDNA文庫篩選，從而獲得與花芽分化或休眠調(diào)控相關(guān)的蛋白。例如趙亞林[23]在對桃花芽休眠調(diào)控相關(guān)基因PpDAM6進(jìn)行研究時(shí)，對其文庫進(jìn)行篩選共獲得了15個與PpDAM6休眠調(diào)控相關(guān)的潛在互作蛋白；高彩[24]對蘋果花芽發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因MdNF-YB18進(jìn)行功能驗(yàn)證時(shí)，通過對花芽發(fā)育時(shí)期cDNA文庫進(jìn)行篩選，獲得了148個與MdNF-YB18的互作蛋白，經(jīng)鑒定分析得到7個與蘋果花芽分化相關(guān)的蛋白。本研究對西伯利亞杏花芽cDNA文庫進(jìn)行鑒定分析，篩選出了鈣結(jié)合蛋白CML31、組蛋白H3.3、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ADA2等。Leida等[25]在對不同休眠習(xí)性的桃品種進(jìn)行芽休眠調(diào)控基因的篩選中發(fā)現(xiàn)組蛋白H3修飾與休眠相關(guān)基因（PpDAM6）存在互作關(guān)系，進(jìn)而共同調(diào)控桃花芽休眠進(jìn)程；CMLs是一類與Ca+結(jié)合相關(guān)的蛋白，目前已經(jīng)在多種植物中鑒定了CMLs基因，并參與到植物的非生物、激素脅迫響應(yīng)中[26]，相關(guān)研究表明鈣離子通過GA和ABA途徑調(diào)節(jié)休眠解除進(jìn)程[27]；ADA2是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，擬南芥ADA2和耐寒相關(guān)基因CBF1存在互作關(guān)系，且CBF1轉(zhuǎn)錄需要ADA2的激活促進(jìn)其表達(dá)，共同參與調(diào)控?cái)M南芥的生長發(fā)育[28]；由此可見，在本物種中可能會由通過組蛋白H3、Ca+結(jié)合蛋白以及ADA2等轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控西伯利亞杏花芽分化及休眠解除進(jìn)程，在后續(xù)的研究工作中，這些基因也可作為調(diào)控花芽分化及休眠解除進(jìn)程的候選基因而重點(diǎn)分析。

綜上所述，本研究構(gòu)建的cDNA文庫在質(zhì)量、完整性、覆蓋度等方面均符合后續(xù)酵母雜交篩選的要求，可為解析西伯利亞杏花芽分化、休眠分子調(diào)控機(jī)制和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

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[本文編校：吳 彬]