銀杏內(nèi)酯B介導(dǎo)IKK/NF-κB通路對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控作用

摘 要：為探究銀杏內(nèi)酯B對(duì)人肺腺癌（A549）細(xì)胞增殖和凋亡的影響及IκB激酶/核因子κB（IKK/NF-κB）信號(hào)通路的調(diào)控作用，體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，將其分為對(duì)照組（相同體積二甲基亞砜溶劑）和不同濃度（4、8、16、32 μmol/L）銀杏內(nèi)酯B組，干預(yù)24 h，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活力篩選最適濃度的銀杏內(nèi)酯B用于后續(xù)試驗(yàn)。隨后將A549細(xì)胞分為對(duì)照組、銀杏內(nèi)酯B組（16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B）、陽(yáng)性藥物組（0.4 mg/L阿霉素）、抑制劑組（16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B+10 μmol/L IKK/NF-κB通路抑制劑BAY11-7082）和激活劑組（16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B+1 μmol/L IKK/NF-κB通路激活劑Prostratin），干預(yù)24 h。5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（EdU）測(cè)定細(xì)胞增殖能力；Hoechst 33258染色試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡能力；蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）及IKK/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。根據(jù)CCK-8試驗(yàn)結(jié)果，選擇16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B用于后續(xù)試驗(yàn)。與對(duì)照組比較，銀杏內(nèi)酯B組和陽(yáng)性藥物組A549細(xì)胞增殖率、CyclinD1、p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα比值顯著降低（Plt;0.05），凋亡率和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.05）；與銀杏內(nèi)酯B組比較，抑制劑組細(xì)胞增殖率、CyclinD1、p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα比值顯著降低（Plt;0.05），凋亡率和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.05），激活劑組細(xì)胞增殖率、CyclinD1、p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα比值顯著升高（Plt;0.05），凋亡率和Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.05）。銀杏內(nèi)酯B能通過調(diào)控IKK/NF-κB通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制A549細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。

關(guān)鍵詞：肺腺癌；銀杏內(nèi)酯B；IκB激酶/核因子κB信號(hào)通路；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R730" " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A " " DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.01.010

Abstract： To investigate the effect of ginkgolide B on the proliferation and apoptosis of human lung adenocarcinoma （A549） cells and the regulatory effect of IκB kinase/nuclear factor κB （IKK/NF-κB） signaling pathway. A549 cells were cultured in vitro and divided into control group （same volume DMSO solvent） and different concentrations （4， 8， 16， 32 μmol/L） of ginkgolide B group. After 24 hours of intervention， cell counting kit-8 （CCK-8） was used to detect cell viability to screen the optimal concentration of ginkgolide B for subsequent experiments. Then A549 cells were divided into control group， ginkgolide B group （16 μmol/L ginkgolide B）， positive drug group （0.4 mg/L adriamycin）， inhibitor group （16 μmol/L ginkgolide B+10 μmol/L IKK/NF-κB pathway inhibitor BAY11-7082） and activator group （16 μmol/L ginkgolide B+1 μmol/L IKK/NF-κB pathway activator Prostratin）， intervention for 24 hours. 5-ethynyl-2′-deoxyuridine （EdU） was used to measure cell proliferation. Hoechst 33258 staining kit was used to detect cell apoptosis. Western blot （WB） was used to detect the expression levels of CyclinD1， Caspase-3 and IKK/NF-κB pathway-related proteins. According to the results of CCK-8 experiment， 16 μmol/L ginkgolide B was selected for subsequent experiments. Compared with the control group， the proliferation rate of A549 cells and the protein expression levels of CyclinD1， p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-IκBα/IκBα in the ginkgolide B group and the positive drug group significantly decreased （Plt;0.05）， and the apoptosis rate and Caspase-3 protein expression level significantly increased （Plt;0.05）. Compared with ginkgolide B group， cell proliferation rate， CyclinD1， p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-IκBα /IκBα ratio significantly decreased in inhibitor group （Plt;0.05）， while apoptosis rate and Caspase-3 protein expression level significantly increased （Plt;0.05）. In the activator group， cell proliferation rate， CyclinD1， p-NF-κB p65/NF-κB p65 and p-IκBα/IκBα ratios significantly increased （Plt;0.05）， while apoptosis rate and Caspase-3 protein expression levels significantly decreased （Plt;0.05）. Ginkgolide B can inhibit the proliferation and induce apoptosis of A549 cells by regulating IKK/NF-κB pathway signaling.

非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer）屬于臨床常見腫瘤，其中以肺腺癌（lung adenocarcinoma）為主，具有初期隱匿性強(qiáng)，后期進(jìn)展快的特點(diǎn)，且肺腺癌侵襲周圍組織和轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官能力較強(qiáng)［1-2］。因此，臨床亟需尋找新的生物標(biāo)志物或治療手段對(duì)肺腺癌進(jìn)行有效治療。中醫(yī)認(rèn)為肺腺癌與“痰”“淤”“毒”等相關(guān)，其發(fā)病是因痰毒瘀滯而致；治療則應(yīng)攻伐癌毒、理氣行滯、化痰活血等為主［3-4］。銀杏內(nèi)酯B是從銀杏葉中分離的二萜類化合物，具有抗腫瘤、抗血小板聚集、抗炎和清除自由基等多種藥理活性。有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B能抑制口腔癌［5］、胰腺癌［6］和膀胱癌［7］等癌細(xì)胞惡性發(fā)展進(jìn)程。IκB激酶/核因子κB（IκB kinase/nuclear factor κB，IKK/NF-κB）通路普遍存在于細(xì)胞中，與細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥進(jìn)展密切相關(guān)。研究顯示，粉防己堿可調(diào)控NF-κB通路活化抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［8］。然而，目前尚不清楚銀杏內(nèi)酯B是否可以通過調(diào)控IKK/NF-κB信號(hào)通路影響肺腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。本試驗(yàn)通過研究銀杏內(nèi)酯B對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討IKK/NF-κB信號(hào)通路在其中的調(diào)控作用，旨在為治療肺腺癌提供新方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肺腺癌（A549）細(xì)胞來源于上海致備生物科技有限公司。

1.1.2 主要藥品與試劑

阿霉素（adriamycin）、銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，純度≥98%，北京伊塔生物科技有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、F12K培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），IKK/NF-κB通路抑制劑BAY11-7082和激活劑Prostratin（美國(guó)MCE公司，純度≥98%），Hoechst 33258染色試劑盒（北京蘭博利德商貿(mào)有限公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）（上海炎熙生物科技有限公司），5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2′-deoxyuridine，EdU）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），二喹啉甲酸（diquinolinic acid，BCA）蛋白試劑盒（英國(guó)Abcam公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（二抗）及鼠抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine protease 3，Caspase-3）、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白α（NF-κB inhibitor protein alpha，IκBα）、p-IκBα及β-actin一抗（英國(guó)Abcam公司）。

1.1.3 主要儀器

倒置熒光顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：WMS-1033）；低溫高速離心機(jī)（山東博科醫(yī)用材料有限公司，型號(hào)：TGL-16M）；凝膠成像系統(tǒng)（廣州市廣儀儀表有限公司，型號(hào)：OI1000）；二氧化碳培養(yǎng)箱（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司，型號(hào)：D180）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 A549細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇人肺腺癌A549細(xì)胞，加F12K培養(yǎng)基（含10% FBS），于37℃培養(yǎng)箱（5% CO2）培養(yǎng)，2～3 d換液一次，細(xì)胞密度超80%后傳代用于試驗(yàn)。

1.2.2 分組與干預(yù)

A549細(xì)胞分為對(duì)照組（相同體積的二甲基亞砜溶劑）和不同濃度（4、8、16、32 μmol/L）銀杏內(nèi)酯B組。對(duì)照組不做干預(yù)，不同濃度銀杏內(nèi)酯B組是分別加4、8、16、32 μmol/L銀杏內(nèi)酯B進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)24 h。用CCK-8檢測(cè)篩選最適濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，分組包括對(duì)照組、陽(yáng)性藥物組、銀杏內(nèi)酯B組、抑制劑組和激活劑組。銀杏內(nèi)酯B組是加16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B，陽(yáng)性藥物組是加0.4 mg/L阿霉素［9］，抑制劑組是在16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B的基礎(chǔ)上加10 μmol/L BAY11-7082［10］，激活劑組是在16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B的基礎(chǔ)上加1 μmol/L Prostratin［11］，藥物干預(yù)24 h，復(fù)孔為3個(gè)。

1.2.3 CCK-8法測(cè)定A549細(xì)胞活力

設(shè)空白組（無細(xì)胞，只含完全培養(yǎng)基），按細(xì)胞密度為8×103個(gè)/孔接種至96孔板，各組細(xì)胞干預(yù)后，各孔加10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)2 h，通過測(cè)量波長(zhǎng)450 nm處的光密度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞活力，即不同濃度銀杏內(nèi)酯B組OD值與空白組OD值差值占對(duì)照組和空白組OD值差值的百分比。

1.2.4 EdU法測(cè)定A549細(xì)胞的增殖率

各組細(xì)胞除去培養(yǎng)液后用4%多聚甲醛固定15 min，除去（0.3% TritonX-100，0.5 mL）BSA，室溫孵育10 min。加200 μL Click反應(yīng)液（現(xiàn)配現(xiàn)用），避光孵育30 min，加0.5 mL Hoechst 33342避光孵育10 min；去除Hoechst 33342（BSA洗），熒光顯微鏡拍照。增殖率即紅色/藍(lán)色細(xì)胞數(shù)的百分比。試驗(yàn)過程中每一步結(jié)束后均需使用3% BSA洗滌3次，孵育均需室溫進(jìn)行。

1.2.5 Hoechst 33258法測(cè)定A549細(xì)胞凋亡率

各組細(xì)胞用磷酸鹽平衡生理鹽水（phosphate balances saline，PBS）洗滌10 min，4%多聚甲醛固定10 min。Hochest 33258染色（5 mg/L，10 min），封固后用熒光顯微鏡隨機(jī)選3個(gè)視野進(jìn)行拍照。試驗(yàn)過程中每一步結(jié)束后均需使用3% BSA洗滌3次。凋亡細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)出以下狀態(tài)：細(xì)胞核呈亮藍(lán)色、濃縮、變小、染色不均等。凋亡率為凋亡細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)百分比。

1.2.6 蛋白免疫印跡（Western blotting，WB）法檢測(cè)A549細(xì)胞中IKK/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白、CyclinD1、Caspase-3水平

各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取、定量、上樣和凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜封閉（脫脂牛奶法），添加一抗（β-actin、CyclinD1、Caspase-3、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα）在4℃孵育過夜，對(duì)二抗（山羊抗鼠IgG）進(jìn)行稀釋后孵育2 h，BCIP/NBT工作液染色，室溫避光孵育0.5 h后進(jìn)行圖片采集（凝膠成像系統(tǒng)），內(nèi)參即β-actin。目的蛋白/β-actin即為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用GraphPad Prism 8軟件作圖，利用Image J軟件分析細(xì)胞增殖、凋亡和灰度值，對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，利用Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，利用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，Plt;0.05即有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)A549細(xì)胞活力的影響

不同濃度（4、8、16、32 μmol/L）銀杏內(nèi)酯B組A549細(xì)胞活力較對(duì)照組A549細(xì)胞活力下降，其中4 μmol/L銀杏內(nèi)酯B組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），其余濃度的銀杏內(nèi)酯B組有差異（Plt;0.05），16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B組效果最好，故后續(xù)試驗(yàn)選16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B為最適濃度。具體數(shù)據(jù)見圖1。

與對(duì)照組比較，*Plt;0.05。4、8、16、32 μmol/L組分別代表4、8、16、32 μmol/L銀杏內(nèi)酯B組。

Compared with control group， *Plt;0.05. 4， 8， 16 and 32 μmol/L groups represented groups 4， 8， 16 and 32 μmol/L ginkgolide B groups， respectively.

2.2 各組A549細(xì)胞增殖能力的比較

與對(duì)照組［（42.39±2.62）%］相比，銀杏內(nèi)酯B組［（27.51±0.94）%］和陽(yáng)性藥物組［（28.38±1.01）%］增殖率減少（Plt;0.05）；與銀杏內(nèi)酯B組相比，抑制劑組［（21.38±1.01）%］增殖率減少（Plt;0.05），而激活劑組［（39.66±1.02）%］增殖率增加（Plt;0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖2。

2.3 各組A549細(xì)胞凋亡能力的比較

對(duì)照組細(xì)胞為淡藍(lán)色，形態(tài)清晰，細(xì)胞核彌散，較均勻；其他各組細(xì)胞核，核呈亮藍(lán)色、變小、熒光強(qiáng)、染色不均。量化后發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B組［（27.84±1.41）%］和陽(yáng)性藥物組［（29.84±1.61）%］凋亡率相較對(duì)照組［（16.84±1.05）%］增加（Plt;0.05）；抑制劑組［（34.92±0.85）%］凋亡率相較銀杏內(nèi)酯B組增加（Plt;0.05），激活劑組［（17.84±1.14）%］凋亡率則減少（Plt;0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖3。

2.4 各組A549細(xì)胞CyclinD1和Caspase-3蛋白水平

銀杏內(nèi)酯B組和陽(yáng)性藥物組CyclinD1蛋白水平相較對(duì)照組減少（Plt;0.05），Caspase-3蛋白水平增多（Plt;0.05）；抑制劑組CyclinD1蛋白水平相較銀杏內(nèi)酯B組減少（Plt;0.05），Caspase-3蛋白水平增加（Plt;0.05）；激活劑組A549細(xì)胞CyclinD1蛋白水平升高（Plt;0.05），Caspase-3蛋白水平降低（Plt;0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖4。

2.5 各組A549細(xì)胞IKK/NF-κB通路關(guān)鍵蛋白水平

銀杏內(nèi)酯B組和陽(yáng)性藥物組較對(duì)照組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα比值顯著降低（Plt;0.05）；抑制劑組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα比值相較銀杏內(nèi)酯B組下降（Plt;0.05），激活劑組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα比值上升（Plt;0.05）（圖5）。

3 討論

肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌的一類，其生物學(xué)過程復(fù)雜多變，涉及多種因素的調(diào)控，傳統(tǒng)治療手段由于特異性差和耐藥性導(dǎo)致治療效果有限［12-13］。因此，尋找高效、安全的治療方式有重要意義。中醫(yī)認(rèn)為“寒濕”是肺腺癌發(fā)生的主要病因，補(bǔ)腎活血、健脾祛濕是治療該病的關(guān)鍵［14-15］。銀杏內(nèi)酯B是從銀杏葉中分離出來的有效活性成分之一，近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B具有健脾祛濕的功效，且還有很強(qiáng)的抗腫瘤作用［16-17］。有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B通過阻斷肺腺癌細(xì)胞增殖周期和上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)水平抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡［18］。但是目前關(guān)于銀杏內(nèi)酯B影響肺腺癌的作用機(jī)制尚不完全明確。基于此，本研究利用不同濃度銀杏內(nèi)酯B干預(yù)A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8、16、32 μmol/L銀杏內(nèi)酯B能顯著抑制A549細(xì)胞的活性，且16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B抑制細(xì)胞活力的效果最好，因此選擇16 μmol/L銀杏內(nèi)酯B用于后續(xù)試驗(yàn)。后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B組增殖率、CyclinD1蛋白水平比對(duì)照組低，A549細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白水平增加，提示銀杏內(nèi)酯B可抑制A549細(xì)胞增殖，促使其凋亡。在李雅靜等［18］研究結(jié)果中也指出，銀杏內(nèi)酯B對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖與凋亡有一定影響，均表明銀杏內(nèi)酯B有抗肺腺癌作用，有較好的研究前景。

IKK/NF-κB信號(hào)通路是一種轉(zhuǎn)錄因子，其異?；罨c癌癥的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。經(jīng)典的NF-κB通路多由促炎因子及脂多糖刺激IKK復(fù)合體，磷酸化IκB活化IKK/NF-κB通路，NF-κB游離二聚體與脫氧核糖核酸結(jié)合，最終啟動(dòng)相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，參與免疫、炎癥、細(xì)胞存活；非經(jīng)典的NF-κB通路通過激活I(lǐng)κB kinase-α介導(dǎo)p50/p52 NF-κB二聚體活化，從而參與B細(xì)胞成熟、淋巴器官發(fā)生、體液免疫［19］。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過下調(diào)NF-κB p65蛋白和mRNA的表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡［20］。顧文謹(jǐn)?shù)龋?1］研究結(jié)果表明，牡荊苷通過調(diào)控NF-κB通路對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖與遷移有一定影響。另有研究發(fā)現(xiàn)，銀杏內(nèi)酯B通過抑制NF-κB信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡，認(rèn)為銀杏內(nèi)酯B可以成為治療胰腺癌相關(guān)疾病的潛在靶向藥物［6］。但關(guān)于銀杏內(nèi)酯B對(duì)肺腺癌細(xì)胞中IKK/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用鮮有報(bào)道。因此，本研究用銀杏內(nèi)酯B干預(yù)A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，銀杏內(nèi)酯B組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα的比值降低，提示銀杏內(nèi)酯B能夠阻滯A549細(xì)胞IKK/NF-κB通路活性。為了驗(yàn)證銀杏內(nèi)酯B能否通過IKK/NF-κB通路對(duì)肺腺癌產(chǎn)生影響，隨后在銀杏內(nèi)酯B的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用IKK/NF-κB通路抑制劑BAY11-7082和激活劑Prostratin，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與銀杏內(nèi)酯B組相比，抑制劑組A549細(xì)胞增殖率、CyclinD1蛋白水平進(jìn)一步降低，凋亡率和Caspase-3蛋白水平進(jìn)一步升高，而激活劑組則與抑制劑組結(jié)果趨勢(shì)相反。這一研究結(jié)果與劉劍等［20］利用白藜蘆醇在肺腺癌細(xì)胞中的研究結(jié)果相符，與Lou等［6］研究銀杏內(nèi)酯B在胰腺癌中的作用及相關(guān)機(jī)制一致。以上結(jié)果均可說明，銀杏內(nèi)酯B能夠通過抑制IKK/NF-κB通路抑制A549細(xì)胞的增殖能力，并誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B能通過調(diào)控IKK/NF-κB通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制A549細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。本研究主要為銀杏內(nèi)酯B的體外研究，另是否可通過其他途徑對(duì)A549細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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收稿日期：2024-04-07；修回日期：2024-04-21。

作者簡(jiǎn)介：徐林艷，碩士，主要從事呼吸方向的研究。

基金項(xiàng)目：湖南省殘聯(lián)康復(fù)課題項(xiàng)目（2023XK0312）。

*通信作者：曾怡蘭，主管護(hù)師，主要從事呼吸方向的研究。E-mail： 675292676@qq.com。