?羧甲基茯苓多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其抗氧化作用

摘要：為探究羧甲基茯苓多糖（Carboxymethyl Pachymaran，CMP）的結(jié)構(gòu)表征及其抗氧化作用，以CMP為試驗(yàn)材料，并對其分離純化后的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和抗氧化作用檢測。結(jié)果表明，CMP經(jīng)二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纖維素離子交換層析柱純化后得到兩種組分CMP0和CMP5。將主要成分CMP5用葡聚糖凝膠G-100層析柱純化，結(jié)合紫外分光光度測定法、傅里葉紅外光譜法和高效凝膠滲透色譜法等方法對其結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，CMP5的多糖含量為92.07%，分子量為75.724 kDa，紅外光譜檢測出糖類特征峰與羧甲基基團(tuán)特征峰，單糖組成分析表明CMP5是一種葡聚糖。以CMP5的DPPH清除率、羥基自由基的清除能力、總還原能力和Fe2+螯合能力作為其體外抗氧化作用的檢測指標(biāo)，檢測結(jié)果顯示，CMP5對DPPH自由基清除率為58.25%，對羥基自由基清除率為55.41%，對Fe2+螯合率為39.89%。綜上所述，CMP5 具有較好的抗氧化作用，是一種潛在的抗氧化劑。

關(guān)鍵詞：茯苓；羧甲基茯苓多糖；分離純化；結(jié)構(gòu)表征；抗氧化作用

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）01-0064-07

Separation， Purification， Structural Characterization， and Antioxidant Activity Measurement of Carboxymethyl Pachymaran

XU Yi-xian1，YANG Hua1，GUAN Gui-ping1，WANG Hong-bing2

（1. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Institute of

Animal and Veterinary Science， Changsha 410131， PRC）

Abstract： This study aims to investigate the structural characteristics and antioxidant activity of carboxymethyl pachymaran （CMP）. With CMP as the test material， the isolated and purified components were detected for their structural characteristics and antioxidant activity. CMP was purified by diethylaminoethyl （DEAE） cellulose ion-exchange chromatography to give two components， CMP0 and CMP5. Subsequently， CMP5 was purified by dextran gel G-100 chromatography， and the structural characterization was conducted by UV spectrophotometry， Fourier infrared spectroscopy， and high-performance gel permeation chromatography. The results showed that the polysaccharide content and molecular weight of CMP5 were 92.07% and 75.724 kDa， respectively. The characteristic peaks of sugar and carboxymethyl group were detected by infrared spectroscopy， and the monosaccharide composition analysis suggested that CMP5 was a dextran. The DPPH free radical scavenging rate， hydroxyl radical scavenging rate， total reducing capacity， and Fe2+ chelating capacity were used as indicators for assessing the antioxidant activity of CMP5 in vitro. The results showed that CMP5 had the DPPH free radical scavenging rate， hydroxyl radical scavenging rate， and Fe2+ chelating rate of 58.25%， 55.41%， and 39.89%， respectively. In summary， CMP5 has good antioxidant activity and is a potential antioxidant.

Key words： Poria cocos; carboxymethyl pachymaran; separation and purification; structural characterization; antioxidant activity

茯苓是一種干燥、可食用的菌核，來自于真菌茯

苓（Poria cocos （Schw.）Wolf），是一種著名的中藥材[1]。

當(dāng)代藥理學(xué)研究表明，茯苓的化學(xué)成分包括三萜類化合物、多糖、類固醇和多種微量元素等，其中多糖類成分約占干物質(zhì)重的70%～90%[2]。茯苓中提取的多糖稱為茯苓多糖（Poria cocos Polysaccharides，PCP），包括活性較高的水溶性多糖和活性較差的堿性多糖[3]。由于茯苓多糖水溶性較差，可利用率低，故對其進(jìn)行羧甲基化改性，羧甲基化后得到的羧甲基茯苓多糖（Carboxymethyl Pachymaran，CMP）具有很好的水溶性[4]。羧甲基茯苓多糖具有多種生理活性，如增強(qiáng)免疫力[5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗病毒[9]等。在諸多文章中報道了羧甲基茯苓多糖具有生物活性高，毒性低，不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)，在藥食領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，因此將羧甲基茯苓多糖作為潛在的天然抗氧化劑進(jìn)行研究。

多糖的成分比較復(fù)雜，但大多數(shù)學(xué)者對羧甲基茯苓多糖抗氧化的研究都是使用粗多糖來進(jìn)行，使用分離純化后的多糖及其抗氧化作用的研究較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用二乙氨基乙基（diethylaminoethyl，DEAE）纖維素離子交換層析柱和葡聚糖凝膠G-100（Sephadex"G-100）層析柱分離純化羧甲基茯苓粗多糖[10]，并對分離純化后組分的化學(xué)組成和體外抗氧化作用進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

羧基甲基茯苓粗多糖（CMP）由湖南補(bǔ)天藥業(yè)有限公司提供；DEAE-52、Sephadex G-100（北京索萊寶科技有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH，MedChemexpress生物科技公司）；菲啰嗪[3-（2-吡啶基）-5，6-二苯基-1，2，4-三嗪-4'，4''-二磺酸鈉鹽，上海易恩化學(xué)藥劑有限公司]；鹽酸、碳酸氫鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、磷酸、三氯乙酸、三氯化鐵等均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 主要儀器

高速冷凍離心機(jī)（CR21G，天美科技有限公司）；可見分光光度計（V-5000，上海元析儀器有限公司）；真空冷凍干燥機(jī)（YT-10，上海精其設(shè)備有限公司）；離子色譜儀（ICS5000，賽默飛世爾科技公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（101-1BS，力辰科技有限公司）；氮吹儀（UGC-24M，力辰科技有限公司）；離心機(jī)（D-37520，賽默飛世爾科技公司）；紅外光譜儀（FT-IR650，天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；串聯(lián)凝膠柱[105-103-101（8×300 mm ），BRT]；示差檢測器（RI-20A，島津公司）；高效液相色譜儀（LC-10A，島津公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的取代度及含糖量測定 參考林標(biāo)聲[11]的方法對CMP的取代度進(jìn)行檢測，精確稱取0.5 g干燥至恒重的 CMP 于250 mL容量瓶中，取50 mL 0.1mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液于容量瓶中，使其完全溶解，用0.1 mol/L HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，同時測量 pH 值，根據(jù)公式計算CMP 的取代度。

2.1時滴定所消耗的 HCL 的體積；V2：pH=4.3時滴定所消耗的 HCL 的體積；W：樣品重量；M：HCL 濃度；參考符玉霞[12]的方法，多糖含量測定方法采用苯酚-硫酸法。

1.3.2 DEAE-52分離純化對DEAE-52進(jìn)行預(yù)處理后，用去離子水平衡24 h。配制18 mg/mL CMP溶液，去除分離柱上層多余的去離子水，加入1.0 mL配好的CMP溶液到層析柱內(nèi)，依次用去離子水和不同濃度梯度的NaCl溶液（0.1～1.0 mol/L）洗脫，控制流速為1.0 mL/min，每管收集5.0 mL，共收集50管。采用苯酚-硫酸法檢測每管洗脫液的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制管數(shù)-吸光度的洗脫曲線。收集不同濃度NaCl溶液洗脫下來的洗脫液，進(jìn)行透析，透析結(jié)束后冷凍干燥。

1.3.3 葡聚糖凝膠純化 將冷凍干燥得到的多糖復(fù)溶成18 mg/mL的多糖溶液，取1.0 mL均勻滴加至葡聚糖凝膠分離純化柱內(nèi)，用去離子水洗脫，控制流速為0.5 mL/min，每管5.0 mL，共收集40管。用苯酚-硫酸法檢測每管吸光度，并繪制管數(shù)-吸光度的洗脫曲線，將收集液濃縮，冷凍干燥并儲存。代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算分離純化后各組分的得率及含糖量。

1.3.4 分子量測定通過高效凝膠滲透色譜法（High Performance Gel Permeation Chromatography，HPGPC）

測定純化多糖分子量和純度，使用 BRT105-103-101 串聯(lián)凝膠柱和RID-20A示差檢測器，在0.05 M NaCl溶液，流速：0.8 mL/min，柱溫：40℃，進(jìn)樣量：25 μL的條件下洗脫。精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品（葡聚糖）各5 mg，溶解于1 mL流動相溶液中，配制成5 mg/mL溶液，用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾隨后上機(jī)得出保留時間，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用同樣的方法對純化多糖進(jìn)行處理，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖分子量。

1.3.5 紅外光譜掃描分析 通過傅里葉變換紅外光譜儀 FT-IR650（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）掃描分析多糖的官能團(tuán)，參考 Yang[13]等的方法。

精密稱取純化多糖2 mg和溴化鉀200 mg，混勻、研磨，并壓制成片，空白對照采用溴化鉀粉末壓片而成。分別置于4 000～400 cm-1的頻率范圍內(nèi)進(jìn)行掃描測量。

1.3.6 單糖組成分析精密稱量5 mg純化多糖置于安瓿瓶中，加入3 mol/L TFA 2 mL，120 ℃水解3 h。準(zhǔn)確吸取酸水解溶液轉(zhuǎn)移至管中氮吹吹干，加入5 mL水渦旋混勻，使用 Dionex CarbopacTM PA20 色譜柱，在流動相A：H2O，B：15mmol/L NaOH，C：15 mmol/L"NaOH+100 mmol/L NaAc，流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量25 μL；柱溫30℃的條件下進(jìn)行洗脫。其他單糖標(biāo)品操作方法同上。根據(jù)絕對定量方法，測定不同單糖質(zhì)量，根據(jù)單糖摩爾質(zhì)量計算出摩爾比。

1.3.7 抗氧化作用檢測

（1）DPPH自由基清除能力測定。將CMP、純化多糖準(zhǔn)確配制成1 000、2 000、3 000、4 000、5 000"μg/mL的溶液用無水乙醇將DPPH配置成40 μg/mL的溶液。在試管中分別加入2.0 mL不同濃度的CMP溶液和純化多糖溶液，再在試管中加入2.0 mL DPPH溶液，混合均勻后避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測吸光度A1，以去離子水為空白，抗壞血酸（VC）為陽性對照，根據(jù)公式計算DPPH自由基清除率[12]。S%=[1-（A1-A2）/A0]×100%A1：反應(yīng)液吸光度值；A2：去離子水替換DPPH溶液的吸光度；A0：蒸餾水代替反應(yīng)中樣品溶液的吸光度值。

（2）羥基自由基清除能力測定。將CMP和純化多糖用去離子水配置成1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μg/mL的溶液，用去離子水配置6 mmol/L FeSO4和8.8 mmol/L H2O2，用無水乙醇配置9 mmol/L水楊酸。在試管中分別加入不同濃度的多糖溶液，再依次加入2.0 mL FeSO4溶液、2.0 mL水楊酸溶液，最后加入2.0 mL H2O2溶液，搖勻后于37 ℃水浴60 min后，以蒸餾水為對照，VC作陽性對照，在510 nm下測吸光值。根據(jù)公式計算羥基自由基清除率[14]。S%=[1-（A1-A2）/A0]×100%A1：反應(yīng)液吸光度值；A2：不加顯色劑H2O2溶液本身的吸光度值；A0：蒸餾水代替反應(yīng)中樣品溶液的吸光度值。

（3）總還原能力檢測。檢測CMP和純化多糖的總還原能力。配制成1 000、2 000、3 000、4 000、

5 000 μg/mL的CMP和純化多糖多糖溶液，取試管分別加入上述多糖溶液2.0 mL，再加入濃度為0.2 mol/L、pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1%濃度的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，搖勻后，50 ℃水浴20 min，然后加入2.5 mL濃度為10%的三氯乙酸溶液與其混合，離心5 min。用移液管取離心管上部液體2.5 mL，依次加入純化水2.5 mL和三氯化鐵溶液0.5 mL，以純化水扣除空白，VC為陽性對照，于波長700 nm處測吸光度值A(chǔ)[15]。

（4）Fe2+螯合能力測定。將CMP和純化多糖用去離子水配置成1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μg/mL的溶液，分別取2.0 mL多糖液加入試管中，再在試管中依次加入2.0 mL蒸餾水，0.1 mL濃度為2 mmol/L的FeCl2和0.2 mL 5 mmol/L的菲啰嗪溶液。25℃水浴10 min，然后測其在562 nm處的吸光度值，EDTA為陽性對照，蒸餾水為空白，根據(jù)公式計算Fe2+螯合能力[16-17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP的取代度及含糖量測定

測得CMP的多糖pH值帶入公式計算得CMP取代度為0.336。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，以吸光度為縱坐標(biāo)。葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=9.47x+0.0073，R2=0.9969。計算得CMP含糖量為71.42%。

2.2 CMP的DEAE-52分離純化

CMP經(jīng)DEAE-52離子交換柱層析，洗脫出2個組分，如圖1所示。其中CMP0是CMP的水洗組分，占CMP質(zhì)量的2.88%；CMP5是CMP的鹽洗組分，占CMP的80.55%。由于CMP0含量過少，故對CMP5進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.3 CMP5的葡聚糖凝膠純化

采用葡聚糖凝膠G-100層析柱對CMP5進(jìn)行進(jìn)一步的純化。如圖2所示，從第17管開始出現(xiàn)較大的單一且較為對稱的洗脫峰，并且在第21管處出現(xiàn)了峰尖，這說明CMP5組分較為均勻，純化較好，收集第14～28管洗脫液，進(jìn)行冷凍干燥，得到CMP5海綿狀純化多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出葡聚糖凝膠純化得率為18.24%。并使用苯酚-硫酸法對CMP5進(jìn)行含糖量檢測，測得結(jié)果為92.07%。

2.4 CMP5的分子量檢測

多糖的生物活性與其理化性質(zhì)具有非常密切的關(guān)系，多糖的分子量作為研究多糖性質(zhì)的一項(xiàng)重要

指標(biāo)，常用的測定方法有黏度法、高效凝膠滲透色譜法、光散射法等。CMP5的HPGPC結(jié)果如圖3所示，CMP5重均分子量Mw為77.488 kDa，數(shù)均分子量Mn為75.724 kDa，Mw/Mn為1.02，趨近于1，表明CMP5分子量分布比較均勻。

2.5 CMP5的紅外光譜檢測

CMP5在3397 cm-1出現(xiàn)O-H的伸縮振動吸收峰，是糖類的特征峰[18-19]。在2 919 cm-1處有一個吸收峰，3 000～2 800 cm-1間的吸收峰是由糖類甲基、亞甲基C—H鍵的伸縮振動產(chǎn)生[20-21]。在1 594 cm-1處有一個吸收峰，為羧甲基特征吸收峰，歸屬于C=O非對稱伸縮振動[22]。在1 427 cm-1處、1 078 cm-1處有一個吸收峰，可能歸屬于C—O伸縮振動[23]。在1 371"cm-1處、1 322 cm-1處有一個吸收峰，可能歸屬于C=O對稱伸縮振動。在1 259 cm-1處、1 203 cm-1處、1 159 cm-1處、1 043 cm-1處有一個吸收峰，可能歸屬于O—H變角振動。在890 cm-1存在 β-吡喃糖特征吸收峰[24]，歸屬于β-端基差向異構(gòu)的C—H變角振動。見圖4。

2.6 CMP5的單糖組成分析

單糖標(biāo)準(zhǔn)品和CMP5的單糖組成的譜圖如圖5所示，可以看出CMP5為一種葡聚糖。

2.7 多糖的抗氧化作用

2.7.1 DPPH自由基清除率 CMP﹑CMP5和VC的DPPH自由基的清除率結(jié)果如圖6所示，清除能力由大到小為：VC＞CMP5＞CMP。在濃度達(dá)到5 000"μg/mL時，CMP 5對DPPH自由基的清除率可達(dá)到58.25%，試驗(yàn)結(jié)果表明分離純化的羧甲基茯苓多糖是一種具有清除自由基的抗氧化劑。

2.7.2 羥基自由基清除率 CMP﹑CMP5和VC的羥基自由基清除率如圖7所示。結(jié)果顯示，CMP5對羥基自由基的清除作用大于CMP，并且清除能力隨著濃度的升高而增強(qiáng)。在濃度達(dá)到5 000 μg/mL時，CMP和CMP5對羥基自由基的清除率分別為39.12%和55.41%，證明通過分離純化，羧甲基茯苓多糖的羥基自由基清除能力得以增強(qiáng)。

2.7.3 總還原能力測定 CMP﹑CMP5和VC的總還原力測定結(jié)果見圖8。結(jié)果顯示，隨著CMP、CMP5和VC濃度增加，還原力均呈逐漸增加的趨勢；三者均呈上升狀態(tài)，但VC上升趨勢減弱，CMP5上升趨勢較為明顯，還原力增加較為顯著。說明經(jīng)過分離純化后的羧甲基茯苓多糖總還原能力顯著增強(qiáng)。

2.7.4 Fe2+螯合能力的測定 Fe2+具有較強(qiáng)的還原性，能夠還原氧化物質(zhì)，在生物體內(nèi)，F(xiàn)e2+參與多種生理過程，如血紅蛋白的合成和氧氣的運(yùn)輸。但當(dāng)Fe2+濃度過高時，它可以參與自由基的生成，從而引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，對細(xì)胞和組織造成損傷。CMP和CMP5的Fe2+螯合能力如圖9所示，F(xiàn)e2+螯合能力由大到小排序?yàn)椋篍DTA＞CMP5＞CMP，CMP5和CMP的Fe2+螯合能力都隨著濃度的增大而增強(qiáng)。在濃度達(dá)到5000 μg/mL時，CMP5對Fe2+螯合能力達(dá)到39.89%。說明分離純化的羧甲基茯苓多糖具有一定的Fe2+螯合能力。

3 討論與結(jié)論

多糖是一種多羥基高分子聚合物，由至少10個單糖分子通過糖苷鍵連接并縮合而成，多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)是其展現(xiàn)出各種生物活性的基礎(chǔ)物質(zhì)[24]。趙冬雪[25]通過對6種活性多糖的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及抗氧化作用進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)了對多糖抗氧化能力等活性影響較大的是分子量與單糖組成。本試驗(yàn)首先對羧甲基茯苓粗多糖進(jìn)行分離純化，使用苯酚-硫酸法對羧甲基茯苓粗多糖進(jìn)行了含糖量檢測，計算得出含糖量為71.42%。以羧甲基茯苓粗多糖為原料，經(jīng)分離純化得到兩種多糖組分CMP0和CMP5，分別占CMP的2.88%和80.55%。CMP0因?yàn)楹窟^少，因此后續(xù)研究使用CMP5。劉曉菲[26]利用離子交換層析柱和葡聚糖凝膠層析柱分離出CMP11、CMP33和CMP44，分子量分別為31.38 kDa、15.23 kDa和20.96 kDa；馮燕如[27]分離出的CMP-1分子量為60.9 kDa。本試驗(yàn)對CMP5進(jìn)行分子量測定，CMP5分子量為75.724 kDa，造成CMP分子量的差異的原因可能是由于茯苓品種或制備方法的不同。單糖組分分析表明CMP5是一種葡聚糖，這與已有的研究報道一致[26-27]。

抗氧化作用是多糖生物活性的重要指標(biāo)，多糖可以通過清除生物體內(nèi)多種自由基來達(dá)到抗氧化的作用，因此受到眾多學(xué)者的關(guān)注[28]。孫明杰等[29]對茯苓多糖進(jìn)行了分離純化，得到兩組多糖，分別為PCP-1和PCP-2，經(jīng)過分離純化后的不同茯苓多糖組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同，對這些組分進(jìn)行抗氧化作用測定，發(fā)現(xiàn)相較于茯苓多糖粗提物，純化后的多糖組分體外抗氧化作用更強(qiáng)。Li等[30]探究大蒜內(nèi)水溶性多糖的分子量大小、構(gòu)成單糖的種類以及其結(jié)構(gòu)特性時，發(fā)現(xiàn)分離得到的兩種多糖組分在抗氧化作用方面展現(xiàn)出不一樣的能力。為了探究CMP5的抗氧化作用，分別對其DPPH 自由基清除能力，羥基自由基清除能力，總還原能力和Fe2+螯合能力進(jìn)行測定，結(jié)果表明分離純化得到的CMP5抗氧化作用明顯優(yōu)于CMP，這與林淑娜[31]等的研究結(jié)果一致。

本試驗(yàn)通過DE-52分離和葡聚糖凝膠純化得到CMP5，其分子量為 75.724 kDa，是一種葡聚糖，并且在紅外光譜檢測出了糖類特征峰與羧甲基基團(tuán)特征峰。在體外抗氧化試驗(yàn)中，CMP5 表現(xiàn)出較好的抗氧化作用。研究結(jié)果為茯苓多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)組成及生物活性提供了依據(jù)，為茯苓多糖的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。但其具體的抗氧化機(jī)制仍不清楚，這可能與其單糖組成和糖苷鍵的組成等有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：高國賦）