青稞茉莉酸合成途徑關(guān)鍵基因HvnAOC克隆、生物信息學(xué)和表達模式研究?

摘要：研究從青稞‘昆侖18’中克隆得到丙二烯氧化物環(huán)化酶基因HvnAOC并進行了生物信息學(xué)分析和表達模式研究。結(jié)果表明：HvnAOC啟動子區(qū)域有大量與生長發(fā)育、逆境和激素響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件；HvnAOC蛋白由238個氨基酸組成，分子量為25 701.27 Da，總原子數(shù)為3 612個，親水系數(shù)為-0.18，理論等電點為8.82，不穩(wěn)定指數(shù)為49.94，脂溶性指數(shù)為81.55，為親水性不穩(wěn)定蛋白且不含有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)；HvnAOC以三聚體形式存在，其中α-螺旋、β-折疊分別占比6.72%、37.39%，延長鏈和無規(guī)則卷曲占比55.89%；同源進化分析表明，青稞HvnAOC與小麥TaAOC親緣關(guān)系最近；表達模式研究發(fā)現(xiàn)，與

其他組織相比，HvnAOC基因在青稞籽粒中表達量最高，且3葉期青稞葉片中的HvnAOC受外源MeJA、ABA和GA誘導(dǎo)表達。

關(guān)鍵詞：青稞；丙二烯氧化物環(huán)化酶；HvnAOC基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：Q943.2; S512.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-060X（2025）01-0001-08

Cloning， Bioinformatics Analysis， and Expression Pattern Analysis of HvnAOC， a Key Gene of Jasmonic Acid Biosynthesis in Hulless Barley

WANG Zi-ao1，2，3，4，TIAN Rui5，CUI Yong-mei1，2，3，4，BAI Yi-xiong1，2，3，4，LI Feng-min5，

AN Li-kun1，2，3，4，WU Kun-lun5

（1. Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Qinghai University， Xining 810016， PRC; 2. Laboratory for Research and Utilization of Qinghai Tibet Plateau Germplasm Resources， Xining 810016， PRC; 3. Qinghai Key Laboratory of Hulless Barley Genetics and Breeding， Xining 810016， PRC; 4. Qinghai Subcenter of National Hulless Barley Improvement， Xining 810016， PRC; 5. College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining 810016， PRC）

Abstract： The allene oxide cyclase （AOC） gene HvnAOC was cloned from hulless barley （Hordeum vulgare var. nudum） 'Kunlun 18'. Bioinformatics analysis and expression pattern analysis were then carried out for this gene. The results showed that the promoter region of HvnAOC contained abundant cis-acting elements related to growth and development as well as responses to stress and phytohormones. The deduced protein HvnAOC was composed of 238 amino acid residues， with a molecular weight of 25 701.27 Da， total atom number of 3 612， GRAVY of -0.18， theoretical pI of 8.82， instability index of 49.94， and aliphatic index of 81.55. HvnAOC was a hydrophilic and unstable protein without transmembrane domain and signal peptides. HvnAOC existed as a trimer in plants. The proportions of α-helixes， β-sheets， and extended strands and random coils in this protein were 6.72%， 37.39%， and 55.89% respectively. HvnAOC was most closely related to TaAOC. HvnAOC showcased the highest expression level in seeds and its expression in leaves at the three-leaf stage was induced by methyl jasmonate， abscisic acid， and gibberellic acid.

Key words： hulless barely; allene oxide cyclase; HvnAOC; bioinformatics analysis

青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f.）又稱裸大麥，是禾本科大麥屬一年生草本植物，能夠抵御干旱、低溫、貧瘠和強紫外輻射等惡劣環(huán)境的脅迫，對青藏高原地區(qū)獨特的綜合逆境具有較強的適應(yīng)性[1-2]。青稞在青藏高原地區(qū)有著悠久的栽培歷史，種植技術(shù)成熟，品種豐富，是青藏高原地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要支柱[3-4]。青稞籽粒含有纖維素、β-葡聚糖和微量元素等多種營養(yǎng)成分，長期食用可降低血糖和膽固醇，是獨具特色的保健食品，也是釀酒和飼料加工的重要原料，在青藏高原農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中占據(jù)重要地位[5-6]。青稞作為一種具有重要生態(tài)、經(jīng)濟和文化價值的作物，在青藏高原地區(qū)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為青藏高原地區(qū)生態(tài)、經(jīng)濟和社會的協(xié)調(diào)發(fā)展做出了重要貢獻[7-8]。

茉莉酸（Jasmonic acid，JA）是一種廣泛存在于高等植物中的激素，在植物生長發(fā)育、綜合抗逆性調(diào)控以及植物個體與群體的信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是植物信號傳導(dǎo)和綜合抗逆性研究的熱點[9-12]。丙二烯氧化物環(huán)化酶（Allene oxide cyclase，AOC）是JA合成途徑中的關(guān)鍵酶，其功能是將JA合成途徑中丙二烯氧化合酶催化形成的丙二烯氧化中間產(chǎn)物（12，13-EOT）進一步催化形成12-氧代植物二烯酸[13-14]。JA丙二烯氧化物環(huán)化酶基因是一類基因家族，最早在玉米胚乳中發(fā)現(xiàn)，是利用基因工程技術(shù)調(diào)控植物JA合成的最理想基因之一[9]。

薛耀威等[15]研究發(fā)現(xiàn)ScAOC基因在甘蔗的根、莖、葉中均有表達，且受干旱、高鹽和MeJA脅迫誘導(dǎo)，赤條菌（Acidovorax avenae subsp. avenae，Aaa）感染和黏蟲（Mythimna separata）取食也可以誘導(dǎo)ScAOC表達，因此他們認(rèn)為ScAOC參與甘蔗對逆境脅迫的防御反應(yīng)。劉曉慧等[16]發(fā)現(xiàn)金魚草AmAOC基因由254個氨基酸殘基組成，且該基因在花中的表達量最高，根中最低；AmAOC蛋白為不穩(wěn)定親水性蛋白，理論等電點為9.25，并包含一個保守的Allene_ox_cyc結(jié)構(gòu)域。曹晏彬等[17]發(fā)現(xiàn)MdAOC1基因能被機械損傷和外源激素MeJA和SA處理誘導(dǎo)表達，MdAOC1蛋白含有一個保守的Allene_ox_cyc結(jié)構(gòu)域和一個葉綠體前導(dǎo)肽，形成了一個由3條鏈組成的疏水結(jié)合空穴。孟靈軍等[18]對砂蘚RcAOC1基因進行研究，發(fā)現(xiàn)RcAOC1蛋白理論等電點為5.16，不穩(wěn)定系數(shù)為56.25，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪指數(shù)為25.13，屬于疏水性蛋白，且不含跨膜結(jié)構(gòu)；系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，RcAOC1蛋白與小立碗蘚的同源蛋白親緣關(guān)系最近。

目前，關(guān)于青稞丙二烯氧化物環(huán)化酶基因HvnAOC的研究報道較少，因此，該研究從青稞中克隆得到HvnAOC，并對其進行了生物信息學(xué)分析和表達模式研究，以期為HvnAOC在青稞生長發(fā)育和綜合抗逆性中的功能研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試青稞品種‘昆侖18’由國家麥類改良中心青海青稞分中心提供，大腸桿菌感受態(tài)菌株為自制DH5α感受態(tài)。所用試劑盒包括SteadyPure植物基因組DNA提取試劑盒（艾科瑞生物公司）、植物總RNA快速抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]、KOD FX高保真PCR試劑盒[東洋紡（上海）生物科技有限公司]和Blunt Simple基因克隆試劑盒（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 青稞DNA和RNA提取 采用相應(yīng)的試劑盒提取青稞DNA和RNA，并參照cDNA合成試劑盒提供的方法合成cDNA，所有樣品放于-20℃冰箱保存。

1.2.2 青稞HvnAOC基因和啟動子區(qū)域序列克隆 從NCBI官網(wǎng)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）

中搜索得到大麥HvAOC基因序列，根據(jù)其基因序列和起始密碼子ATG前2 000 bp序列設(shè)計引物。

基因克隆正向引物和反向引物分別為5'-ACCACCACCAAGAGGCAACA-3'和5'-TCGTGCAGTCGTGCAAGTTG-3'，啟動子區(qū)域序列克隆正向引物和反向引物分別為5'-AGCATGTACTTCGGCGACTA-3'和5'-TTCTACCTCAAGGGCATCCC-3'。以青稞基因組cDNA和DNA為模板分別克隆青稞HvnAOC序列和啟動子區(qū)域序列。PCR程序為：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，58℃退火30 s，68℃延伸1 min（擴增啟動子區(qū)域序列為2.5 min），35個循環(huán)。產(chǎn)物置于4℃保存。將PCR產(chǎn)物與克隆載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送至北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。

1.2.3 青稞HvnAOC生物信息學(xué)分析 生物信息學(xué)分析所用軟件見表1。在NCBI中搜索得到擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.]、苦楝樹（Melia azedarach L.）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas L.）、簸箕柳（Salix suchowensis W. C. Cheng）、黃麻（Corchorus capsularis L.）、花生（Arachis hypogaea L.）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）、豌豆（Pisum sativum L.）、水稻（Oryza sativa L.）、甘蔗（Saccharum officinarum L.）、玉米（Zea mays L.）、高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]、谷子[Setaria italica var. germanica（Mill.）Schred.]、二穗短柄草[Brachypodium distachyon（L.）P. Beauv.]和小麥（Triticum aestivum L.）的AOC同源蛋白序列并基于最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。將二穗短柄草BdAOC、水稻OsAOC、玉米ZmAOC、擬南芥AtAOC、番茄SiAOC、花生AhAOC和豌豆PsAOC蛋白序列與青稞HvnAOC進行比對。

1.2.4 青稞HvnAOC表達模式分析 分別取青稞灌漿期的旗葉、根、莖稈、籽粒和分蘗芽，分析HvnAOC在青稞不同部位的表達情況。采用水培的方式培養(yǎng)青稞幼苗[2，19]，于3葉期對青稞葉片進行噴施處理。分別配置100 μmol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水楊酸（SA）、萘乙酸（NAA）、乙烯合成前體（ACC）、細胞分裂素（6-BA）溶液，每種溶液中加入1‰ Tween-20，每種處理均噴施200 mL，對照組噴施200 mL加有1‰ Tween-20的純水。在培養(yǎng)液中加入相同終濃度的相應(yīng)激素對青稞根部進行處理。于處理后0（對照）、6、12、24和48 h取葉片和根作為樣品，立即放于液氮中，-80℃保存?zhèn)溆?，每個樣品至少設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞HvnAOC生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.1.1 青稞HvnAOC啟動子功能元件預(yù)測分析結(jié)果 由表2可知，HvnAOC基因啟動子區(qū)域不僅有大量啟動子核心元件TATA-box和CAAT-box，還有與生長發(fā)育、逆境以及激素GA、JA、SA等相關(guān)的響應(yīng)元件（表2）。

2.1.2 青稞HvnAOC蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 青稞HvnAOC由238個氨基酸組成，分子式為C1151H1800N314O340S7，分子量為25 701.27 Da，總原子數(shù)為3 612個，理論等電點為8.82，脂溶性指數(shù)為81.55，親水系數(shù)為-0.18，不穩(wěn)定指數(shù)49.94，為親水性不穩(wěn)定蛋白；HvnAOC的α-螺旋、β-折疊，分別占比6.72%、37.39%，延伸鏈和無規(guī)則卷曲占比55.89%，無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽（圖1）；亞細胞定位預(yù)測顯示HvnAOC定位在葉綠體中。由圖2可知，HvnAOC有五條較長的延伸鏈且內(nèi)部有一個空腔結(jié)構(gòu)，其主要的生化反應(yīng)在此空腔中進行。由圖3可知，HvnAOC的單體形成了三聚體結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)中心會形成一個具有疏水性的空腔。

2.1.3 蛋白序列對比和同源進化分析結(jié)果 對青稞HvnAOC及其他7種植物的蛋白序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)不同植物AOC氨基酸序列主體結(jié)構(gòu)均由高度保守的8個β-折疊構(gòu)成，且含有一個Allene_ox_cyc結(jié)構(gòu)域（圖4）。由圖5可知，青稞HvnAOC與小麥TaAOC的親緣關(guān)系最近。

2.1.4 HvnAOC表達模式分析結(jié)果

由圖6可知，相較葉、根、莖、莖節(jié)和分蘗芽，HvnAOC在籽粒中的表達量最高。青稞3葉期時外施MeJA、ABA和GA能顯著提升青稞葉片中HvnAOC的表達量，但S A、NAA、ACC和6-BA處理并不能誘導(dǎo)葉片和根中HvnAOC的表達。

3 討論與結(jié)論

JA信號途徑是植物體中反應(yīng)最快的信號途徑之一，是植物生長發(fā)育和抗逆調(diào)控的研究熱點，對JA合成和信號調(diào)控相關(guān)基因進行研究能夠為作物性狀和抗性改良提供新的策略和途徑[20]。丙二烯氧化物環(huán)化酶是JA合成途徑中關(guān)鍵的限速酶，該研究克隆了青稞丙二烯氧化物環(huán)化酶基因HvnAOC并對其蛋白結(jié)構(gòu)和表達模式進行了研究，發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域具有JA、SA和GA等多個植物激素響應(yīng)元件和分生組織、胚乳、蛋白代謝、低溫、防御和應(yīng)激等多種響應(yīng)元件，說明HvnAOC在青稞生長發(fā)育和抗逆調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。很多研究表明植物AOC基因在花器官、果實和種子中表達量較高，并且受多種植物激素和逆境脅迫的誘導(dǎo)表達[15，21-22]。該研究也發(fā)現(xiàn)HvnAOC在青稞籽粒中表達量最高，且3葉期青稞葉片中的HvnAOC受外源MeJA、ABA和GA誘導(dǎo)表達，這與研究中啟動子元件預(yù)測分析結(jié)果基本相符。Li等[23]對西瓜ClAOC1和ClAOC2基因進行研究，發(fā)現(xiàn)ClAOC1和ClAOC2都含有典型的Allene_ox_cyc結(jié)構(gòu)域，其主體結(jié)構(gòu)由8個高度保守的β-折疊構(gòu)成，且ClAOC1與百脈根LjAOC1親緣關(guān)系最近；ClAOC1和ClAOC2在莖尖和果實中的表達水平最高，而在莖中的表達相對較低，同時，JA、SA和ET處理均能增強ClAOC1和ClAOC2的表達。張浩等[9]發(fā)現(xiàn)栽培種花生有9個AhAOCs同源基因，野生種有2個AhAOCs同源基因，AhAOCs基因在花生22個不同組織中都表達，且在根、雌蕊和果殼中的表達量顯著高于其他組織。董先娟等[24]發(fā)現(xiàn)白木香AsAOC1蛋白含有保守的Allene_ox_cyc結(jié)構(gòu)域，并與川桑（Morus notabilis C. K. Schneid.）MaAOC蛋白同源性較高，AsAOC1在莖中表達量最高，在葉中表達量最低，鹽、干旱、低溫和重金屬脅迫以及JA、SA、GA和ABA處理均能顯著誘導(dǎo)AsAOC1基因的表達，表明其在白木香應(yīng)對逆境和激素誘導(dǎo)時發(fā)揮了重要作用。該研究中HvnAOC啟動子區(qū)域預(yù)測有一個SA響應(yīng)元件但并沒有表現(xiàn)出受SA誘導(dǎo)表達，表明AOC基因在不同物種不同生育期可能有不同的表達模式。HvnAOC蛋白不具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，亞細胞定位預(yù)測發(fā)現(xiàn)HvnAOC定位于葉綠體中，這與茄子（Solanum melongena L.）和長春花（Catharanthus roseus L.）中AOC同源蛋白的理化性質(zhì)研究結(jié)果一致[25-26]。此外，同源進化分析發(fā)現(xiàn)進化樹主要分為單子葉植物和雙子葉植物兩個分支，說明AOC也隨著單雙子葉植物發(fā)生分化，HvnAOC與BdAOC和TaAOC親緣關(guān)系較近。

青稞HvnAOC主要由β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈構(gòu)成，內(nèi)部具有一個用于發(fā)生催化反應(yīng)的空腔結(jié)構(gòu)，青稞HvnAOC通過形成三聚體發(fā)揮作用，其三聚體結(jié)構(gòu)與擬南芥、天仙子（Hyoscyamus niger L.）以及小立碗蘚（Physcomitrium patens）等物種的AOC蛋白三聚體晶體結(jié)構(gòu)一致，說明該研究中預(yù)測的HvnAOC三聚體模型具有較高的精確性[27-31]。

青稞是能適應(yīng)青藏高原地區(qū)惡劣環(huán)境的特殊作物，研究青稞JA合成和信號調(diào)控相關(guān)基因可為進一步探索JA調(diào)控的青稞適應(yīng)青藏高原特殊逆境的機制提供參考。該研究克隆了青稞丙二烯氧化物環(huán)化酶基因HvnAOC，并進行了生物信息學(xué)分析和表達模式研究，為進一步探究青稞JA合成調(diào)控途徑和通過分子育種技術(shù)培育新品種提供了一定參考。

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（責(zé)任編輯：王婷）