常溫和低溫纖維素降解菌的篩選及其酶活特性

岳林芳，成立新，李蘊(yùn)華，蘇少鋒，于朝暉，王志銘，吳海青

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

岳林芳，成立新，李蘊(yùn)華，等.常溫和低溫纖維素降解菌的篩選及其酶活特性［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2023，44（2）：9-16.

農(nóng)業(yè)廢棄物主要包括農(nóng)作物秸稈和畜禽糞便等，好氧堆肥是其無(wú)害化處理和資源化利用的重要方式［1-3］。好氧堆肥能夠把畜禽糞便轉(zhuǎn)化為富含有機(jī)氮、有機(jī)碳及其他養(yǎng)分的有機(jī)肥，滿足植物對(duì)氮肥和磷肥的一定需求并減少化肥的使用［4］。接種特定微生物會(huì)強(qiáng)化堆肥過(guò)程，對(duì)堆肥中的微生物群落產(chǎn)生影響，加快堆料降解并提高堆肥產(chǎn)品中的腐殖質(zhì)含量［5］。纖維素類(lèi)物質(zhì)是農(nóng)作物秸稈和畜禽糞便的主要組成成分，是一種葡萄糖聚合物，由D-葡萄糖通過(guò)1，4-β-D-葡萄糖苷鍵連接而成，其降解主要依靠纖維素降解菌［6-7］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多種類(lèi)的可培養(yǎng)纖維素降解菌，如細(xì)菌、放線菌和真菌都具有降解纖維素能力［8］，這些菌通過(guò)分泌漆酶、木質(zhì)素過(guò)氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶等酶來(lái)降解纖維素類(lèi)物質(zhì)［9］。細(xì)菌來(lái)源廣，分泌的酶種類(lèi)多，繁殖速度快，可以在各種極端環(huán)境中生存，因此，易于大規(guī)模生產(chǎn)［10］。

許多學(xué)者對(duì)各種生境中的纖維素降解菌資源進(jìn)行了挖掘研究，Behera 等［11］從紅樹(shù)林土壤中篩選到了14 株纖維素降解菌，分別為微球菌屬（Micrococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等。王海濱等［12］從采集的腐殖土和堆肥中，分離純化得到了216 株常溫纖維素降解菌，包括細(xì)菌、真菌和放線菌；李靜等［13］從杜鵑林下土壤中分離獲得了15 株纖維素降解菌；鄭麗等［14］從木薯生境中篩選到了57 株產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌菌株；吳慶珊［15］從不同生境及市售菌劑樣品中分離篩選出纖維素降解細(xì)菌156 株、真菌68 株和放線菌43 株；張必周等［16］在15 ℃培養(yǎng)條件下，分離得到了11 株具有降解纖維素能力的菌株；孟建宇等［17］從土壤樣品中分離到59 株纖維素降解細(xì)菌：在10 ℃下分離到36 株低溫纖維素降解細(xì)菌，在28 ℃下分離到23 株常溫纖維素降解細(xì)菌；董雪麗等［18］從腐化水稻秸稈中，在10 ℃下篩選出具有一定纖維素分解能力的菌株6 株，其中包括2 株真菌和4 株細(xì)菌。但是，適合我國(guó)內(nèi)蒙古等北方地區(qū)的常溫和低溫纖維素降解功能菌研究較少［19］。

對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)常溫和低溫菌株進(jìn)行研究，可以獲得適合的高效降解纖維素菌株，為促進(jìn)牛羊糞污和秸稈堆肥處理提供新型功能菌株，為研發(fā)微生物復(fù)合菌劑、纖維素酶制劑和微生物肥料提供依據(jù)，進(jìn)而促進(jìn)環(huán)境污染和資源浪費(fèi)等問(wèn)題的有效解決。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來(lái)源

樣品是采集自內(nèi)蒙古烏拉特中旗某林場(chǎng)0～10 cm 的落葉林腐殖土、錫林郭勒盟德美純種肉羊種羊場(chǎng)的新鮮羊糞和稻草、呼和浩特市和林格爾縣某養(yǎng)殖場(chǎng)的驢糞，將樣品置入滅菌袋中，再放入低溫冰袋后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

赫奇遜 （Hutchison）培養(yǎng)液：NaNO32.5 g，KH2PO41.0 g，NaCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eCl30.01 g，CaCl20.1 g，pH 值為7.2～7.3，蒸餾水1 000 mL。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基：CMC-Na 5.0 g，酵母粉2.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO40.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素降解菌株初步分離、篩選

使用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基對(duì)采集的樣品進(jìn)行纖維素降解菌株的初步分離、篩選。首先在三角瓶中放入20 g 樣品，按1∶10 的比例將樣品稀釋?zhuān)尤?00 mL 已滅菌的蒸餾水，制備成菌懸液；于室溫下，以120 r/min 的速度振蕩40 min，使樣品被充分打散，促使菌完全游離出來(lái)，并均勻分布在水中。然后取100 μL 適當(dāng)稀釋梯度的菌懸液，涂布于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行培養(yǎng)和分離，在30 ℃（常溫）條件下培養(yǎng)3～5 d 和在18 ℃（低溫）條件下培養(yǎng)7～10 d。在培養(yǎng)期間，觀察菌落的生長(zhǎng)情況，挑取不同顏色、大小或形狀的菌落進(jìn)行分離純化，獲得單菌落純培養(yǎng)物。最后在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上，反復(fù)將單菌落劃線純化，直至得到純菌株。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)分離獲得的細(xì)菌菌株，使用革蘭染色法進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和純度判定。

1.2.3 菌株的保存

已分離得到的純菌株使用75%的甘油進(jìn)行保存，且放于-80 ℃冰箱。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定

對(duì)已分離得到的細(xì)菌和真菌菌株，分別使用16S rDNA 和ITS 基因序列分析技術(shù)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。鑒定方法：首先用引物27F/1492R 或ITS1/ITS4 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后將PCR 產(chǎn)物切膠純化回收，再用引物27F/1492R 或ITS1/ITS4 測(cè)序，最后將測(cè)序結(jié)果序列在NCBI BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而完成菌種鑒定。

1.2.5 利用剛果紅染色法進(jìn)一步篩選

在生長(zhǎng)單菌落的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，加入適量1 mg/mL 剛果紅染液，染色15～20 min，將染液棄掉，加入適量的濃度為1 mol/L 的NaCl溶液，進(jìn)行洗滌脫色30～60 min。觀察菌落周?chē)乃馊η闆r。纖維素降解菌株的判斷依據(jù)是有水解圈，并通過(guò)培養(yǎng)基透明圈Dc 值的大?。跠c=水解圈直徑（D，cm）/菌落直徑（d，cm）］，初步判斷菌株的纖維素降解能力，進(jìn)而篩選得到纖維素降解效果較好的菌株。

1.2.6 利用濾紙條降解法進(jìn)行更進(jìn)一步篩選

將分離得到的菌株培養(yǎng)于Hutchison 培養(yǎng)液中，進(jìn)行濾紙條降解試驗(yàn)：取3 mL 菌懸液接種于盛有45 mL 濾紙條崩解培養(yǎng)基 （Hutchison 培養(yǎng)液）的離心管中，放入規(guī)格為1 cm×6 cm 的新華Ⅰ號(hào)濾紙條，30 ℃振蕩培養(yǎng)10 d 和18 ℃振蕩培養(yǎng)15 d，期間輕微搖勻，定期觀察濾紙條崩解情況。對(duì)照組為不接種菌液但放有濾紙條的崩解培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)3 個(gè)重復(fù)。觀察各管中濾紙條降解潰爛情況，進(jìn)一步篩選出降解纖維素效果更好的菌株，判斷依據(jù)為濾紙條崩解程度：濾紙邊緣已膨脹用“+”表示；濾紙整體膨脹并已下彎用“++”表示；濾紙呈不定狀用“+++”表示；濾紙呈糊狀用“++++”表示；濾紙呈半清狀用“+++++”表示。

1.2.7 分離菌株酶活力測(cè)定

以2 mL 1%（W/V）的CMC-Na 緩沖液為反應(yīng)底物測(cè)定羧甲基纖維素酶 （carboxymethyl cellulose，CMCase）活性；以浸泡有0.2 g（無(wú)淀粉）濾紙條的2 mL 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液為反應(yīng)底物測(cè)定濾紙酶活性 （filter paper activity，F(xiàn)PA）；以2 mL 1%（W/V）的微晶纖維素（microcrystalline cellulose，MCC）緩沖液為反應(yīng)底物測(cè)定外切酶（C1）活性；以2 mL 1%（W/V）水楊苷緩沖液為反應(yīng)底物測(cè)定β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-Gase）活性，再接入1 mL 發(fā)酵粗酶液于25 mL 的比色管中，放入恒溫（50 ℃）水浴或恒溫箱中反應(yīng)30 min 后，加3 mL 3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液使反應(yīng)終止。將裝有混合液的比色管在沸水浴煮8～10 min 后，用涼水立即冷卻，加入蒸餾水定容至25 mL，在540 nm 下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值。酶活定義：在50 ℃反應(yīng)條件下，1 min 內(nèi)催化底物生成1 μmol 葡萄糖所需要的纖維素酶的量，用1 U/mL 表示［17］。分離菌株酶活力的測(cè)定，通過(guò)公式計(jì)算酶活：U=K（m1-m0）/30，式中，U 為樣品的酶活，1 個(gè)酶活單位代表1 mL 原樣酶液1 min產(chǎn)生1 μg 葡萄糖的酶的量；m1為樣品葡萄糖量，m0為對(duì)照葡萄糖量（與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線對(duì)照，計(jì)算出樣品和對(duì)照的葡萄糖量）；K 為樣品稀釋倍數(shù)；30 為酶與底物反應(yīng)時(shí)間。分離篩選得到的菌株測(cè)定其CMCase 酶活，選擇CMCase 酶活高的菌株測(cè)定其FPA、C1和β-Gase 酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離保存菌株的16S rDNA 和ITS 鑒定結(jié)果

在30 ℃培養(yǎng)條件下，利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基對(duì)采集樣品進(jìn)行初步分離、篩選，再經(jīng)菌株分子生物學(xué)鑒定，從稻草、腐殖土、羊糞和驢糞樣品中共分離、純化、完成鑒定和保存菌株27 株，包括芽孢桿菌屬 （Bacillus）12 株、假單胞菌屬（Pseudomonas）5 株、腸桿菌屬（Enterobacter）3 株、鏈霉菌屬（Streptomyces）3 株、志賀氏菌屬（Shigella）1株、曲霉菌屬 （Aspergillus）1 株、微球菌屬（Microbacterium）1 株和鮑特氏菌屬（Bordetella）1 株。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 常溫條件下分離菌株的16S rDNA 和ITS 鑒定結(jié)果 單位：%

在18 ℃的培養(yǎng)條件下，利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基對(duì)采集樣品進(jìn)行初步分離、篩選，經(jīng)菌株的分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，從稻草、腐殖土、羊糞和驢糞樣品中共分離、完成鑒定和保藏菌株17株，包括假單胞菌屬（Pseudomonas）7 株、芽孢桿菌屬（Bacillus）3 株、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）3 株、腸桿菌屬 （Enterobacter）1 株、干燥桿菌屬（Siccibacter）1 株、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）1株和鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）1 株。孟建宇等［20］報(bào)道得出，篩選獲得的低溫纖維素降解菌株主要屬于假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和不動(dòng)桿菌屬等，該結(jié)果與其報(bào)道相似。具體鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 低溫條件下分離菌株的16S rDNA 鑒定結(jié)果 單位：%

2.2 纖維素剛果紅水解圈試驗(yàn)和濾紙條降解試驗(yàn)結(jié)果

在30 ℃的培養(yǎng)條件下，通過(guò)纖維素剛果紅水解圈試驗(yàn)和濾紙條降解試驗(yàn)對(duì)已分離保存的菌株進(jìn)行研究，結(jié)果表明，篩選到有較強(qiáng)剛果紅水解圈的菌株7 株，分別為C-5、C-黑泥、T-6-1、T-8-1、T-8-2、LF-3 和LF-6；可以更好降解濾紙條的菌株有7 株，分別為C-1、C-3、C-4、T-6-1、T-6-2、T-8-2 和LF-5。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 常溫菌株的剛果紅水解情況和濾紙降解效果

在18 ℃的培養(yǎng)條件下，通過(guò)纖維素剛果紅水解圈試驗(yàn)和濾紙條降解試驗(yàn)對(duì)已分離保存的菌株進(jìn)行研究，結(jié)果表明，篩選到有較強(qiáng)剛果紅水解圈的菌株4 株，分別為C-5、YF-1、YF-2-1 和YF-3；可以更好降解濾紙條的菌株有3 株，分別為C-5、YF-1 和YF-3。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 低溫菌株的剛果紅水解情況和濾紙降解效果

2.3 酶活性測(cè)定結(jié)果

2.3.1 菌株纖維素酶活性測(cè)定結(jié)果

采用DNS 法對(duì)分離到的24 株常溫纖維素降解菌株（不包括濾紙條降解效果最差的LF-2、LF-3 和T-8-1）和11 株低溫纖維素降解菌株（不包括濾紙條降解效果最差的C-3、T-4、T-5-1、T-5-2、LF-1-1 和LF-2）的纖維素酶活分別進(jìn)行了測(cè)定，35 株菌株均在常溫（30 ℃）條件培養(yǎng)后，測(cè)定其CMCase 活性。研究得出，纖維素降解菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 在所有菌株中的CMCase 活性最高，分 別 為 （169.24 ±2.18）、（136.79 ±2.05）、（116.01±0.52）U/mL。具體結(jié)果見(jiàn)表5 和表6。

表5 在30 ℃培養(yǎng)后常溫菌株CMCase 活性測(cè)定結(jié)果單位：U/mL

表6 在30 ℃培養(yǎng)后低溫菌株測(cè)定CMCase 活性結(jié)果單位：U/mL

2.3.2 菌株其他酶活性測(cè)定結(jié)果

在常溫條件下培養(yǎng)后，鑒于菌株T-8-2、LF-7和LF-5 的CMCase 活性最高，接著又測(cè)定了這3株菌的FPA、C1和β-Gase 活性：菌株T-8-2 的FPA 活 性 為 （159.07±1.57）U/mL、C1活 性 為（154.23±1.06）U/mL、β-Gase 活 性 為 （165.16±1.00）U/mL；菌株LF-7 的FPA 活性為 （116.27±4.66）U/mL、C1活性為（134.36±13.39）U/mL 和β-Gase 活性為 （123.44±0.91）U/mL；菌株LF-5 的FPA 活性為（96.77±0.52）U/mL、C1活性為（97.52±1.18）U/mL 和β-Gase 活性為（98.04±0.44）U/mL，具體結(jié)果見(jiàn)表7。由此可見(jiàn)，T-8-2、LF-7 和LF-5是極具開(kāi)發(fā)潛力的纖維素降解菌株。

表7 菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 的各類(lèi)酶活測(cè)定結(jié)果單位：U/mL

3 討論

孟建宇等［17］對(duì)常溫纖維素降解菌進(jìn)行了研究，分離的常溫纖維素降解菌在28 ℃下的相對(duì)CMCase 酶活在4～88 U/mL，其中菌株CB04 的CMCase 酶活最高，為87.2 U/mL；對(duì)CB04 進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，優(yōu)化后（酵母膏為氮源，培養(yǎng)時(shí)間為4 d，pH 值為7）的CMCase 酶活最高可達(dá)114.6 U/mL。該研究未進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，常溫（30 ℃）條件下培養(yǎng)后，得到CMCase 酶活最高的纖維素降解菌株為T(mén)-8-2、LF-7 和LF-5，其CMCase 酶活分別為（169.24±2.18）、（136.79±2.05）、（116.01±0.52）U/mL，均高于孟建宇等［17］的研究結(jié)果。許玉林等［21］在28 ℃條件下篩選到纖維素酶高產(chǎn)菌株草酸青霉SJ1，濾紙酶活和CMCase 酶活分別為25.15 U/mL 和740.42 U/mL，草酸青霉SJ1 的CMCase 酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于該研究得到的3 株纖維素降解菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 的CMCase 酶活，但是草酸青霉SJ1 的FPA 活性明顯低于T-8-2、LF-7和LF-5 的酶活。

孟建宇等［17］對(duì)低溫纖維素降解菌也進(jìn)行了研究，低溫纖維素降解菌在10 ℃下的相對(duì)酶活性不高，在2～12 U/mL，其中菌株FB4 的酶活最高，為11.6 U/mL。尚曉瑛等［22］從黑龍江林場(chǎng)腐殖土中篩選的耐低溫纖維素分解菌B6-15，屬于假單胞菌屬，20 ℃培養(yǎng)3 d 酶活性為24.94 U/mL。李娜等［23］在18 ℃條件下，從小興安嶺山區(qū)土壤中分離到1株在低溫下具有較強(qiáng)纖維素降解能力的真菌菌株C1，濾紙酶活和CMCase 酶活分別為18.4 U/mL 和54.3 U/mL。低溫纖維素降解菌株在生物降解過(guò)程中常出現(xiàn)酶活性低的問(wèn)題［24］，而酶活性不僅與微生物自身的遺傳特性有關(guān)，還會(huì)受到菌株發(fā)酵條件（如培養(yǎng)基成分、接種量和培養(yǎng)時(shí)間等）的影響［25］。

4 結(jié)論

尋找適合的纖維素降解菌株是解決內(nèi)蒙古地區(qū)牛羊糞污高效堆肥處理的關(guān)鍵方法。該研究總共分離獲得44 株纖維素降解菌株，分別包括在30 ℃下分離得到的27 株常溫纖維素降解菌株和18 ℃下分離得到的17 株低溫纖維素降解菌株。該研究揭示了內(nèi)蒙古部分地區(qū)可培養(yǎng)纖維素降解菌的類(lèi)群組成及其纖維素降解能力，可為了解和利用纖維素降解菌株提供依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。常溫纖維素降解菌株T-8-2、LF-7 和LF-5 的CMCase 酶活最高，是極具開(kāi)發(fā)潛力的纖維素酶生產(chǎn)菌株，可以作為內(nèi)蒙古等北方地區(qū)有效降解纖維素的潛力菌株應(yīng)用于糞污堆肥發(fā)酵劑的研制中。