白葉1號(hào)發(fā)酵茶復(fù)配養(yǎng)生茶調(diào)節(jié)3T3-L1細(xì)胞脂質(zhì)代謝的作用

關(guān)鍵詞：發(fā)酵白化茶；枸杞；山楂；3T3-L1 前脂肪細(xì)胞；調(diào)節(jié)脂肪代謝；功效成分

中圖分類號(hào)：TS272.5；TS275.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1000－3150 （2025） 01-50-8

肥胖是一種由于能量攝入與消耗不平衡導(dǎo)致的慢性代謝紊亂，其顯著特征是體內(nèi)脂肪過度積累[1-2]。肥胖會(huì)引發(fā)許多慢性疾病，包括II型糖尿病、冠心病、高血壓以及卵巢癌和結(jié)腸癌等[3]。2030年，中國超重和肥胖人群預(yù)計(jì)將達(dá)到7.9億人，治療費(fèi)用高達(dá)4180億元，約占全國醫(yī)療總費(fèi)用的21.5%[4-5]。日益嚴(yán)峻的肥胖問題促使越來越多的人積極尋求綠色、健康的降脂途徑[6]。

發(fā)酵白化茶是以白葉1號(hào)品種茶樹鮮葉為原料，經(jīng)高純度冠突散囊菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化后所得的特色黑茶[7]。白化茶經(jīng)發(fā)花工序后，其兒茶素、茶多酚、茶黃素、茶紅素等成分向茶褐素、黃酮苷等成分轉(zhuǎn)化，使得茶湯湯色橙紅明亮、滋味濃醇厚，且具有濃郁的菌花香[8]。研究表明，發(fā)酵白化茶對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖模型小鼠有明顯的減肥效果，具體表現(xiàn)為小鼠體重顯著下降，總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量降低，且與未發(fā)花白化茶相比，發(fā)酵白化茶通過發(fā)花工藝在一定程度上提升了其降脂減肥功效[9]。枸杞，屬于茄科植物，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》[10]，其主要生化成分為多糖類、黃酮類和花色苷類等，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗腫瘤、降糖調(diào)脂等功效[11]。其中，枸杞多糖是枸杞的主要活性成分，能降低糖尿病患者血液中的葡萄糖含量，提高胰島素生成指數(shù)，調(diào)節(jié)機(jī)體糖代謝和脂代謝[12]。山楂作為藥食同源的水果，具有消食健胃、行氣散瘀、化濁調(diào)脂的功效[13]，且是調(diào)節(jié)血脂藥物如脂必妥和血脂靈片的主要成分之一。山楂黃酮可以顯著降低高血脂大鼠中TC和TG含量，提高高密度脂蛋白膽固醇含量，并降低低密度脂蛋白膽固醇含量[14]。

選擇發(fā)酵白化茶、枸杞和山楂進(jìn)行配伍的原因有以下幾點(diǎn)：第一，3種原料均具有明確的降脂功能，其主要活性成分通過不同途徑調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[15-17]。第二，茶葉、枸杞和山楂中的活性成分，如茶多酚、枸杞多糖及山楂黃酮，在抗氧化及脂肪分解方面可能存在協(xié)同作用。例如，有研究表明茶類與藥食同源植物聯(lián)合使用時(shí)可以增強(qiáng)其生物效應(yīng)[18-20]。第三，從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)角度來看，枸杞與山楂的組合已有長期使用歷史[21-22]，二者的功能特性與發(fā)酵白化茶結(jié)合后或可通過多靶點(diǎn)作用提升整體功效。此外，三者功能成分的協(xié)同作用已初步得到研究證實(shí)，例如山楂黃酮可以增強(qiáng)茶多酚對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)控的效果[23]，而枸杞多糖則可進(jìn)一步優(yōu)化其抗氧化功能[24]。

因此，本試驗(yàn)以發(fā)酵白化茶為主要原料，輔以枸杞、山楂制成新式養(yǎng)生茶，運(yùn)用代謝組學(xué)分析其化學(xué)成分。通過不同質(zhì)量濃度養(yǎng)生茶干預(yù)小鼠3T3-L1細(xì)胞高脂模型，探究其體外降脂作用機(jī)制，可為新式茶飲的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

１.1.1材料

發(fā)酵白化茶以白葉1號(hào)品種茶樹鮮葉為原料，經(jīng)冠突散囊菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化后所得，為浙江大學(xué)茶學(xué)系綜合利用實(shí)驗(yàn)室專利產(chǎn)品；枸杞和山楂由杭州藝福堂茶業(yè)有限公司提供；3T3-L1前脂肪細(xì)胞為中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供。

1.1.2試劑

胎牛血清（FBS），購自美國ZetaLife公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素－鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS），購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；辛伐他?。兌取?8%），購自北京索萊寶科技有限公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX，純度≥99%）、胰島素（BR），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；地塞米松（DEX，純度≥97%）、改良油紅O染色液、CCK-8試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TG、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；異丙醇（分析純），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備

HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、UV759S型紫外可見分光光度計(jì)，購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHZ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海亞榮生化儀器廠；LGJ-10C冷凍干燥儀，購自北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；CO2生化培養(yǎng)箱，購自美國SHELLAB公司；倒置顯微鏡，購自重慶重光實(shí)業(yè)有限公司；MultiskanMK3酶標(biāo)儀，購自美國Thermo公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1養(yǎng)生茶干粉的制備

稱取發(fā)酵白化茶、枸杞、山楂各30g，用粉碎機(jī)粉碎至60目顆粒。按照茶水比1∶25、1∶8、1∶6分別在100℃下浸提45min。將浸提液過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮。濃縮液經(jīng)冷凍干燥后制得干茶粉并稱重。按照前期試驗(yàn)優(yōu)化的配方3.7∶3.2∶1.9均勻混合茶粉，密封包裝，置于－40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2養(yǎng)生茶代謝物的檢測

養(yǎng)生茶干粉在70℃、體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇水溶液中提取0.5h，冷卻至室溫后離心10min（8500r/min，4℃）。上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用于代謝組學(xué)檢測[25]。各處理重復(fù)3次。

采用UHPLC-Q-Exactive/MS系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（1.8μm，2.1mm×100.0mm）；柱溫：40℃；流速：0.4mL/min；進(jìn)樣體積：3μL。采用二元流動(dòng)相梯度洗脫，A相選用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸的水溶液，B相選用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸乙腈溶液。線性洗脫程序?yàn)椋?min，2%B；0.5min，2%B；8min，15%B；13min，35%B；15min，70%B；16min，85%B；16.5min，2%B；20min，2%B。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI）；檢測模式分別為正（毛細(xì)管電壓3.5kV）和負(fù)（毛細(xì)管電壓－3.0kV）離子模式，毛細(xì)管溫度：300℃；輔助氣溫度350℃，流速10L/min；質(zhì)譜掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～1200。

從UHPLC-Q-Exactive/MS獲得的原始數(shù)據(jù)通過Compounddiscoverer3.2軟件進(jìn)行峰面積提取與峰匹配。質(zhì)量寬度和保留時(shí)間寬度分別設(shè)定為2×10-5g/g和0.3min。

1.2.3CCK-8法測定細(xì)胞活力

采用CCK-8法檢測不同濃度陽性藥物和養(yǎng)生茶對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活力的影響。將3T3-L1脂肪細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)基更換為含不同質(zhì)量濃度陽性藥物辛伐他?。?、10、20、30、40、50μg/mL）和養(yǎng)生茶（0、200、300、400、500、600、1000、2000μg/mL）的DEME完全培養(yǎng)基（90%DMEM高糖培養(yǎng)基，10%FBS）繼續(xù)培養(yǎng)48h。棄去原培養(yǎng)基，每孔加入100μL10%CCK-8溶液，37℃孵育1h，檢測OD450值。

1.2.43T3-L1前脂肪細(xì)胞高脂模型的建立和分組給藥

將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板，待細(xì)胞完全匯合后，繼續(xù)培養(yǎng)48h，確保細(xì)胞產(chǎn)生接觸抑制現(xiàn)象。用含分化誘導(dǎo)劑（0.5mmol/LIBMX、1μmol/LDex、1μg/mL胰島素）的完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化2d，隨后更換為含1μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2d，最后用無誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4d[26]。

陽性藥物組和養(yǎng)生茶組在加入分化誘導(dǎo)劑的同時(shí)加入陽性藥物辛伐他丁（10μg/mL）和不同質(zhì)量濃度的養(yǎng)生茶（200、300、400、500μg/mL），對(duì)照組用等體積完全培養(yǎng)基代替藥物和養(yǎng)生茶。

1.2.5油紅O染色

細(xì)胞分化結(jié)束后按照改良油紅O染色試劑盒說明書中的操作步驟對(duì)處理后的3T3-L1細(xì)胞進(jìn)行染色。染色結(jié)果用倒置顯微鏡觀察和拍照。

1.2.6脂肪含量測定

細(xì)胞分化結(jié)束后用100%異丙醇提取細(xì)胞脂質(zhì)，待細(xì)胞內(nèi)脂滴完全溶解，通過測定OD492值表征細(xì)胞脂肪含量。

1.2.7TG含量檢測

分化結(jié)束后根據(jù)TG檢測試劑盒中的說明書測定TG含量。通過BCA法測定蛋白含量。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS27軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果進(jìn)行T-test顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。用GraphPadPrism8作圖，相關(guān)性熱圖由Omicshare繪制。

2結(jié)果與分析

2.1代謝組學(xué)測定結(jié)果

通過UHPLC-Q-Exactive/MS液質(zhì)聯(lián)用檢測養(yǎng)生茶中含有的代謝物，如表1所示。經(jīng)色譜峰提取和對(duì)比后，共檢測到167種與茶相關(guān)的物質(zhì)，可分為8類，其中黃烷醇類種類最多，共有44種。黃酮/黃酮醇/黃酮苷類次之，共有37種。表1還列出了峰面積相對(duì)豐度≥1%的主成分物質(zhì)，包含多種功能性成分。

枸杞和山楂含有較多的功能性成分，如表2所示，共檢測到12種物質(zhì)。黃酮類化合物是枸杞的主要化學(xué)成分之一，也是枸杞重要的質(zhì)量標(biāo)志物。山楂中同樣含有多種黃酮類化合物。天然黃酮類成分通過抗低密度脂蛋白的氧化作用、清除體內(nèi)自由基及抑制脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生等多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮降血脂作用。在養(yǎng)生茶中可檢測到柚皮素、槲皮素、山奈酚、蘆丁、木犀草素葡萄糖甙、錦葵色素3，5-雙葡萄糖苷等黃酮類衍生物。綠原酸在枸杞和山楂中均被檢出，其具有抗氧化、降糖、降血脂的功效，可有效緩解高脂飲食誘導(dǎo)大鼠的脂肪囤積，增加腸道微生物的種群多樣性。

2.2不同濃度養(yǎng)生茶對(duì)3T3-L1細(xì)胞活性的影響

采用CCK-8法測定陽性藥物辛伐他丁和養(yǎng)生茶對(duì)3T3-L1細(xì)胞活性的影響。從圖1可見，隨著辛伐他汀質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞存活率降低。當(dāng)辛伐他汀質(zhì)量濃度為10μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為91.59%。與陽性藥物相似，除300μg/mL的處理外，隨著養(yǎng)生茶質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低；當(dāng)養(yǎng)生茶樣質(zhì)量濃度為200～500μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為90.37%～98.64%；當(dāng)質(zhì)量濃度gt;500μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率低于90%，說明這些質(zhì)量濃度的養(yǎng)生茶和對(duì)照組相比，可能對(duì)細(xì)胞造成傷害，不利于細(xì)胞生存。

因此采用對(duì)細(xì)胞活性影響較小的質(zhì)量濃度，即10μg/mL辛伐他汀和200～500μg/mL養(yǎng)生茶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3養(yǎng)生茶對(duì)3T3-L1細(xì)胞脂質(zhì)積累的影響

3T3-L1前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化的過程中會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)積累。油紅O染料對(duì)脂肪變性、脂質(zhì)沉積的組織器官有良好的溶脂及吸附作用，油紅O染料具有操作簡便、色彩鮮亮等特點(diǎn)，因此可以直觀顯示出脂質(zhì)積累的程度。如圖2-a所示，模型組中細(xì)胞內(nèi)積累的脂質(zhì)被油紅O染色，表明3T3-L1前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化8d后成功轉(zhuǎn)變?yōu)橹炯?xì)胞，脂肪含量為對(duì)照組的1.12倍（圖2-b）。在3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中加入不同質(zhì)量濃度的養(yǎng)生茶，可以減少脂質(zhì)的積累。在200～500μg/mL范圍內(nèi)，養(yǎng)生茶減脂效果具有劑量依賴效應(yīng)。其中，當(dāng)養(yǎng)生茶質(zhì)量濃度為300、400、500μg/mL時(shí)，與模型組相比，細(xì)胞脂肪含量分別降低了22.64、23.17、30.63個(gè)百分點(diǎn)，降脂效果優(yōu)于10μg/mL的辛伐他丁陽性藥物組。細(xì)胞內(nèi)TG含量與脂肪代謝有關(guān)。如圖2-c所示，3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞后，TG含量是對(duì)照組的1.43倍，用不同質(zhì)量濃度養(yǎng)生茶處理可以顯著降低TG含量。養(yǎng)生茶質(zhì)量濃度為500μg/mL時(shí)，細(xì)胞TG含量最低，與模型組相比降低了89.33%。

2.4相關(guān)性分析

從降脂效果來看，500μg/mL養(yǎng)生茶降低3T3-L1細(xì)胞中脂質(zhì)和TG含量的效果最好，因此選擇此質(zhì)量濃度下測得的細(xì)胞TG和脂肪含量與養(yǎng)生茶中測得的代謝組學(xué)成分進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。如圖3所示，不同物質(zhì)對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)代謝物有著不同的相關(guān)性。

咖啡堿、脫氧腺苷、原花青素B2、植物鞘氨醇、柚皮素、錦葵色素3，5-雙葡萄糖苷、兒茶素、蘆丁和槲皮素等物質(zhì)與脂肪和TG含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明這些物質(zhì)可以降低脂肪和TG含量。由此得出，養(yǎng)生茶成分可以影響3T3-L1細(xì)胞的脂肪代謝。

3小結(jié)與討論

通過對(duì)小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的誘導(dǎo)和功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵白化茶、枸杞和山楂配伍的養(yǎng)生茶具有預(yù)防肥胖效果。通過油紅O染色試驗(yàn)觀察細(xì)胞被染色的面積，發(fā)現(xiàn)模型組的染色面積明顯大于對(duì)照組，表明高脂模型誘導(dǎo)成功；觀察養(yǎng)生茶處理組，發(fā)現(xiàn)隨著養(yǎng)生茶質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞染色面積越來越小，表明養(yǎng)生茶具有降脂功效，且該功效隨著養(yǎng)生茶質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。脂肪和TG含量的測定結(jié)果同樣表明，養(yǎng)生茶具有減脂效果，在低質(zhì)量濃度200μg/mL時(shí)便有明顯效果，中高質(zhì)量濃度養(yǎng)生茶效果更是優(yōu)于陽性藥物辛伐他丁。

對(duì)養(yǎng)生茶樣進(jìn)行代謝組學(xué)分析后，共檢測到167種物質(zhì)，可分為8類，其中黃烷醇類種類最多，共有44種，黃酮/黃酮醇/黃酮苷類次之，共有37種。發(fā)酵白化茶養(yǎng)生茶整體表現(xiàn)出高氨基酸、高有機(jī)酸的特點(diǎn)。有研究顯示，氨基酸對(duì)抑制代謝綜合征相關(guān)酶類如a-淀粉酶和胰脂肪酶具有積極作用[27]。有機(jī)酸的分子中具有很多羥基結(jié)構(gòu)，顯酸性，有利于茶多酚的穩(wěn)定，其質(zhì)子可釋放出來用于還原茶多酚，使茶多酚恢復(fù)抗氧化能力[28]，從而促進(jìn)代謝，起到減肥的效果。

通過代謝物與脂肪、TG含量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)生茶中多種物質(zhì)可以影響3T3-L1細(xì)胞的脂肪代謝，兒茶素、咖啡堿、槲皮素、柚皮素等9種物質(zhì)與脂肪、TG含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。兒茶素通過抑制脂肪相關(guān)酶、增強(qiáng)脂肪酸的氧化能力、抑制食欲等作用，降低體內(nèi)脂肪的形成和代謝，從而達(dá)到降脂減肥的功效[29]，使其與細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累呈顯著負(fù)相關(guān)，這與其他研究中的結(jié)果一致?？Х葔A與脂肪、TG含量的極顯著負(fù)相關(guān)性表明其對(duì)降脂有重要作用。研究表明，咖啡堿通過激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制脂肪酸合成酶（FAS）的活性，同時(shí)通過提升細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，顯著激活激素敏感性脂肪酶（HSL），促進(jìn)脂肪分解。此外，咖啡堿還能通過調(diào)控脂質(zhì)代謝中的多靶點(diǎn)通路，在脂肪酸的氧化代謝中發(fā)揮積極作用[30]。槲皮素通過調(diào)節(jié)PPARγ信號(hào)通路降低脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)其抗炎特性通過抑制NF-κB信號(hào)通路減輕炎癥對(duì)脂質(zhì)代謝的負(fù)面影響[31]。這種多重作用機(jī)制表明槲皮素不僅能夠直接影響脂肪代謝，還對(duì)改善由炎癥引起的代謝紊亂具有重要意義。柚皮素也表現(xiàn)出與脂質(zhì)代謝的強(qiáng)負(fù)相關(guān)性，其主要通過AMPK信號(hào)通路抑制乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的活性，從而減少脂肪酸的合成，同時(shí)顯著促進(jìn)脂肪酸的β-氧化過程[32]。其作用機(jī)制能夠有效改善脂質(zhì)代謝紊亂，是養(yǎng)生茶中不可忽視的關(guān)鍵成分。此外，其他活性成分如原花青素B2、蘆丁和錦葵色素等也在降脂過程中發(fā)揮重要作用。這些物質(zhì)通過不同機(jī)制共同作用于脂質(zhì)代謝的各個(gè)環(huán)節(jié)，且可能存在協(xié)同效應(yīng)，例如咖啡堿與兒茶素的聯(lián)合使用不僅增強(qiáng)脂肪分解效果，還通過抑制脂質(zhì)吸收和合成進(jìn)一步提升降脂功效[30]。此外，槲皮素與柚皮素共同作用可顯著降低炎癥水平，優(yōu)化脂質(zhì)代謝環(huán)境[33]。綜合來看，養(yǎng)生茶中的這些成分通過AMPK通路、PPAR信號(hào)通路以及脂解調(diào)控等多種機(jī)制協(xié)同作用，顯著改善了脂質(zhì)代謝紊亂。本研究從代謝組學(xué)角度闡明了養(yǎng)生茶中活性成分的作用機(jī)制，為開發(fā)基于脂質(zhì)代謝調(diào)控的功能性茶飲提供了技術(shù)指導(dǎo)。

近年來，新式茶飲快速發(fā)展、競爭激烈，新式茶飲品類的訂單量在美團(tuán)外賣的百余種餐飲細(xì)分品類中占10.6%，排名居于榜首[34-35]。本研究的養(yǎng)生茶配方可應(yīng)用于新式茶飲中，若能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；?、品牌化等方面的建設(shè)，便能使其具有有更強(qiáng)的發(fā)展動(dòng)力[36]。本文研究結(jié)果為發(fā)酵白化茶新式茶飲的開發(fā)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。