燕麥AsDof6.5基因的克隆及其在低氮脅迫下的表達(dá)分析

摘要：為篩選與燕麥（Avena sativa L.）耐低氮相關(guān)的Dof類基因，本研究以燕麥耐低氮品種‘加燕2號’和不耐低氮品種‘青永久016’為試驗材料，在低氮脅迫下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序獲得一個與耐低氮相關(guān)的差異表達(dá)基因AsDof6.5。通過PCR擴(kuò)增獲得AsDof6.5基因編碼區(qū)無內(nèi)含子、開放閱讀框含有858 bp和編碼285個氨基酸，理論等電點為8.63和蛋白分子量為29 550.01 Da，并獲得AsDof6.5基因啟動子區(qū)域序列2227 bp。啟動子分析預(yù)測表明，該區(qū)段包含脫落酸、茉莉酸以及防御應(yīng)激反應(yīng)等與逆境脅迫相關(guān)的多個順式作用元件。蛋白質(zhì)序列分析表明，AsDof6.5具有高度保守的zf-Dof結(jié)構(gòu)域，屬于AsDof基因家族成員。系統(tǒng)進(jìn)化樹及同源比對表明，燕麥AsDof6.5蛋白與黑麥草（Lolium rigidum L.）和多年生黑麥草（Lolium perenne L.）同源蛋白親緣關(guān)系最近，且與其他禾本科植物Dof蛋白同源比較一致性為73.99%，但zf-Dof結(jié)構(gòu)域一致性高達(dá)99.50%，具有高度保守性，說明可能具有類似的功能。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示AsDof6.5蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中。熒光定量PCR（RT-qPCR）結(jié)果表明，低氮脅迫下AsDof6.5基因的表達(dá)量極顯著下降（Plt;0.01），且根中幾乎不表達(dá)，葉中的表達(dá)量是根中的100倍左右。因此推測，在燕麥耐低氮過程中，AsDof6.5基因可能在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中發(fā)揮重要作用，為探索AsDof6.5基因的功能及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：燕麥；低氮脅迫；AsDof6.5；基因表達(dá)

中圖分類號：S544.9" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A" " " " 文章編號：1007-0435（2025）02-0360-10

Isolation and Expression of AsDof6.5 Gene in Oat under Low Nitrogen Stress

WANG Yue1，2， GUO jing1，2， ZHANG Yin-cui1，2， LI Jing1，2， QI Cun-ying1，2， ZHOU Tong-yong1，2*

（1.School of Ecology and Environmental Science， Qinghai Institution of Technology， Xining， Qinghai Province 810016， China；

2.Qinghai Provincial Key Laboratory of Plateau Climate Change and Corresponding Ecological and Environmental Effects， Xining， Qinghai

Province 810016， China）

Abstract：In order to explore Dof genes related to low nitrogen stress in oat， we obtained a differentially expressed AsDof6.5 gene from strong tolerance to the low N stress variety ‘Jiayan 2’ and poor tolerance to the low N stress variety ‘Qingyongjiu 016’ through the transcriptional sequencing in low nitrogen stress. Promoters and coding regions of AsDof6.5 gene were amplified using sequencing PCR. Bioinformatics analysis showed that the length of the AsDof6.5 gene contained an 858 bp open reading frame， encoded 285 amino acids， had a theoretical isoelectric point of 8.63 and a predicted molecular weight of 29 550.01 Da. The results showed that the AsDof6.5 promoter region contained cis-acting elements which were related to adversity stress， such as abscisic acid， jasmonic acid， and defense against stress response. Protein sequence alignment showed that AsDof6.5 was highly conserved structural domains of zf-Dof， belonging to Dof gene family. Phylogenetic tree and protein sequence alignment analysis showed that the AsDof6.5 protein was relatively the closest to LrDof4 and LpDof4， and the homology comparison concordance with other Poaceae Dof proteins was 73.99%， but the concordance of the zf-Dof structural domain was as high as 99.50%， suggesting that it might have a similar function. Subcellular localization results showed that AsDof6.5 was localized in the nucleus and cell membrane. Quantitative PCR results showed that the expression of AsDof6.5 gene significantly decreased （Plt;0.01） under low-nitrogen stress in strong tolerance to the low N stress variety ‘Jiayan 2’ and poor tolerance to the low N stress variety ‘Qingyongjiu 016’， it was almost not expressed in roots， and the expression in leaves was about 100 times higher than that in roots. Therefore， it hypothesized that AsDof6.5 gene might play an important role in the cell nucleus and cell membrane during the process of low nitrogen tolerance in oats， which laid a foundation for exploring the function and regulatory mechanism of AsDof6.5 gene.

Key words：Oat；Low nitrogen stress；AsDof6.5；Gene expression

燕麥（Avena sativa L.）屬禾本科燕麥屬，具有二倍體，四倍體和六倍體體質(zhì)，是一種在生態(tài)條件脆弱的地區(qū)不可替代的糧飼兼用型作物，具有耐貧瘠、耐鹽堿、耐旱、耐寒等特點［1-3］。燕麥?zhǔn)且环N生長迅速，可口、多汁、有營養(yǎng)的冬季飼料作物，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物和微量元素，能增強(qiáng)牛羊體質(zhì)和品質(zhì)［4-5］。燕麥也被用作藥用植物，可以增強(qiáng)身體免疫力，穩(wěn)定糖尿病時的血糖水平，在心臟病方面也顯示出治療效果，具有抗癌活性［6-7］。

氮是植物三大營養(yǎng)元素中最重要的大量元素之一，對植物的生長發(fā)育至關(guān)重要，直接影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì) ［8-10］。為提高農(nóng)作物產(chǎn)量，我國化肥施用量增長迅速，是世界使用氮肥最多的國家，占全球氮肥用量30%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超于世界平均水平［10-11］。然而，過度施用氮肥也會造成糧食產(chǎn)量增長緩慢、易倒伏和出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，不僅影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，而且也引發(fā)了過量氮污染引起的水生態(tài)環(huán)境安全問題［12-13］。目前，中國氮肥利用效率平均是25%～35 %，在中國發(fā)達(dá)和不發(fā)達(dá)的城市之間氮肥利用效率的差距達(dá)到70 %左右，且與世界其他主要地區(qū)氮肥利用效率52%～67 %仍然存在很大的差距［14］。為了滿足氮肥需求并最大限度地減少環(huán)境問題，需要在生產(chǎn)過程中提高氮肥的利用效率［15］。因此，減少化肥使用量，提高作物生產(chǎn)效率，優(yōu)先保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)高質(zhì)量發(fā)展，創(chuàng)造高品質(zhì)生活，在作物種植區(qū)發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)具有重要意義。

Dof基因是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子，廣泛響應(yīng)生物和非生物脅迫，對植物的生長發(fā)育起重要調(diào)控作用。其中，第一個被鑒定出來的Dof轉(zhuǎn)錄因子是來自玉米（Zea mays L.）的ZmDof1，參與光調(diào)節(jié)過程［16］。研究表明，耐低氮相關(guān)基因的挖掘及功能分析報道較多［8， 17-19］。Huang等人［17］在水稻（Oryza sativa L.）中發(fā)現(xiàn)OsDof11基因促進(jìn)幼苗植株和有效葉片對氮素的吸收，并在開花期保持了植株的鮮干比。OsDof11基因通過糖的分配影響氮素代謝，為水稻協(xié)同碳、氮平衡維持生長發(fā)育提供了新的思路。低氮脅迫下，與野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）相比，過表達(dá)dof1植株長勢較好，未出現(xiàn)缺氮表型［18］，且和 GS 蛋白的結(jié)合可能會改善低氮條件下氮營養(yǎng)的吸收和利用［8］。郝青南等人通過對大豆［Glycine max （L.） Merr.］耐低氮品種‘坡黃’和不耐低氮品種‘84-70’進(jìn)行RNA-Seq分析，從中篩選出兩個大豆耐低氮相關(guān)候選基因Gmduf-cbs和Gmdof1.4；將這兩個基因分別轉(zhuǎn)化擬南芥后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥在低氮水平的條件下有更高效的氮利用率［19］。然而，目前關(guān)于燕麥在低氮脅迫下的分子機(jī)制研究仍相對匱乏。

本研究通過分析耐低氮與不耐低氮燕麥品種在不同氮處理下根和葉的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，系統(tǒng)鑒定與燕麥耐低氮相關(guān)的差異mRNAs，獲得差異表達(dá)的AsDof類基因。利用PCR技術(shù)在耐低氮品種‘加燕2號’中克隆了AsDof6.5基因，并采用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測其序列的結(jié)構(gòu)、生理生化特性；同時分析AsDof6.5蛋白與其他禾本科植物蛋白的同源比對及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等。為進(jìn)一步研究AsDof6.5基因的功能，對其進(jìn)行啟動子分析、亞細(xì)胞定位和該基因在不同氮水平下的表達(dá)模式分析。研究結(jié)果將有助于解析耐低氮AsDof6.5基因在燕麥氮脅迫時的調(diào)控作用，為探討燕麥耐低氮分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

耐低氮品種‘加燕2號’和不耐低氮品種‘青永久016’［20］，均由青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院劉文輝課題組提供。

1.2 燕麥不同氮處理下DNA提取、總RNA的提取及cDNA合成

利用TaKaRa公司植物DNA和RNA提取試劑盒分別提取不同氮處理下‘加燕2號’和‘青永久016’葉和根中的DNA及RNA，同時參考姚曉華等［21］文中測定青稞DNA及RNA濃度和純度的方法，將提取完整的RNA合成cDNA，用于克隆AsDof6.5基因CDS區(qū)，并調(diào)整cDNA濃度均為500 ng?μL-1作為燕麥在不同氮處理下表達(dá)模式分析的模板。

1.3 燕麥耐低氮相關(guān)AsDof6.5基因CDS區(qū)及啟動子區(qū)的克隆

利用Primer 5.0軟件設(shè)計AsDof6.5基因CDS區(qū)及其啟動子區(qū)的擴(kuò)增引物分別為AsDof6.5-F/R和Promoter-AsDof6.5-F/R（詳見表1），以耐低氮品種‘加燕2號’葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（諾唯贊高保真酶P515-01）。PCR擴(kuò)增體系150 μL，其中2×Phanta Max Master Mix緩沖液75 μL，AsDof6.5-F/R各6 μL（10 μmol?L-1）、PCR Enhancer（諾唯贊P021-01）15 μL，cDNA模板6 μL，ddH2O補(bǔ)足至150 μL平均分裝到12聯(lián)排管中用于后續(xù)試驗做梯度PCR。PCR反應(yīng)條件：98℃ 5 min，（98℃ 15 s， 50℃～62℃ 30 s， 72℃ 1 min）35個循環(huán)，72℃ 5 min。目的片段切膠回收、載體構(gòu)建參考姚曉華等［21］文中方法，并進(jìn)行菌落PCR驗證，選取陽性克隆測序，其中菌落PCR擴(kuò)增體系（諾唯贊P112-01）：2×Taq Master Mix 10 μL，AsDof6.5-F/R，挑取單菌落，加ddH2O至20 μL；菌落PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 5 min，（95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min）35個循環(huán)，72℃ 5 min。AsDof6.5基因啟動子區(qū)域PCR擴(kuò)增過程參考CDS區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增引物Promoter-AsDof6.5-F/R詳見表1。

1.4 燕麥耐低氮相關(guān)AsDof6.5基因的生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ExPASY，NetPhos，SignalP和TMHMM預(yù)測AsDof6.5蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、磷酸化位點、蛋白信號肽結(jié)構(gòu)和蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用PSIPRED （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/amp;uuid=49527a56-bbfc-11ed-acea-00163e100d53）軟件分析AsDof6.5蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；采用ESMFold對AsDof6.5進(jìn)行蛋白建模，PyMOL 3.0軟件對蛋白建模結(jié)果進(jìn)行分析。AsDof6.5基因的蛋白序列在NCBI中Blastp查詢與AsDof6.5蛋白同源的其他物種蛋白序列，用DNAMAN6.0進(jìn)行多序列比對，MEGA 7構(gòu)建進(jìn)化樹。利用NCBI Batch CD-search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析測序成功的燕麥AsDof6.5蛋白的結(jié)構(gòu)域。用MEGA 7構(gòu)建燕麥AsDofs和水稻OsDofs蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定AsDof6.5蛋白與水稻同源蛋白為OsDof4。通過在線軟件STRING 9.0（http：//string.embl.de/）進(jìn)行OsDof4蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析并預(yù)測與AsDof6.5蛋白互作的蛋白。PCR擴(kuò)增獲得的AsDof6.5基因啟動子區(qū)域分析參考吳瑞等人［22］文中方法。

1.5 燕麥耐低氮相關(guān)AsDof6.5基因表達(dá)模式分析

1.5.1 燕麥耐低氮相關(guān)AsDof6.5亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建 AsDof6.5基因亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建采用Gateway技術(shù)［23-24］，設(shè)計帶有attB位點的PCR引物attBAsDof6.5-F/R（詳見表1）進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增、切膠回收、酶切-連接反應(yīng)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，菌落PCR檢測，質(zhì)粒抽提等一些列過程，最后通過BP和LR反應(yīng)完成AsDof6.5基因亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建［24］。并參考吳瑞等［22］文中方法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并制備重懸液，利用1 mL去針頭的醫(yī)用注射器將制備好的重懸液注射本氏煙草葉片底部，并把注射本氏煙草的范圍用記號筆圈出來做好標(biāo)記，放置黑暗條件，25℃左右處理2～3 d，在青海大學(xué)國家重點實驗室中利用尼康（NIKON）激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.5.2 燕麥耐低氮相關(guān)AsDof6.5基因表達(dá)量檢測 利用水培方法，取適量大小一致的耐低氮品種‘加燕2號’和不耐低氮品種‘青永久016’燕麥種子，氮處理濃度采用正常氮80 mg·L-1 NH4NO3（硝酸銨）、低氮10 mg·L-1 NH4NO3和無氮0 mg·L-1 NH4NO3，其中燕麥長至三葉期時進(jìn)行低氮和無氮脅迫處理，15 d后采樣。根據(jù)擴(kuò)增獲得的燕麥耐低氮相關(guān)AsDof6.5基因序列，利用在線軟件genscript（https：//www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool）設(shè)計AsDof6.5基因定量引物qPCR-AsDof6.5-F/R（詳見表1）。以AsActin-F/R為內(nèi)參基因（引物序列詳見表1），利用TB Green? Premix Ex Taq?（TaKaRa公司）試劑進(jìn)行RT-qPCR驗證。實驗結(jié)果應(yīng)用2–ΔΔCt法計算AsDof6.5基因在不同氮處理下的相對表達(dá)量［25］，利用SPSS軟件進(jìn)行顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 燕麥AsDof6.5基因的克隆與序列分析

以燕麥耐低氮品種‘加燕2號’葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以AsDof6.5-F/R為引物（詳見表1）， 擴(kuò)增獲得一條約900 bp的CDS目的條帶。測序結(jié)果拼接完成后，AsDof6.5基因的核苷酸序列與燕麥參考基因組核苷酸序列長度相同均為858 bp，其中有8個堿基不同，一致性99.07%；AsDof6.5蛋白序列與燕麥參考基因組蛋白序列長度相同為285個氨基酸，其中有4個氨基酸不同，一致性98.6%。利用NCBI Batch CD-search在線工具對285個氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的zf-Dof結(jié)構(gòu)域（氨基酸位置47～97），屬于Dof轉(zhuǎn)錄因子家族。

2.2 燕麥AsDof6.5蛋白理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測

燕麥AsDof6.5蛋白理化性質(zhì)分析表明，該基因編碼285個氨基酸、蛋白分子量為29 550.01 Da、總原子數(shù)為4078、蛋白分子式為C1298H1999N365O405S11、親水系數(shù)為-0.327、理論等電點為8.63、不穩(wěn)定指數(shù)為72.04（不穩(wěn)定蛋白）、脂溶性指數(shù)為56.00。信號肽及跨膜預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，AsDof6.5蛋白都不具有信號肽結(jié)構(gòu)且不具有跨膜結(jié)構(gòu)。通過對AsDof蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白二級結(jié)構(gòu)包含α螺旋、擴(kuò)展長鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲四種結(jié)構(gòu)，分別含有49，36，18，182個氨基酸殘基（圖1A）。對AsDof6.5蛋白進(jìn)行建模發(fā)現(xiàn)該蛋白的zf-Dof結(jié)構(gòu)域主要由無規(guī)則卷曲和β-折疊構(gòu)成（圖1B）?？梢娫摶蚣捌浣Y(jié)構(gòu)域是以無規(guī)則卷曲為主，在蛋白行使功能時可能發(fā)揮重要作用。

2.3 燕麥AsDof6.5與其他禾本科植物Dof蛋白同源比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析

燕麥AsDof6.5與黑麥草（Lolium rigidum）、節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii）、大麥（Hordeum vulgare）、二粒小麥（Triticum dicoccoides）、小麥（Triticum aestivum）、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha）、柳枝稷（Panicum virgatum）、多年生黑麥草（Lolium perenne）、水稻（日本晴，Oryza sativa），黍（Panicum miliaceum）、粟（Setaria italica）、玉米（Zea mays）、狗尾草（Setaria viridis）、高粱（Sorghum bicolor）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的Dof蛋白序列相似性為73.99%，這些序列都具有高度保守的zf-Dof結(jié)構(gòu)域（圖2）。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，17種禾本科植物共聚為3類，其中燕麥AsDof6.5蛋白與黑麥草和多年生黑麥草親緣關(guān)系最近（圖3）。

2.4 燕麥AsDof蛋白互作預(yù)測分析

通過構(gòu)建燕麥AsDof與水稻OsDof蛋白家族進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)AsDof6.5蛋白與水稻OsDof蛋白家族同源的蛋白為DOF4（基因ID：Os02g0726300），并利用在線軟件STRING預(yù)測與水稻DOF4互作的潛在互作蛋白（圖4），圖中節(jié)點和線的含義參考姚曉華等［21］和王越等［26］文中解釋。將水稻中與DOF4互作的蛋白序列調(diào)取出來利用在線軟件UniProt預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)及在燕麥轉(zhuǎn)錄組測序的序列比對，最終確定AsWRKY51，AsWRKY3，AsDof5.10，AsCKX2和AsCKX6基因（基因ID：AVESA.00001b.r3.2Cg0001569，AVESA.00001b.r3.2Ag0000859，AVESA.00001b.r3.5Dg0000828、AVESA.00001b.r3.3Cg0001961和novel.19137）編碼的蛋白可能與燕麥AsDof6.5蛋白互作。

2.5 燕麥氮脅迫相關(guān)基因AsDof6.5表達(dá)模式分析

2.5.1 AsDof6.5亞細(xì)胞定位研究 將帶有綠色熒光信號載體的農(nóng)桿菌EHA105注射本氏煙草葉片中，利用激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)AsDof6.5蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)綠色熒光信號，最終判定AsDof6.5蛋白定位于細(xì)胞核和細(xì)胞膜中（圖5）。

2.5.2 AsDof6.5基因啟動子分析 利用PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得一條約2227 bp的目的條帶。經(jīng)測序鑒定后通過在線軟件PlantCARE對AsDof6.5基因的順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，AsDof6.5基因啟動子區(qū)域包含22種類型85個順式作用元件，其中7個脫落酸（ABRE）、4個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG-motif）和1個防御應(yīng)激反應(yīng)（TC-rich repeats）均與逆境脅迫相關(guān)。此外還有與分生組織表達(dá)、生長素和光響應(yīng)等相關(guān)的其他作用元件（圖6）。

2.5.3 燕麥AsDof6.5基因表達(dá)分析 通過RT-qPCR分析檢測燕麥AsDof6.5基因在不同氮處理（正常、低氮和無氮）下的表達(dá)量變化（圖7），結(jié)果表明，燕麥AsDof6.5基因在根中幾乎不表達(dá)，葉中的表達(dá)量是根中的100倍左右?！友?號’隨著氮濃度的降低，葉中AsDof6.5基因表達(dá)量出現(xiàn)先降低后增加的趨勢；‘青永久016’隨著氮濃度的降低，葉中AsDof6.5基因表達(dá)量顯著上升。

3 討論

研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物基因表達(dá)、應(yīng)激反應(yīng)和進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要作用［27］，其中，Dof轉(zhuǎn)錄因子家族主要參與光調(diào)控、植物激素、植物生長發(fā)育和防御反應(yīng)等［28-30］。第一個被鑒定出來的Dof轉(zhuǎn)錄因子是來自玉米的ZmDof1，參與光調(diào)節(jié)過程［16］；因此，燕麥AsDof6.5蛋白可能參與了調(diào)控植物的生長發(fā)育、光調(diào)控和抗逆性等［27-28］。本研究AsDof6.5蛋白具有典型的鋅指結(jié)構(gòu)域，包含CX2CX21CX2C基序（氨基酸位置49～99位置），屬于Dof轉(zhuǎn)錄因子家族一員［31-32］。AsDof6.5亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中，由此推測在燕麥耐低氮過程中，轉(zhuǎn)錄因子AsDof6.5在細(xì)胞核和細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)揮重要作用。燕麥AsDof6.5與禾本科其他植物Dof蛋白一致性為73.99%，但是Dof結(jié)構(gòu)域的一致性為99.50%，高度保守的結(jié)構(gòu)域可能在調(diào)控功能基因的表達(dá)中起重要作用，這與Dof轉(zhuǎn)錄因子的保守區(qū)域與基因的上游啟動子區(qū)域結(jié)合調(diào)控下游基因的表達(dá)，增強(qiáng)或抑制植物的生物和非生物脅迫相一致［33］。但Dof基因家族高度保守的結(jié)構(gòu)域是否在燕麥耐低氮中發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，燕麥AsDof6.5與黑麥草LrDof4和多年生黑麥草LpDof4親緣關(guān)系最近，且Dof基因的功能在禾本科植物中的抗逆機(jī)制都有報道［34-35］。

在真核細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控是基因表達(dá)的主要決定因素，它是在特定DNA序列（順式調(diào)控元件）的控制下進(jìn)行的，順式和反式作用調(diào)控元件的鑒定為基因表達(dá)控制提供了重要的機(jī)制［36］。順式調(diào)控元件是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要分子開關(guān)，控制著植物許多種生物及非生物脅迫，如生長發(fā)育、激素應(yīng)答、非生物和生物脅迫等［37］。例如，ABRE 是啟動子區(qū)域的一個保守順式作用元件，脫落酸通過它激活下游基因的表達(dá)［38］。在菠菜中，通過順式作用元件預(yù)測分析SoDofs基因啟動子區(qū)域可能與下游結(jié)構(gòu)基因結(jié)合參與了植物的生長發(fā)育、植物激素和脅迫反應(yīng)［35］。此外，富含TC-rich repeats元件是公認(rèn)的與植物防御和逆境有關(guān)的順式作用元件［39］。本研究AsDof6.5基因啟動子區(qū)域上也具有非生物和生物脅迫等的多種表達(dá)元件，如ABRE，TC-rich repeats等可能具有不同的抗逆功能?？傊?，這些結(jié)果有助于我們更好的理解燕麥AsDof6.5基因在抗逆中發(fā)揮的潛在作用。

在植物生長發(fā)育過程中，大多數(shù)植物都發(fā)展出了一些適應(yīng)非生物脅迫的機(jī)制［40］。氮是植物需求量最大的礦質(zhì)養(yǎng)分，也是限制植物生長發(fā)育的主要因素，其應(yīng)用已被證明是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵［41-42］。氮缺乏是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常見的問題之一，限制作物的生長和生產(chǎn)，影響作物的品質(zhì)［43］。從綠藻到被子植物，Dof蛋白在植物中普遍存在，是一類獨特的具有雙功能結(jié)合活性的轉(zhuǎn)錄因子，與DNA和蛋白質(zhì)均可結(jié)合，以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞中復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄機(jī)制［44］，且已經(jīng)被證明可以與其他蛋白互作［45-48］。本研究獲得的AsDof6.5又與水稻OsDof4聚為一類在功能發(fā)揮中可能存在類似的作用。通過預(yù)測水稻OsDof4的互作蛋白進(jìn)行序列比對預(yù)測確定燕麥AsDof6.5蛋白與AsWRKY51，AsWRKY3，AsDof5.10，AsCKX2和AsCKX6蛋白互作。前人研究表明，在水稻中OsDof11能夠直接調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂素降解基因OsCKX4，進(jìn)而調(diào)控植株組織細(xì)胞分裂素含量，同時細(xì)胞分裂素又能夠誘導(dǎo)OsDof11的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［49］。但OsDof11的缺失表現(xiàn)為冠根數(shù)量減少，氮同化活性降低，細(xì)胞分裂素和生長素含量降低［50］，而作物應(yīng)對氮素缺乏的一個重要的適應(yīng)策略是根部伸長，從而獲得更多的土壤空間和氮素資源［51］。因此，推測燕麥耐低氮過程中AsDof6.5蛋白與AsCKX2和AsCKX6蛋白互作共同調(diào)控燕麥耐低氮過程。以上研究結(jié)果與本研究中燕麥耐低氮品種‘加燕2號’與不耐低氮品種‘青永久016’在低氮脅迫下AsDof6.5基因葉中表達(dá)量上升和根中表達(dá)量下降且耐低氮品種表達(dá)量顯著高于不耐低氮品種研究結(jié)果類似，推測其有類似的耐低氮機(jī)制。綜上該研究結(jié)果為探索AsDof6.5基因調(diào)控燕麥耐低氮機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步研究燕麥耐低氮品種選育提供借鑒和支持。

4 結(jié)論

本研究在不同氮水平下從‘加燕2號’和‘青永久016’的 RNA-seq結(jié)果中獲得一個差異表達(dá)的基因AsDof6.5。該基因編碼258個氨基酸，具有典型的zf-Dof結(jié)構(gòu)域，屬于Dof家族成員。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示AsDof6.5蛋白定位在細(xì)胞核和細(xì)胞膜中。RT-qPCR結(jié)果顯示，燕麥AsDof6.5基因在不同氮水平下根中表達(dá)量幾乎為0，葉中的表達(dá)量是根中的100倍左右；低氮脅迫后‘加燕2號’葉中AsDof6.5基因表達(dá)量出現(xiàn)先降低后增加的趨勢；‘青永久016’隨著氮濃度的降低，葉中AsDof6.5基因表達(dá)量顯著上升。推測AsDof6.5基因在燕麥耐低氮過程中發(fā)揮重要作用。

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（責(zé)任編輯" 付宸）