地毯草擴張蛋白基因AcEXPA1的克隆與表達分析

摘要：為探索α-擴張蛋白（α-expansin，EXPA）基因參與鋁毒害下對植物生長發(fā)育的調控作用，本研究分析了鋁處理對地毯草（Axonopus compressus）生長的影響，克隆了地毯草AcEXPA1基因，并進行了生物信息學和基因表達分析。結果表明：與不加鋁相比，鋁處理抑制了地毯草根系生長，降低了總根長、根表面積和根體積。地毯草AcEXPA1基因全長為774 bp，編碼257個氨基酸殘基，蛋白分子量為27.7 kDa。AcEXPA1蛋白具有信號肽，被預測定位于胞外基質。實時定量PCR結果表明，AcEXPA1基因在地毯草根中的表達量高于葉中的表達量，且在距離根尖1～2 cm根段中的表達量最高。鋁處理增強了AcEXPA1基因在地毯草根中的表達，但鎘和鑭處理對基因表達無顯著影響。不同鋁濃度和時間處理結果進一步表明鋁增強了AcEXPA1基因的表達。本研究結果為解析地毯草適應鋁毒害的機理提供了候選基因資源。

關鍵詞：地毯草；鋁毒害；基因表達；擴張蛋白

中圖分類號：" " " " 文獻標識碼：" " " " 文章編號：1007-0435（2025）02-0351-09

Cloning and Expression Analysis of AcEXPA1 in Axonopus compressus

LIU Li-ting1，2， GAO Jia-miao1， ZHOU Hong-ming1， LI Ji-fu1， WANG Zhi-yong1，2*， CHEN Zhi-jian3，4*

（1.College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China；2.Sanya Nanfan Research

Institute，Hainan University， Sanya， Hainan Province 572025， China；3.Institute of Tropical Crop Genetic Resources， Chinese Academy of

Tropical Agriculture Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affair， Haikou， Hainan Province 571101， China；4.National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding， Sanya， Hainan Province 572024， China）

Abstract：To explore the roles of α-expansin （EXPA） gene in regulation of plant growth and development under aluminum （Al） toxicity， the effects of Al treatments on the growth of carpetgrass （Axonopus compressus） were analyzed. And AcEXPA1 was cloned for bioinformatic and gene expression analyses. The results showed that Al toxicity inhibited carpetgrass root growth， as reflected by reduced total root length， root surface area and root volume， compared to the control without Al. The full length of AcEXPA1 is 774 bp， encoding 257 amino acid residues. Molecular weight of AcEXPA1 is 27.7 kDa. The AcEXPA1 protein includes a signal peptide and was predicted to be localized to the extracellular matrix. Real-time quantitative PCR analysis showed that AcEXPA1 exhibited higher expression in roots than in leaves， and AcEXPA1 mainly expressed in 1～2 cm root segment away from the root tip. The expression of AcEXPA1 was significantly enhanced in root of carpetgrass by Al but not cadmium and lanthanum treatments. Moreover， the results from different Al concentration and duration treatment confirmed that Al enhanced the expression of AcEXPA1 in carpetgrass roots. This study provides a candidate gene resource for dissecting the Al tolerance mechanisms in carpetgrass.

Key words：Axonopus compressus；Aluminum toxicity；Gene expression；Expansin

鋁（Aluminum，Al）是一種金屬元素，約占地殼元素的8%，是僅次于氧和硅的第三豐富元素［1］。雖然大多數鋁以氧化物和硅酸鋁等對植物無毒害作用的形式存在［1］，但是，在pH值低于5.5的酸性土壤中，鋁主要以三價鋁離子（Al3+）的形式存在，微摩爾濃度的鋁離子就會對植物造成毒害［2-3］。植物鋁中毒的癥狀主要表現在根系生長受到抑制，根系形態(tài)發(fā)生改變，如根尖腫脹、根毛萎縮［4］。鋁會影響根尖細胞的分裂和伸長［5］，導致細胞排列不規(guī)則，細胞壁增厚［6］，進而影響根系對水分和養(yǎng)分的吸收［7］。

研究表明，植物根尖在感知鋁毒性方面起決定性作用［8］。因此，植物對鋁的耐受性機制主要依賴于對根系的研究［9］。植物耐鋁的機制包括外部排斥和內部耐受兩種機制。一方面，植物可以通過根系分泌有機酸或酚類化合物螯合鋁離子，改變細胞壁特性以及使根際堿化等外部排斥機制，提高耐鋁性［10-11］。另一方面，植物可以通過激素調節(jié)、抗氧化防御系統和液泡區(qū)隔化等內部解毒方式，緩解鋁毒害［12］。其中，通過調節(jié)根細胞壁特性是緩解植物鋁毒害的重要適應性策略［13-14］。擴張蛋白（Expansins）是一組位于細胞壁并參與細胞壁延伸和擴張的松弛蛋白［15］。擴張蛋白是一個多基因家族編碼，可分為α-擴張蛋白（EXPA）、β-擴張蛋白（EXPB）、擴張蛋白樣A蛋白（EXLA）和擴張蛋白樣B蛋白（EXLB）［16-17］。其中，α-擴張蛋白基因被報道可以通過調控根系生長，參與植物對鋁毒害的響應［18］，如水稻（Oryza sativa）α-擴張蛋白OsEXPA10［19］和大麥（Hordeum vulgare）α-擴張蛋白HvEXPA1基因［20］。OsEXPA10被報道定位于水稻根尖細胞中，敲除OsEXPA10會抑制水稻根系的生長［19］。另外，HvEXPA1是一個定位于質膜上的鋁誘導α-擴張蛋白基因，沉默HvEXPA1會加重鋁毒害對大麥根系生長的抑制［20］。

地毯草（Axonopus compressus）是中國和世界熱帶、亞熱帶地區(qū)重要的多年生暖季型草坪草，是一種具有功能性和觀賞性用途的園藝植物［21-22］。另外，地毯草是一種耐鋁的草坪草植物，被認為是酸性土壤中鋁毒性的生物指標［23］。研究發(fā)現，鋁抑制根系生長是地毯草鋁毒害的主要癥狀，且不同基因型地毯草對鋁毒害的適應性存在差異［24-26］。然而，迄今為止，已有研究主要集中在地毯草的鋁毒耐受性上，關于地毯草耐鋁毒的分子機制仍不清楚。因此，本研究分析了耐鋁地毯草基因型“A58”對鋁毒害的生長響應，克隆并分析了AcEXPA1基因，為解析地毯草耐鋁機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為地毯草種質A58，由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養(yǎng)與處理 將含有兩個莖節(jié)的地毯草匍匐莖置于1/2 Hoagland營養(yǎng)液（pH值5.8）中培養(yǎng)7 d，隨后選取根長5 cm的幼苗進行不同處理。由于0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液可以有效地維持植物細胞的滲透壓，可為根系提供一個合適的離子環(huán)境，因此，本試驗處理在0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液中進行。地毯草幼苗在0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液中漂洗3次，以去除殘留的營養(yǎng)元素。在光照培養(yǎng)箱中進行以下處理：（1）參考李季膚等［25］方法，在0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液中，進行5個不同鋁濃度處理，分別為0（CK），50，100，200和400 μmol·L-1 AlCl3，處理液pH值為4.2，處理時間為48 h；（2）參考張郎織等［26］方法，在0.5 mmol·L-1 CaCl2溶液中，進行不同金屬處理，包括0（CK），200 μmol·L-1 AlCl3，40 μmol·L-1 CdCl2和20 μmol·L-1 LaCl3，處理液pH值為4.2，處理時間為48 h；（3）參考李季膚等［25］方法，在200 μmol·L-1 AlCl3溶液（pH值4.2）中，設置不同時間處理，分別為0，6，12，24和48 h。以上處理結束后，收獲根系用于RNA提取和基因表達分析，每個處理設置3個生物學重復，每個重復4株苗。另外，地毯草在1/2 Hoagland營養(yǎng)液（pH值5.8）中培養(yǎng)30 d后，收獲根和葉以及不同根段樣品用于RNA提取和基因表達分析。

1.2.2 根系參數測定 參考張郎織等［26］方法，使用根系掃描儀（EPSON，日本）掃描地毯草根系，隨后用WinRHIZO（Regent，加拿大）軟件分析不同處理下地毯草的總根長、根表面積和根體積。

1.2.3 鋁濃度的測定 收獲鋁處理后的地毯草地上部和根部樣品，于105 ℃下殺青30 min，并于65 ℃烘干至恒重。隨后磨碎樣品，稱取0.05 g樣品，置于馬福爐中，400 ℃灰化1 h，600 ℃灰化10 h。樣品完全灰化后，加入8 mL 100 mmol·L-1 HCl充分溶解樣品。參考Miao等［17］方法，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀710-ES（Varian，美國）測定樣品鋁濃度。

1.2.4 RNA提取和cDNA合成 參照TRIzol（Tiangen，中國）方法，提取地毯草根和葉RNA。取0.1 g植物鮮樣，加入1 mL TRIzol提取液，在破碎機中充分破碎樣品。加入200 μL三氯甲烷，震蕩混勻，室溫放置3 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，吸上清至新的1.5 mL離心管中，加入500 μL異丙醇，充分混勻，置于-20 ℃中放置1 h。4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入1 mL無水乙醇，充分洗滌沉淀，4 ℃ 1000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇，4 ℃ 1000 r·min-1離心5 min，棄上清，用槍頭吸出殘留液體，風干沉淀，加入30 μL無RNase ddH2O溶解RNA。

cDNA合成參考HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒方法。在PCR管中加入4 μL RNA、4 μL 4×gDNA wiper Mix和8 μL RNase ddH2O，輕輕混勻，42 ℃反應2 min，置于冰上，加入4 μL 5×HiScript III qRT SuperMix，輕輕混勻，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，獲得cDNA，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 地毯草AcEXPA1基因克隆 基于AcEXPA1基因（GenBank登錄號PP327409）序列，設計上下游基因全長克隆引物（表1）。以根系cDNA為模板，通過PCR擴增AcEXPA1基因全長。參考李季膚等［25］方法，PCR產物經膠回收、連接pMD18-T載體和測序分析后，確認AcEXPA1基因序列。

1.2.6 生物信息學分析 利用Expasy（https：//web.expasy.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進行蛋白質理化性質分析、保守結構域分析；使用SignalP 4.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）分別預測信號肽和亞細胞定位；采用MEGA 11軟件構建蛋白進化樹。

1.2.7 實時定量PCR（qPCR）分析 參考繆野等［9］方法，采用QuantStiduoTM Real-Time PCR（Thermo Fisher，美國）儀器進行qPCR分析。qPCR反應體系包括10 μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中國）、6 μL ddH2O、1 μL上游引物、1 μL下游引物和2 μL模板。反應程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量等于AcEXPA1基因表達量除以AcEF1a（看家基因）表達量［26］。qPCR引物如表1所示。

1.3 數據處理

數據采用Microsoft Excel 2021軟件進行處理和作圖，采用SPSS V26軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同鋁處理對地毯草根系生長的影響

本研究首先分析了不同鋁濃度處理對地毯草根系生長的影響。從圖1A可以看出，鋁處理抑制了地毯草根系生長，鋁處理濃度越高，根系生長受抑制程度越大。相對不加鋁（0 μmol·L-1）處理，50～400 μmol·L-1鋁處理下地毯草總根長被抑制了15.6%～39.7%，根表面積抑制了18.1%～38.3%，根體積抑制了20.5%～37.1%（圖1B-1D）。

2.2 不同鋁處理對地毯草干重及鋁濃度的影響

從圖2A和2B可以看出，雖然不同鋁處理間地毯草的地上部干重無顯著差異，但是，鋁處理抑制了地毯草根部干重。相對不加鋁（0 μmol·L-1）處理，100～400 μmol·L-1鋁處理下地毯草根部干重被抑制了23.1%～35.9%，差異顯著（Plt;0.05）（圖2B）。另外，鋁處理顯著增加了地毯草地上部和根部鋁濃度。相對不加鋁（0 μmol·L-1）處理，50～400 μmol·L-1鋁處理下地毯草地上部和根部鋁濃度分別增加了118.1%～580.4%和305.9%～675.3%，差異顯著（Plt;0.05）（圖2C和2D）。并且，在50～400 μmol·L-1鋁處理下，根部鋁濃度是地上部鋁濃度11.2～18.6倍，差異顯著（Plt;0.05）（圖2C和2D）。

2.3 地毯草AcEXPA1基因的克隆

本研究通過PCR方法，以地毯草根系cDNA為模板，擴增出AcEXPA1基因（圖3A）。通過對PCR產物進行測序分析，發(fā)現AcEXPA1基因全長核苷酸序列為774 bp，編碼258個氨基酸殘基（圖3B）。

2.4 AcEXPA1蛋白理化性質分析

AcEXPA1蛋白質分子量為27.7 kDa，理論等電點為8.7，為親水性蛋白。保守結構域分析表明，AcEXPA1屬于expansin家族，包括保守的Expansin_C和DPBB_1結構域，即EXPA結構域和跨膜結構域特征序列（圖4A）。用SignalP 4.1軟件預測AcEXPA1蛋白信號肽，發(fā)現該蛋白具有1個信號肽，位于N端第1至18個氨基酸殘基處（圖4B）。運用WoLF PSORT軟件進行亞細胞定位預測，發(fā)現AcEXPA1蛋白定位于胞外基質。

2.5 α-擴張蛋白EXPA多序列比對分析

本研究對地毯草AcEXPA1、水稻OsEXPA10和大麥HvEXPA1蛋白進行了多序列比對分析。從圖5可以看出，AcEXPA1與OsEXPA10蛋白具有較高的同源性，為87.5%，與HvEXPA1的同源性為44.1%。另外，AcEXPA1蛋白包括1個信號肽，8個保守的N端半胱氨酸（Cys，C）殘基、1個HFL基序和4個保守的色氨酸（Trp，W）殘基（圖5）。

2.6 AcEXPA1同源蛋白進化樹分析

為分析AcEXPA1蛋白與不同物種α-擴張蛋白EXPA的關系，本研究將AcEXPA1與水稻33個OsEXPA和擬南芥26個AtEXPA蛋白構建進化樹。如圖6所示，不同植物的EXPA蛋白可分為5組，AcEXPA1與水稻OsEXPA10以及擬南芥AtEXPA4/6同源性較高，被分在第一組中。表明AcEXPA1可能具有與OsEXPA10相似的參與根系生長調控的功能。

2.7 AcEXPA1基因組織表達分析

從圖7A可以看出，AcEXPA1基因在地毯草根和葉中均有表達，且在根中的表達量顯著高于在葉中的表達量。另外，AcEXPA1基因在距離根尖1～2 cm的根段中的表達量最高，在距離根尖0～1 cm根段中的表達量次之，而在距離根尖大于2 cm根段中的表達量最低（圖7B）。

2.8 不同金屬處理對AcEXPA1基因表達的影響

本研究進一步分析了鋁（A1）、鎘（Cd）和鑭（La）處理對AcEXPA1基因表達的影響。從圖8A可看出，與不加金屬對照（CK）處理相比，鋁處理顯著增加了AcEXPA1基因在地毯草根中的表達量，但鎘和鑭處理對AcEXPA1基因表達無顯著影響。在鋁處理下，AcEXPA1基因表達量是CK處理下的2.6倍，差異顯著（Plt;0.05）（圖8A）。

與不加鋁（0 μmol·L-1 A1）相比，添加不同濃度鋁處理均增強了AcEXPA1基因的表達，在200 μmol·L-1鋁處理下，AcEXPA1表達量最高，是不加鋁處理的2.4倍，差異顯著（Plt;0.05）（圖8B）。類似的，與0 h處理相比，6～48 h鋁處理均增強了AcEXPA1基因的表達，其中，在12 h鋁處理下，AcEXPA1表達量是0 h處理的2.9倍，差異顯著（Plt;0.05）（圖8C）。

3 討論

在酸性土壤中，鋁毒破壞植物根尖結構，抑制根系伸長，最終降低作物產量，而生長在酸性土壤地區(qū)的植物可以通過長期進化來適應鋁毒害［10］。地毯草是熱帶和亞熱帶地區(qū)重要的多年生暖季型草坪草，而這些地區(qū)也是酸性土壤分布的主要區(qū)域，表明地毯草對鋁毒具有較強的耐受性［24］。對地毯草、結縷草（Zoysia japonica）、假檢草（Eremochloa ophiuro）、狗牙根（Cynodon dactylon）、鈍葉草（Stenotaphrum secundatum）和海雀稗（Paspalum vaginatum）等草坪草的耐鋁性分析發(fā)現，地毯草在鋁毒害下表現出更好的生長性能，表現為鋁誘導的根生長抑制最小，且地上部和根部的生物量更高［27］。此外，對不同地毯草基因型耐鋁性進行分析，發(fā)現雖然鋁抑制了地毯草的生長，但地毯草的耐鋁能力表現出基因型差異，并篩選出包括“A58”的耐鋁地毯草基因型［22］。本研究結果發(fā)現，在鋁處理條件下，耐鋁地毯草“A58”的根部鋁濃度顯著高于地上部鋁濃度。因此，減少鋁從根部向地上部的轉運是地毯草耐鋁的生理機制（圖1和2）。

擴張蛋白是位于細胞壁的松弛蛋白，在植物生長發(fā)育中起重要調控作用［28］。擴張蛋白一般具有兩個保守結構域，即DPBB-1和Pollen-Allerg-1結構域，并且，在N端具有一個信號肽，表明擴張蛋白是分泌型蛋白［29-30］。另外，擴張蛋白在N端區(qū)域具有一系列保守的半胱氨酸（Cys）殘基，在中心區(qū)域具有HFL/HFD基序，并且在C端區(qū)域具有幾個保守的色氨酸（Trp）殘基，這些保守結構對它們行使功能具有重要作用［31］。類似的，地毯草α-擴張蛋白AcEXPA1也具有1個信號肽、8個保守的Cys殘基、1個HFL基序和4個保守的Trp殘基（圖4和5），表明AcEXPA1蛋白具備EXPA蛋白的典型結構特征。進化樹分析表明，地毯草AcEXPA1蛋白被分在第1組中，且與水稻α-擴張蛋白OsEXPA10同源性最高（圖6）。水稻OsEXPA10被報道在整個根細胞中均有表達，并具有調控水稻根系生長的功能［32］。擬南芥α-擴張蛋白AtEXPA4也被報道具有調節(jié)根系生長的功能，而AtEXPA18被報道參與調節(jié)了干旱脅迫下表皮細胞的擴增和提高耐旱能力［33-34］。因此，AcEXPA1可能具有類似生物學功能，參與調節(jié)地毯草根系的生長。

AcEXPA1基因在根中具有較高的表達量，且鋁處理增強了AcEXPA1在地毯草根中的表達，但其表達不受鎘和鑭處理的影響（圖7和8）。在水稻中，鋁處理特異地增強了OsEXPA10在根中的表達，且不同鋁濃度和鋁時間均能增強OsEXPA10的基因表達［19］。類似的，HvEXPA1在大麥根尖中特異受鋁增強表達，但不受鑭和鉻處理的影響，并且，敲除或沉默OsEXPA10和HvEXPA1基因均抑制了轉基因材料根細胞的伸長，進而減少了根長和根干重［20］。另外，超量表達AtEXPA4促進了擬南芥主根的生長，而敲除AtEXPA4基因則抑制了主根生長［33］。因此，鋁處理增強表達的AcEXPA1基因可能通過促進根細胞的伸長，從而調控了鋁脅迫下地毯草根系的生長。

4 結論

本研究克隆了地毯草α-擴張蛋白AcEXPA1基因，發(fā)現AcEXPA1基因在根中具有較高的表達量，且鋁處理增強了AcEXPA1在根中的表達，暗示該基因參與調控了地毯草根系生長響應鋁毒害。本研究為探討地毯草耐鋁機理提供了理論依據。

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（責任編輯" 劉婷婷）