紫花苜蓿開(kāi)花調(diào)控基因MsCIB2的克隆及功能驗(yàn)證

摘要：開(kāi)花是植物生命周期的重要生理過(guò)程，而光周期對(duì)植物開(kāi)花時(shí)間起重要的調(diào)控作用。basic Helix-Loop-Helix（bHLH）基因家族成員在光周期調(diào)控開(kāi)花途徑中發(fā)揮著重要作用。為了探究紫花苜蓿（Medicago sativa L.）bHLH基因家族成員在花期調(diào)控中的功能，克隆了位于第18亞族的MsCIB2基因，該基因全長(zhǎng)1533 bp，編碼511個(gè)氨基酸；組織差異性分析顯示，MsCIB2在植物各組織的表達(dá)量從高到低排序?yàn)椋夯╣t;老莖gt;幼莖gt;老葉gt;幼葉；花不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)分析顯示，MsCIB2在晚花材料中的表達(dá)水平顯著比早花材料高，其中在晚花材料的盛花期表達(dá)量最高；qRT-PCR分析顯示，MsCIB2在LD下被誘導(dǎo)表達(dá)，SD下維持在較低的表達(dá)水平，同時(shí)MsCIB2也受植物激素（IAA，MeJA，SA和ABA）誘導(dǎo)表達(dá)，干旱和高鹽脅迫下則被抑制表達(dá)。過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）在長(zhǎng)日照條件下推遲開(kāi)花2～4 d，而在短日照條件下顯著延遲開(kāi)花12～14 d，同時(shí)一定程度上增加了植物營(yíng)養(yǎng)體的生物量，暗示MsCIB2在植物光周期途徑調(diào)控開(kāi)花的生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；MsCIB2；表達(dá)模式；開(kāi)花時(shí)間

中圖分類(lèi)號(hào)：S541.9" " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " 文章編號(hào)：1007-0435（2025）02-0335-16

Cloning and Functional Verification of Flowering Regulation Gene MsCIB2 in Alfalfa

ZHANG Li-li， JIANG Xu， CUI Jing， LI Ya-jing， KANG Jun-mei*

（Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract：Flowering is a critical physiological process in the plant life cycle， and the photoperiod plays a key regulatory role in determining the timing of flowering. Members of the basic Helix-Loop-Helix （bHLH） gene family are crucial participants in the photoperiodic regulation of flowering pathways. To explore the role of bHLH family members in the regulation of flowering time in alfalfa （Medicago sativa L.）， the gene MsCIB2， located in subfamily 18， was cloned. The full length of MsCIB2 is 1533 bp， encoding 511 amino acids. Tissue-specific expression analysis revealed that the expression levels of MsCIB2 ranked from high to low as follows： flowersgt;mature stemsgt;new stemsgt;mature leavesgt;new leaves. During different flower development stages， MsCIB2 expression was significantly higher in late-flowering plants compared to early-flowering plants， with the highest expression observed at the full-bloom stage in late-flowering plants. Quantitative RT-PCR analysis showed that MsCIB2 was induced under long-day （LD） conditions but maintained low expression levels under short-day （SD） conditions. Additionally， MsCIB2 expression was induced by plant hormones such as IAA， MeJA， SA， and ABA but was suppressed under drought and high-salinity stress. Overexpression of MsCIB2 in Arabidopsis thaliana delayed flowering by 2-4 days under LD conditions and significantly delayed flowering by 12-14 days under SD conditions. Furthermore， the overexpression of MsCIB2 slightly increased vegetative biomass， suggesting that MsCIB2 plays an important role in the physiological regulation of flowering via the photoperiodic pathway.

Key words：Alfalfa；MsCIB2；Expression mode；Flowering time

開(kāi)花是植物生命周期的重要生理過(guò)程，是影響作物生物量和品質(zhì)的重要過(guò)程之一。對(duì)于飼草作物來(lái)說(shuō)，開(kāi)花時(shí)間的早晚對(duì)其產(chǎn)量和品質(zhì)來(lái)說(shuō)十分關(guān)鍵。開(kāi)花的誘導(dǎo)過(guò)程受植物內(nèi)部因素（年齡、激素等）和外部環(huán)境因素（光照、溫度和水分等）的協(xié)同調(diào)控。光周期途徑、自主途徑、年齡途徑、赤霉素途徑、溫度途徑和春化途徑是當(dāng)前在多個(gè)物種中研究最多且已被認(rèn)同的花期調(diào)控分子機(jī)制［1-6］。除了上述途徑，近十年的植物花期調(diào)控研究還發(fā)現(xiàn)了新的機(jī)制，即油菜素甾醇途徑和脫落酸途徑［7-10］。其中，光照的周期性變化是影響植物開(kāi)花的重要因素之一，植物的光受體在感知并接收來(lái)自光周期變化的信號(hào)后，有兩種信號(hào)傳遞方式，一種是直接傳導(dǎo)，將光信號(hào)傳遞給開(kāi)花整合基因，由整合基因傳遞到下游花分生組織基因調(diào)控開(kāi)花；另一種是間接傳導(dǎo)，將光信號(hào)向節(jié)律鐘傳導(dǎo)，調(diào)控植物節(jié)律鐘的基因并出現(xiàn)相應(yīng)的晝夜節(jié)律變化，再通過(guò)輸出信號(hào)來(lái)調(diào)控開(kāi)花［11］。

basic Helix-Loop-Helix（bHLH）是真核生物體內(nèi)數(shù)量較多且功能多樣的轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族以其高度保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域命名，其家族成員在模式植物擬南芥中已經(jīng)取得了一定的研究進(jìn)展，但在紫花苜蓿上卻鮮有報(bào)道。bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有兩個(gè)保守性高且功能各異的結(jié)構(gòu)域，分別是位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域多肽鏈的氨基末端的堿性區(qū)（Basic region）和分布在羧基末端的HLH區(qū)（Helix-Loop-Helix）［12-13］。前人根據(jù)基因表達(dá)模式、二聚化的選擇性和DNA結(jié)合特異性在內(nèi)的特征，對(duì)植物中的bHLH轉(zhuǎn)錄因子成員進(jìn)行分類(lèi)，油菜（Brassica napus L.）和水稻（Oryza sativa L.）中分別鑒定出230和168個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子，各劃分為24和25個(gè)亞族［14-15］，擬南芥中鑒定出162個(gè)，劃分為 21個(gè)亞族。擬南芥 AtCIBs（CRYPTOCHROME-INTERACTING BASIC HELIX-LOOP-HELIX）基因在光周期開(kāi)花途徑中起重要作用，這些基因位于AtbHLH基因家族的第18亞族。AtCIB1是依賴藍(lán)光與CRY2（CRYPTOCHROME 2）特異性相互作用促進(jìn)擬南芥開(kāi)花的蛋白［16］。前人研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)日照下過(guò)表達(dá)AtCIB1，AtCIB2，AtCIB4，AtCIB5和AtCIL1（CIB1 Like）均促進(jìn)擬南芥開(kāi)花［16］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AtCIB3擬南芥出現(xiàn)早花表型，驗(yàn)證了AtCIB3的促花功能［17］。AtCIBs功能冗余，通過(guò)形成異源二聚體提高開(kāi)花整合因子AtFT（FLOWER LOCUS T）的表達(dá)量，從而促進(jìn)植株開(kāi)花［16］。其他物種中也研究了CIBs的開(kāi)花功能，大豆（Glycine max）GmCIL10在花的啟動(dòng)中具有激活作用，異位過(guò)表達(dá)GmCIL10促進(jìn)了擬南芥開(kāi)花［18］。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥atcib2單基因突變體的開(kāi)花時(shí)間顯著早于野生型，而鳳梨（Ananas comosus）AcCIB2基因可以回補(bǔ)atcib2突變體的早花表型，證實(shí)了AcCIB2也參與花期調(diào)控。除了調(diào)節(jié)開(kāi)花外，bHLHs在非生物脅迫中也有重要作用。在鹽脅迫、滲透脅迫和ABA處理下，過(guò)表達(dá)AcCIB2的轉(zhuǎn)基因植株在萌發(fā)和生長(zhǎng)表型方面表現(xiàn)更好［19］。COI1（CORONATINE INSENSITIVE 1）是茉莉酸（JA）響應(yīng)基因，其與JAZ（JASMONATE ZIM-DOMAIN）共同參與調(diào)控?cái)M南芥花期轉(zhuǎn)變［20］。

紫花苜蓿是奶牛等草食動(dòng)物的重要優(yōu)質(zhì)飼草，是我國(guó)奶業(yè)興旺的物質(zhì)基礎(chǔ)，而開(kāi)花時(shí)間的早晚與苜蓿的產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。紫花苜蓿在開(kāi)花前主要進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，開(kāi)花后苜蓿生長(zhǎng)速度逐漸減緩，由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)渡至生殖生長(zhǎng)，且木質(zhì)化程度逐漸增加，導(dǎo)致苜蓿品質(zhì)逐漸降低。因此，開(kāi)展紫花苜蓿開(kāi)花調(diào)控關(guān)鍵基因的研究，不僅為苜蓿開(kāi)花調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，還對(duì)苜?；蚬こ讨挟a(chǎn)量和品質(zhì)性狀的遺傳改良具有重要意義。本研究通過(guò)對(duì)紫花苜蓿bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員MsCIB2基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式的分析，在擬南芥中過(guò)表達(dá)MsCIB2探究其在開(kāi)花調(diào)控途徑中的功能，為進(jìn)一步解析MsCIB2開(kāi)花調(diào)控分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

植物材料為‘中苜4號(hào)’紫花苜蓿（Medicago sativa L.‘Zhongmu No.4’）、‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿（晚花材料）、滄州苜蓿（早花材料）、擬南芥（Col生態(tài)型），由本實(shí)驗(yàn)室提供。將紫花苜蓿種子鋪在裝有濾紙的培養(yǎng)皿上進(jìn)行發(fā)芽，1周后移到1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，在植物培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗，溫度22℃，濕度60%）培養(yǎng)3周，每周按時(shí)更換營(yíng)養(yǎng)液［5-6，21］。

1.2 植物材料的處理

從處于開(kāi)花期的‘中苜4號(hào)’紫花苜蓿中取成熟莖（從上往下數(shù)第7～9個(gè)節(jié)間）、幼莖（從上往下數(shù)第1～2個(gè)節(jié)間）、成熟葉、幼葉、花5個(gè)組織，用于MsCIB2組織差異性分析；分別取早花材料和晚花材料的莖尖、花蕾及完全開(kāi)放的花朵3種不同組織，莖尖代表花芽分化期，花蕾代表初花期，完全開(kāi)放的花朵代表盛花期，每個(gè)組織取10個(gè)混樣，每份材料取3次生物學(xué)重復(fù)，用于花不同發(fā)育時(shí)期MsCIB2的表達(dá)模式分析；選取2月齡紫花苜蓿進(jìn)行光照處理，設(shè)置長(zhǎng)日照為16 h光照/8 h黑暗，短日照為8 h光照/16 h黑暗，分別在0，4，8，12，16，20和24 h共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)取植株的葉片，用于不同光照處理MsCIB2的表達(dá)模式分析；激素脅迫實(shí)驗(yàn)組分別以200 μmol·L-1的SA（水楊酸）、IAA（生長(zhǎng)素）、MeJA（茉莉酸甲酯）和100 μmol·L-1 ABA（脫落酸）處理72 h，干旱和高鹽脅迫實(shí)驗(yàn)組則分別以15% PEG和200 mmol·L-1 NaCl處理72 h，對(duì)照組不作任何處理，在0，3，5，8，12，24，48和72 h共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)取幼苗的葉組織，用于非生物脅迫下MsCIB2表達(dá)模式分析。以上試驗(yàn)樣品置于液氮凍存，-80℃保存。

1.3 MsCIB2的克隆

以‘中苜4號(hào)’紫花苜蓿為植物材料，總RNA提取參考植物總RNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作（Promega生物技術(shù)有限公司）。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，用紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）檢測(cè)RNA純度。提取1 μg總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme生物技術(shù)有限公司）合成第一鏈cDNA。使用Tbtools從‘中苜4號(hào)’紫花苜蓿基因組文件中獲取MsCIB2的CDS序列，選取最長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本（Msa.H.0438910）在Primer 5.0設(shè)計(jì)PCR克隆引物MsCIB2-F/R（表1）。使用ExTagDNA聚合酶克隆MsCIB2，經(jīng)過(guò)測(cè)序獲取正確的全長(zhǎng)CDS序列（北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司）。

1.4 紫花苜蓿bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

從紫花苜?；蚪M網(wǎng)站（Figshare）中獲取‘中苜4號(hào)’基因組文件，從TAIR（擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)）中下載擬南芥的bHLH蛋白序列。以擬南芥bHLH蛋白序列為參考序列，利用TBtools軟件中Blast工具比對(duì)紫花苜蓿蛋白質(zhì)序列，獲取MsbHLHs候選蛋白序列。利用Pfam的PF00010隱馬爾可夫模型查找紫花苜蓿蛋白質(zhì)序列，獲取MsbHLHs候選蛋白序列［22］。將以上兩種方法獲取的序列取并集。利用PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI的Batch CD-Search工具和SMART在線進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，并去除不含bHLH結(jié)構(gòu)域及重復(fù)的序列，最終確定符合以上要求的蛋白序列。所用應(yīng)用名稱和網(wǎng)址如表2所示。通過(guò)ClustalW v2.1比對(duì)CDS序列，利用IQ-Treev2.2.2.7軟件進(jìn)行分區(qū)和比對(duì)，以最大似然法（ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

使用MEGA 11.0軟件（Neighbor-Joining Method）對(duì)不同物種CIB2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 MsCIB2蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)NCBI的ORF finder預(yù)測(cè)最大開(kāi)放閱讀框；通過(guò)ExASy進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析；通過(guò)Protscale預(yù)測(cè)蛋白親/疏水性；通過(guò)TMHMM預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；通過(guò)SOPMA和Swiss-Model分別預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列多重比對(duì)；使用Plantcare分析目的基因啟動(dòng)子（ATG上游2800 bp）的順式作用元件；使用Plant-mPLoc進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。以上軟件使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析，所用應(yīng)用名稱和網(wǎng)址如表2所示。

1.6 MsCIB2表達(dá)模式分析

通過(guò)NCBI網(wǎng)址的Primer-Blast設(shè)計(jì)引物qMsCIB2-F/R（表1），以AtActin為內(nèi)參基因，將1.2所取樣品提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA稀釋10倍，每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MsCIB2的表達(dá)水平。反應(yīng)總體系為20μL，RNase-free ddH2O 6 μL、qMsCIB2-F/R各1 μL、2×SYBR premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、cDNA 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 31 s，95℃ 15 s，40 cycles，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用2-△△Ct方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量，采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行單因素方差分析多重比較（Plt;0.05）［23］。

1.7 載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

使用上下游引物W-MsCIB2-F/R擴(kuò)增帶有特殊同源臂的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物與pCmbia3301過(guò)表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，以獲得測(cè)序正確的pCmbia3301-MsCIB2質(zhì)粒。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)花序侵染法在擬南芥中遺傳轉(zhuǎn)化，獲得T0代擬南芥種子［24］。

將經(jīng)過(guò)消毒、清洗和春化的T0代擬南芥種子種在含草銨膦（4 mg·mL-1）的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，經(jīng)萌發(fā)長(zhǎng)至幼苗時(shí)移至土壤中，使用35S-F和GUS-R進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)陽(yáng)性苗，篩選出T0代陽(yáng)性植株，經(jīng)T1，T2代純化獲得T3代過(guò)表達(dá)MsCIB2純合株系，挑選出2個(gè)表達(dá)量高的轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥的表型分析

該試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以野生型擬南芥為對(duì)照組，將WT和2個(gè)T3代過(guò)表達(dá)MsCIB2轉(zhuǎn)基因擬南芥種子種于1/2MS培養(yǎng)基（不含4 mg·mL-1草銨膦）上，于4℃冰箱春化3 d，春化結(jié)束后在長(zhǎng)日照人工氣候培養(yǎng)箱放置7～10 d后移至盆栽中，以春化結(jié)束第2天開(kāi)始計(jì)為種子萌發(fā)時(shí)間，每個(gè)株系移栽12株擬南芥，6株做長(zhǎng)日照處理為實(shí)驗(yàn)組一，剩下6株做短日照處理為實(shí)驗(yàn)組二。當(dāng)擬南芥植株抽薹且花莖高度達(dá)1 cm時(shí)，定為開(kāi)花標(biāo)準(zhǔn)。擬南芥抽薹時(shí)蓮座葉葉片長(zhǎng)度達(dá)1 cm作為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)擬南芥從種子播種到開(kāi)花的天數(shù)、抽薹時(shí)蓮座葉數(shù)目和葉片大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsCIB2的克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1 MsCIB2的克隆及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析 利用同源克隆技術(shù)從紫花苜蓿中獲得目的基因完整的開(kāi)放閱讀框（圖1A），該序列CDS長(zhǎng)度為1533 bp，編碼511個(gè)氨基酸（圖1B）。Blast結(jié)果表明，該基因與擬南芥的CIB2同源，故將該基因命名為MsCIB2。通過(guò)NCBI對(duì)MsCIB2基因編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)以及蛋白質(zhì)家族分類(lèi)，發(fā)現(xiàn)該蛋白在第300～385個(gè)氨基酸之間含有一個(gè)bHLH保守結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH基因家族（圖1C）。

ExASy在線分析MsCIB2蛋白理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)分子量約為56.78 kD，理論等電點(diǎn)為5.95； Protscale分析該蛋白的親疏水性，發(fā)現(xiàn)該蛋白為親水性蛋白，全部氨基酸的平均親水系數(shù)為-0.797（圖2A）；利用THMM預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2B）； SOPMA分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲為主，占72.02%，α螺旋、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角占比分別為22.11%，3.52%和2.35%（圖2C）。通過(guò)Swiss-Model，以大豆蛋白100812081為模板模擬并建立MsCIB2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明MsCIB2和模型蛋白覆蓋率為72.34%，皆由2個(gè)α螺旋（Helix）和中間的環(huán)（Loop）連接組成HLH結(jié)構(gòu)域（圖2D）；Cell-Ploc在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)MsCIB2定位在細(xì)胞核上（圖2E）。

對(duì)MsCIB2基因的啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果顯示其含有8個(gè)光響應(yīng)順式作用元件，為ACE、GT1-box、Box4、AE-box、I-box、MRE、GA-motif、TCT-motif，此外，還含有參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)MBS、與分生組織表達(dá)相關(guān)的CAT-box、參與厭氧誘導(dǎo)的ARE以及TGA-element、TGACG-motif、TCA-element、ABRE四個(gè)參與不同激素反應(yīng)的順式作用元件（表3）。

2.1.2 紫花苜蓿bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族分析 為了明確紫花苜?；蚪M中bHLH基因家族成員，本研究通過(guò)Tbtools-Blast和Pfam從紫花苜?；蚪M中鑒定出170個(gè)bHLH蛋白，將MsbHLHs重命名為MsbHLH1～MsbHLH170（表4）。利用ClustalWv2.1和IQ-Treev2.2.2.7軟件對(duì)MsbHLHs和AtbHLHs所有的氨基酸序列進(jìn)行分區(qū)比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，參考擬南芥和蒺藜苜蓿bHLH基因家族聚類(lèi)方式進(jìn)行分類(lèi)。結(jié)果顯示，紫花苜蓿中170個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子被分為20個(gè)亞族，第5亞族的成員最多，占18%（30/170），第13亞族成員最少，僅有1個(gè)成員（圖3）。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果可知，同一分支的亞族成員具有氨基酸基序結(jié)構(gòu)相同、氨基酸數(shù)量相似、蛋白功能相似的特點(diǎn)。MsbHLH063（MsCIB2）屬于第18亞族，與擬南芥CIB1（At4g34530）、CIB2（At5g48560）、CIB3（At3g07340）、CIB4（At1g10120）、CIB5（At1g26260）、CIL1（At1g68920）和CIL2（At3g23690）同屬一個(gè)亞族。前人研究表明，擬南芥CIBs和CILs在光周期調(diào)控開(kāi)花途徑中起重要作用［16， 23-26］。綜上所述，初步推測(cè)MsCIB2可能與AtCIBs一樣具有調(diào)控植物開(kāi)花時(shí)間的功能。

2.1.3 MsCIB2蛋白序列同源性分析 MsCIB2與擬南芥5個(gè)CIBs蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明MsCIB3與AtCIB2的相似性最高，為38%（圖4）。 MsCIB2和擬南芥CIBs具有相同的保守結(jié)構(gòu)域-bHLH，該結(jié)構(gòu)域包含57個(gè)氨基酸，分為堿性區(qū)（Basic region）和HLH區(qū)（Helix-Loop-Helix），暗示MsCIB2可能與擬南芥CIBs的功能相似。將MsCIB2與其他植物CIB2蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示24種植物的CIB2被劃分為兩類(lèi)，MsCIB2和蒺藜苜蓿、紅車(chē)軸草、豌豆和大豆等豆科植物親緣關(guān)系較近，這些植物屬于雙子葉植物分支，表明在單子葉和雙子葉植物的物種進(jìn)化過(guò)程中，CIB2存在明顯的進(jìn)化差異；其中，MsCIB2與蒺藜苜蓿MtCIB2蛋白相似性最高，為76.48%，與大豆GmCIB2的相似性次之，為57.57%（圖5）。

2.2 MsCIB2表達(dá)模式分析

2.2.1 MsCIB2組織差異性及花不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析 利用qRT-PCR分析了MsCIB2在不同組織的表達(dá)差異。研究結(jié)果表明，MsCIB2在莖、葉、花中均有表達(dá)，其中在花中表達(dá)量最高，是幼葉的5.1倍，其表達(dá)水平從高到低排序?yàn)榛╣t;成熟莖gt;幼莖gt;成熟葉gt;幼葉（圖6A）。MsCIB2在紫花苜?；ú煌l(fā)育時(shí)期表達(dá)水平分析顯示，MsCIB2在晚花材料中的表達(dá)水平顯著高于早花材料，在早花材料中，MsCIB2在花芽分化期表達(dá)量最高，分別是初花期和盛花期的3.06和2.97倍；而在晚花材料中，MsCIB2在盛花期表達(dá)量最高，分別為花芽分化期和初花期的2.06和1.63倍，表明MsCIB2的表達(dá)可能與植物開(kāi)花有關(guān)（圖6B）。

2.2.2 不同光周期下MsCIB2的表達(dá)分析 晝夜的相對(duì)長(zhǎng)度是影響植物開(kāi)花的關(guān)鍵因子之一。啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MsCIB2基因啟動(dòng)子含有8個(gè)光響應(yīng)元件，推測(cè)MsCIB2可能在植物光周期途徑中發(fā)揮一定作用。為探究光照對(duì)MsCIB2的影響，分別檢測(cè)了LD和SD條件下MsCIB2的表達(dá)水平。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LD條件下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，MsCIB2表達(dá)量逐漸增加，在12～20 h快速增加，20 h達(dá)到峰值，20～24 h又快速下降；SD條件下，MsCIB2的表達(dá)水平呈現(xiàn)不規(guī)律性變化，且維持在較低水平，表明不同光周期條件，MsCIB2表達(dá)水平顯著不同（圖7）。

2.2.3 外源激素和非生物脅迫下MsCIB2的表達(dá)分析 植物激素對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)節(jié)作用。MsCIB2啟動(dòng)子序列中含有4個(gè)參與不同激素反應(yīng)的順式作用元件。因此，本研究對(duì)3周齡紫花苜蓿施加4種外源激素，分析MsCIB2表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示，MsCIB2表達(dá)量在IAA、SA處理下均呈現(xiàn)先升高，后降低，再升高，再降低的趨勢(shì)；IAA誘導(dǎo)下，MsCIB2在3 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值，是CK的2.09倍，至12 h時(shí)又顯著被抑制表達(dá)，至48 h再次被激活表達(dá)；SA誘導(dǎo)下，MsCIB2的表達(dá)在3～12 h內(nèi)被顯著激活，在3 h，5 h，12 h時(shí)分別是CK的2.16，3.50，2.00倍；MsCIB2表達(dá)量在MeJA誘導(dǎo)下顯示為先升高，再降低，再升高的趨勢(shì)，處理5 h時(shí)MsCIB2的表達(dá)量達(dá)到峰值，是CK的2.38倍，在12 h時(shí)又顯著被抑制表達(dá)；ABA誘導(dǎo)下，MsCIB2的表達(dá)呈現(xiàn)先升高，再降低的趨勢(shì)，其表達(dá)量在0～12 h逐步升高，12 h達(dá)到峰值，是CK的3.4倍（圖8）。綜上結(jié)果表明，4種激素脅迫對(duì)MsCIB2的表達(dá)水平均具有顯著影響。

由于MsCIB2的啟動(dòng)子具有非生物脅迫順式作用元件，因此，本研究用15% PEG和200 mmol·L-1 NaCl模擬干旱和高鹽環(huán)境，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了MsCIB2的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種逆境脅迫下，MsCIB2的表達(dá)量都一直維持在較低的水平，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)越來(lái)越低，表明干旱和高鹽脅迫影響MsCIB2基因的表達(dá)。

2.3 過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥的鑒定及表型分析

2.3.1 過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥陽(yáng)性株系鑒定 以pCmbia3301為表達(dá)載體，通過(guò)無(wú)縫克隆構(gòu)建了pCmbia3301-MsCIB2載體，將pCmbia3301-MsCIB2載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中并進(jìn)行單菌落PCR陽(yáng)性鑒定，經(jīng)公司測(cè)序，確定MsCIB2成功連接到表達(dá)載體且序列正確（圖9A）。通過(guò)花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了抗性株系，利用PCR鑒定和草銨膦抗生素篩選，本實(shí)驗(yàn)獲得2個(gè)T3代純合過(guò)表達(dá)MsCIB2轉(zhuǎn)基因擬南芥株系#L2和#L8（圖9B）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系#L2和#L8中MsCIB2的表達(dá)量分別是WT的28.73倍和98.57倍，選擇上述兩個(gè)株系開(kāi)展后續(xù)的表型分析（圖9C）。

2.3.2 過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥的表型分析 為了研究紫花苜蓿MsCIB2基因調(diào)控開(kāi)花的功能，將MsCIB2在擬南芥中過(guò)表達(dá)，觀察并統(tǒng)計(jì)開(kāi)花時(shí)間天數(shù)和蓮座葉數(shù)等表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在LD條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥#L8、#L2的開(kāi)花時(shí)間比WT延遲開(kāi)花大約2～4 d（圖10A），且兩個(gè)株系的蓮座葉數(shù)目、葉片大小與WT并沒(méi)有顯著差異（圖10C）。SD條件下，過(guò)表達(dá)MsCIB2顯著推遲擬南芥開(kāi)花時(shí)間，#L8、#L2分別比WT的開(kāi)花時(shí)間晚14 d和12 d（圖10B）；植株生長(zhǎng)34 d時(shí)，WT已抽薹，而轉(zhuǎn)基因植株未抽薹，此時(shí)WT植株整體大小和葉片大小明顯比同時(shí)期的轉(zhuǎn)基因株系大（圖10Eamp;F）；植株生長(zhǎng)45 d時(shí)，WT的花莖高度明顯轉(zhuǎn)基因株系高（圖10D）；#L8、#L2抽薹時(shí)的蓮座葉數(shù)目分別比WT多9片和7片（圖10C）。上述結(jié)果表明，MsCIB2響應(yīng)光周期變化，在短日照條件下顯著延遲開(kāi)花時(shí)間和延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，從而提高植株的地上生物量。

3 討論

3.1 光周期影響MsCIB2的表達(dá)

GT1-box和I-box是光控基因PHYA（PHYTOCHROME A）中保守的光響應(yīng)元件，GT1-box是水稻（Oryza sativa L.）OsPHYA基因啟動(dòng)子中的光抑制元件［25］。I-box元件使AtADH（ALCOHOL DEHYDROGENASE）響應(yīng)光誘導(dǎo)且增加表達(dá)活性，該元件的突變則會(huì)降低AtADH的表達(dá)［26］。MsCIB2啟動(dòng)子序列中也含有GT1-box和I-box順式作用元件，說(shuō)明該基因可能與光周期有關(guān)。擬南芥CIB2和CIB3是MsCIB2的同源蛋白。前人研究中發(fā)現(xiàn)AtCIBs通過(guò)光周期途徑調(diào)控?cái)M南芥開(kāi)花時(shí)間［17，27-30］。本研究MsCIB2在LD和SD處理下表現(xiàn)出不同的表達(dá)趨勢(shì)，說(shuō)明其響應(yīng)紫花苜蓿光照的周期性變化，暗示著MsCIB2可能在光周期途徑誘導(dǎo)苜蓿開(kāi)花過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3.2 外源激素和非生物脅迫影響MsCIB2的表達(dá)

植物激素是開(kāi)花過(guò)程中重要的內(nèi)源信號(hào)參與者。IAA可以上調(diào)ARFs（AUXIN RESPONSE FACTOR）的表達(dá)水平，在草莓（Fragaria sp.）中發(fā)現(xiàn)FveARF4可以直接激活A(yù)P1（APETALA1）和FUL（FRUITFULL）的表達(dá)，促進(jìn)草莓開(kāi)花［31］。MYCs（MYELOCYTOMATOSIS）是茉莉酸（JA）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)因子，其中AtMYC2/3/4介導(dǎo)的JA通路通過(guò)抑制FT轉(zhuǎn)錄調(diào)控開(kāi)花時(shí)間［32］。AtABI2（ABA INSENSITIVE 2）是來(lái)自ABA通路信號(hào)核心的唯一磷酸酶，通過(guò)抑制ABI5介導(dǎo)的FLC（FLOWERING LOCUS C）激活來(lái)促進(jìn)開(kāi)花［33］。SA通過(guò)參與光周期和春化途徑，影響CO（CONSTANS）、FLC、FT、FLD（FLOWERING LOCUS D）等基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控植物開(kāi)花［4］。本研究中，MsCIB2的啟動(dòng)子序列中含有4個(gè)與植物激素相關(guān)的順式作用元件，因此對(duì)紫花苜蓿分別進(jìn)行IAA，MeJA，SA和ABA外源激素處理，發(fā)現(xiàn)這些激素對(duì)MsCIB2基因的表達(dá)量及表達(dá)趨勢(shì)都有明顯且不同的影響，說(shuō)明MsCIB2能夠感知包括IAA，MeJA，SA，ABA在內(nèi)的激素脅迫信號(hào)，但是這些激素是否通過(guò)MsCIB2影響紫花苜蓿的開(kāi)花還有待進(jìn)一步研究。

植物不斷受到外界不良環(huán)境脅迫，為了應(yīng)對(duì)這些不同的壓力，植物進(jìn)化出復(fù)雜的適應(yīng)機(jī)制。前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥NF-YC2（NUCLEAR FACTOR Y）轉(zhuǎn)錄因子響應(yīng)干旱脅迫調(diào)控開(kāi)花時(shí)間，經(jīng)干旱處理的過(guò)表達(dá)NF-YC2擬南芥，AtFT表達(dá)水平顯著提高，從而促進(jìn)了擬南芥開(kāi)花［34］。LI研究發(fā)現(xiàn)FT、CO、SOC1和LFY這些開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)水平在高鹽處理下都受到抑制［35］。本研究中，MsCIB2的啟動(dòng)子序列中含有參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)——MBS順式作用元件，因此對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行干旱和高鹽處理，發(fā)現(xiàn)MsCIB2在兩種處理下的表達(dá)均維持在較低水平，說(shuō)明干旱和高鹽2種非生物脅迫影響MsCIB2基因的表達(dá)。

3.3 過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥延遲開(kāi)花

研究AtCIB3和AtCIB2發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)AtCIB3轉(zhuǎn)基因擬南芥在LD誘導(dǎo)下沒(méi)有明顯的開(kāi)花表型，而過(guò)表達(dá)AtCIB2轉(zhuǎn)基因擬南芥表現(xiàn)出明顯的早花表型；LIU還發(fā)現(xiàn)atcib2和atcib3單基因突變體均沒(méi)有明顯的開(kāi)花表型，說(shuō)明存在多個(gè)CIBs相關(guān)蛋白冗余作用調(diào)節(jié)擬南芥開(kāi)花起始［27］。Zhou等［17］研究發(fā)現(xiàn)，LD條件下過(guò)表達(dá)AtCIB3轉(zhuǎn)基因擬南芥的開(kāi)花時(shí)間明顯早于對(duì)照；但與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥開(kāi)花時(shí)的蓮座葉數(shù)目沒(méi)有顯著差異。本研究中設(shè)置了長(zhǎng)日照和短日照2種不同的光處理方式，不同的光照條件產(chǎn)生不同的開(kāi)花表型，其中過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥在SD條件下表現(xiàn)出顯著的晚花表型，與前人研究結(jié)果相反。這種相反的結(jié)果，一方面可能是由于MsCIB2對(duì)光周期的變化十分敏感，一方面可能與物種不同有關(guān)。大豆GmCIL10也是MsCIB2的同源蛋白之一，不論在LD或SD條件下，過(guò)表達(dá)GmCIL10均能使擬南芥提早開(kāi)花，與本研究結(jié)果相反，兩者結(jié)果相反的原因可能由于物種不同引起，大豆是典型的短日照作物，而擬南芥屬于長(zhǎng)日照植物［18］。FT已經(jīng)被大量實(shí)驗(yàn)證明為促花基因，但在煙草（Nicotiana tabacum L.）、甜菜（Beta vulgaris L.）、甘蔗（Saccharum L.）等物種中被發(fā)現(xiàn)其同源基因推遲了植物的開(kāi)花時(shí)間［36-38］。同理，不同物種的CIB2可能會(huì)發(fā)生功能的轉(zhuǎn)變，而MsCIB2功能的轉(zhuǎn)變可能使紫花苜蓿具有更好的環(huán)境適應(yīng)性。

4 結(jié)論

MsCIB2響應(yīng)光周期變化，LD下被誘導(dǎo)表達(dá)，SD下則維持在較低的表達(dá)水平；MsCIB2受外源激素（IAA，MeJA ，SA和 ABA）的誘導(dǎo)表達(dá)，而干旱和高鹽脅迫則抑制其表達(dá)。表型觀察顯示，過(guò)表達(dá)MsCIB2擬南芥的開(kāi)花表型受光周期影響，MsCIB2在短日照條件下顯著推遲開(kāi)花12～14 d，且一定程度上增加了植株?duì)I養(yǎng)體生物量，而長(zhǎng)日照條件下則輕微延遲開(kāi)花2～4 d，表明MsCIB2可能在光周期途徑推遲植物開(kāi)花的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)

［1］ KAZAN K，LYONS R. The link between flowering time and stress tolerance［J］. Journal of Experimental Botany，2016，67（1）：47-60

［2］ ZOU L，PAN C，WANG M X，et al. Progress on the mechanism of hormones regulating plant flower formation［J］. Hereditas（Beijing），2020，42（8）：739-751

［3］ LIN X Y，LIU B H，WELLER J L，et al. Molecular mechanisms for the photoperiodic regulation of flowering in soybean［J］. Journal of Integrative Plant Biology，2021，63（6）：981-994

［4］ LUO Y，LIU M-L，CAO J，et al. The role of salicylic acid in plant flower development［J］. Forestry Research，2022，2（14）：2-6

［5］ 張?jiān)菩?，蔣旭，尉春雪，等. 紫花苜蓿高遷移率族蛋白基因MsHMG-Y調(diào)控花期的功能分析［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2022，55（16）：3082-3092

［6］ 盧棟宇，王雪，蔣旭，等. 紫花苜?；ㄆ谡{(diào)控基因MsCOL2的克隆及功能研究［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（10）：2905-2915

［7］ SHU K，CHEN Q，WU Y R，et al. ABSCISIC ACID-INSENSITIVE 4 negatively regulates flowering through directly promoting Arabidopsis FLOWERING LOCUS C transcription［J］. Journal of Experimental Botany，2016，67（1）：195-205

［8］ LI Z C，OU Y，ZHANG Z C，et al. Brassinosteroid signaling recruits histone 3 lysine-27 demethylation activity to FLOWERING LOCUS C chromatin to inhibit the floral transition in Arabidopsis［J］. Molecular Plant，2018，11（9）：1135-1146

［9］ BULGAKOV V P，AVRAMENKO T V. Linking brassinosteroid and ABA signaling in the context of stress acclimation［J］. International Journal of Molecular Sciences，2020，21（14）：5108

［10］ TANG L，LI G，WANG H，et al. Exogenous abscisic acid represses rice flowering via SAPK8-ABF1-Ehd1/Ehd2 pathway［J］. Journal of Advanced Research，2024，59：35-47

［11］ KOBAYASHI Y，WEIGEL D. Move on up， it's time for change-mobile signals controlling photoperiod-dependent flowering［J］. Genes amp; Development，2007，21（19）：2371-2384

［12］ LEDENT V，VERVOORT M. The basic helix-loop-helix protein family： comparative genomics and phylogenetic analysis［J］. Genome Research，2001，11（5）：754-770

［13］ 朱璐璐，周波. bHLH蛋白在植物發(fā)育及非生物脅迫中的調(diào)控［J］. 分子植物育種，2022，20（20）：6750-6760

［14］ CARRETERO-PAULET L，GALSTYAN A，ROIG-VILLANOVA I，et al. Genome-wide classification and evolutionary analysis of the bHLH family of transcription factors in Arabidopsis， poplar， rice， moss， and algae［J］. Plant Physiology，2010，153（3）：1398-1412

［15］ ZUO Z F，LEE H Y，KANG H G. Basic Helix-Loop-Helix transcription factors： regulators for plant growth development and abiotic stress responses［J］. International Journal of Molecular Sciences，2023，24（2）：1419

［16］ LIU H，YU X，LI K，et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis［J］. Science，2008，322（5907）：1535-1539

［17］ ZHOU L，LU Y，HUANG J，et al. Arabidopsis CIB3 regulates photoperiodic flowering in an FKF1-dependent way［J］. Bioscience Biotechnology Biochemistry，2021，85（4）：765-774

［18］ YANG D，ZHAO W，MENG Y，et al. A CIB1-LIKE transcription factor GmCIL10 from soybean positively regulates plant flowering［J］. Science China-Life Sciences，2015，58（3）：261-269

［19］ ASLAM M，JAKADA B H，F(xiàn)AKHER B，et al. Genome-wide study of pineapple （Ananas comosus L.） bHLH transcription factors indicates that cryptochrome-interacting bHLH2 （AcCIB2） participates in flowering time regulation and abiotic stress response［J］. BMC Genomics，2020，21（1）：735

［20］ ZHAI Q Z，ZHANG X，WU F M，et al. Transcriptional mechanism of jasmonate receptor COI1-Mediated delay of flowering time in Arabidopsis［J］. The Plant Cell，2015，27（10）2814-2828

［21］ 蔣旭，崔會(huì)婷，王珍，等. 紫花苜蓿MsNST的克隆及對(duì)木質(zhì)素與纖維素合成的功能分析［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，53（18）：3818-3832

［22］ 唐芳，梅亭，高佳荷，等. 紫花苜蓿GPAT基因家族鑒定及在鹽堿脅迫下的表達(dá)模式分析［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（9）：2608-2620

［23］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CT Method［J］. Nature Methods，2001，25（4）：402-408

［24］ ANDREW B. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method［J］. Methods in Molecular Biology，2006，34（3）：87-103

［25］ DEHESH K，BRUCE W B. QUAIL P H. A trans-acting factor that binds to a GT-motif in a phytochrome gene promoter［J］. Science，1990，250（4986）：1397-1399

［26］ DONALD R G，CASHMORE A R. Mutation of either G box or I box sequences profoundly affects expression from the Arabidopsis rbcS-1A promoter［J］. EMBO Journal，1990，9（6）：1717-1726

［27］ LIU Y，LI X，LI K，et al. Multiple bHLH proteins form heterodimers to mediate CRY2-dependent regulation of flowering-time in Arabidopsis［J］. Plos Genetics，2013，9（10）：e1003861

［28］ LIU Y，LI X，MA D，et al. CIB1 and CO interact to mediate CRY2-dependent regulation of flowering［J］. EMBO Reports，2018，19（10）：e45762

［29］ LIU L J，ZHANG Y C，LI Q H，et al. COP1-mediated ubiquitination of CONSTANS is implicated in cryptochrome regulation of flowering in Arabidopsis［J］. Plant Cell，2008，20（2）：292-306

［30］ MENG Y，LI H，WANG Q，et al. Blue light-dependent interaction between cryptochrome2 and CIB1 regulates transcription and leaf senescence in soybean［J］. Plant Cell，2013，25（11）：4405-4420

［31］ DONG X，LI Y，GUAN Y，et al. Auxin-induced AUXIN RESPONSE FACTOR 4 activates APETALA1 and FRUITFULL to promote flowering in woodland strawberry［J］. Horticulture Research，2021，8（1）：115

［32］ WANG H，LI Y，PAN J，et al. The bHLH transcription factors MYC2， MYC3， and MYC4 are required for jasmonate-mediated inhibition of flowering in Arabidopsis［J］. Molecular Plant，2017，10（11）：1461-1464

［33］ AKHTAR A，SHAH Z，JUNGHOON P，et al. ABA INSENSITIVE 2 promotes flowering by inhibiting OST1/ABI5-dependent FLOWERING LOCUS C transcription in Arabidopsis［J］. Journal of Experimental Botany，2024，75（8）：2481-2493

［34］ HACKENBERG D，KEETMAN U，GRIMM B. Homologous NF-YC2 subunit from Arabidopsis and tobacco is activated by photooxidative stress and induces flowering［J］. International Journal of Molecular Sciences，2012，13（3）：3458-3477

［35］ LI K，WANG Y，HAN C，et al. GA signaling and CO/FT regulatory module mediate salt-induced late flowering in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Grouth Regulation，2007，53（3）：195-206

［36］ HARIG L，BEINECKE F A，QLTMANNS J，et al. Proteins from the FLOWERING LOCUS T-like subclade of the PEBP family act antagonistically to regulate floral initiation in tobacco［J］. The Plant Journal，2012，72（6）：908-921

［37］ WINTERHAGEN P，TIYAYON P，SAMACH A，et al. Isolation and characterization of FLOWERING LOCUS T subforms and APETALA1 of the subtropical fruit tree Dimocarpus longan［J］. Plant Physiology and Biochemistry，2013，71：184-190

［38］ COELHO C P，MINOW M A，CHALFUN-JúNIOR A，et al. Putative sugarcane FT/TFL1 genes delay flowering time and alter reproductive architecture in Arabidopsis［J］. Frontiers in Plant Science，2014，5：221

（責(zé)任編輯" 劉婷婷）