內(nèi)毒素致多臟器功能障礙綜合征綿羊模型的建立

王春雨，凡春玲，羅曉紅，萬(wàn)東君，李 晶，陸 璐，王紅義，牛廷獻(xiàn)

（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科，2.干部病房，3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)科，蘭州 730050）

多臟器功能障礙綜合征（MODS）多繼發(fā)于嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、內(nèi)毒素血癥等，治療難度大，死亡率高，國(guó)內(nèi)外迄今沒有突破性進(jìn)展。由于其原發(fā)病因各異、發(fā)病過程不同，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，加之治療因素的干擾，使得難以全面細(xì)致觀察MODS患者病情變化的全過程。MODS動(dòng)物模型是研究其發(fā)病機(jī)制和臨床防治的基礎(chǔ)，因此，建立簡(jiǎn)單有效且符合臨床實(shí)際的MODS動(dòng)物模型一直是是國(guó)內(nèi)外研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。本研究利用LPS誘發(fā)綿羊膿毒血癥，進(jìn)而介導(dǎo)MODS，以探討建立一種簡(jiǎn)單有效且能模擬MODS病理和臨床特征變化的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組

12只1年期健康杜泊綿羊，雌雄各半，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)I組和II組，每組各6只，平均體重（18.4±3.5）kg。全價(jià)飼料飼養(yǎng)。

1.2 模型建立

實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均用速眠新Ⅱ號(hào)（1.5mL/kg）（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉獸藥試字（2004）005013）肌內(nèi)注射麻醉。之后，實(shí)驗(yàn)I組和II組分別以3μg/kg和6μg/kg LPS［1］（血清型為：O127：B8，批號(hào)為64H4010，美國(guó)Sigma公司）于30min和60min內(nèi)均勻持續(xù)經(jīng)前肢橈靜脈泵入。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

血?dú)狻⒀Ｒ?guī)和血清生化等指標(biāo)的檢測(cè)均由本院檢驗(yàn)科測(cè)定。

1.3.1 血?dú)夥治觯篖PS靜注前后，分別于0、1、2、3和6h經(jīng)股動(dòng)脈采血，立即測(cè)定氧分壓（PaO2）。

1.3.2 血常規(guī)和血清生化指標(biāo)的測(cè)定：LPS靜注前后，分別于0、3、6、12、24、48和72h經(jīng)頸靜脈采血，分別測(cè)定血常規(guī)、生化指標(biāo)（天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）和肌酐（CRE））。

1.4 MODS的診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照胡森等［2］提出的動(dòng)物發(fā)生MODS時(shí)各個(gè)器官功能障礙分期診斷標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。在注射LPS后出現(xiàn)2個(gè)或2個(gè)以上器官或系統(tǒng)功能障礙判定為MODS。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體征表現(xiàn)及死亡率

兩實(shí)驗(yàn)組綿羊靜脈泵入LPS 2h后，呼吸加快且困難，心率快而不齊。7h后腹脹，尿頻，不能站立，運(yùn)動(dòng)障礙。24h后實(shí)驗(yàn)Ⅰ組2只和Ⅱ組3只綿羊因呼吸窘迫、心律失常、血壓下降，繼而心衰而死亡，死亡率分別為33.3％和50％。

2.2 氣血分析

靜注LPS后，1～6h實(shí)驗(yàn)Ⅰ組和Ⅱ組綿羊股動(dòng)脈氧分壓（PaO2）（mmHg）與0h相比均明顯下降（P＜0.01），氧合指數(shù)［PaO2/FiO2（吸入氧濃度）］均≤26.70kPa（1kPa=7.5mmHg）（表1）。結(jié)果表明，氧合指數(shù)已達(dá)到急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。

2.3 血清生化指標(biāo)的變化

表1 兩實(shí)驗(yàn)組氣血分析Tab.1 Blood gas analysis in the two groups

靜注LPS前后結(jié)果表明（表2）：①AST：兩實(shí)驗(yàn)組均在6h時(shí)開始上升，12h～72h的水平明顯或顯著高于0h（P＜0.05或P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)I組在24h時(shí)達(dá)到峰值，而實(shí)驗(yàn)II組從6h開始以極高的水平不斷上升，直至72h。②ALT：兩實(shí)驗(yàn)組均在24h的水平達(dá)到峰值，之后逐漸下降，但明顯高于0h的水平（P＜0.05或P＜0.01）。③TBIL：實(shí)驗(yàn)I組的水平在12h和24h時(shí)明顯高于0h（P＜0.05），在24h時(shí)達(dá)到峰值，之后不斷下降。而實(shí)驗(yàn)II組12h～72h的水平明顯或顯著高于0h（P＜0.05或P＜0.01），且保持不斷上升。④CRE：兩實(shí)驗(yàn)組均在24h的水平達(dá)到峰值。但實(shí)驗(yàn)I組只在24h時(shí)的水平明顯高于0h（P＜0.05），而實(shí)驗(yàn)II組12h、24h和48h的水平均明顯或顯著高于0h（P＜0.05或P＜0.01）。以上結(jié)果表明，靜注LPS 24h后成功建立了MODS模型。

表2 兩實(shí)驗(yàn)組血清生化指標(biāo)的變化Tab.2 The changes of serum biochemical indexes in sheep of the two groups

2.4 血常規(guī)的變化

血常規(guī)結(jié)果表明（圖1），靜注LPS后，實(shí)驗(yàn)Ⅰ組2h～4h WBC的數(shù)目與0h相比明顯下降（P＜0.01），12h時(shí)開始上升，至48h～72h又明顯高于0h（P＜0.05或P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)Ⅱ組2h～12h WBC的數(shù)目明顯下降（P＜0.01），24h時(shí)開始上升，72h又明顯高于0h（P＜0.05）。

圖1 兩實(shí)驗(yàn)組WBC的變化趨勢(shì)Fig.1 The changes of WBC counting in the two groups

3 討論

膿毒血癥是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的病理生理過程，有其特殊的血流動(dòng)力學(xué)特征，還存在失控的炎癥反應(yīng)、持續(xù)高代謝以及最終出現(xiàn)多器官功能障礙綜合征（MODS）等特點(diǎn)［4，5］。一般認(rèn)為，感染后器官功能障礙分為2類［6］：一類為原發(fā)性器官損傷（臨床稱單相速發(fā)型），占10％～20％，患者受到嚴(yán)重創(chuàng)傷感染和休克時(shí)可以很快發(fā)生器官功能障礙；另一類是繼發(fā)性器官損傷（雙相遲發(fā)型），占70％～80％，創(chuàng)傷、休克等作為第1次打擊，其后感染或非感染性損害構(gòu)成第2次打擊誘發(fā)了全身炎癥反應(yīng)（SIRS）或膿毒血癥（sepsis），此即二次打擊模型。很多學(xué)者認(rèn)為二次打擊模型（既雙相遲發(fā)型）能夠更好的模擬人體內(nèi)疾病的發(fā)生和發(fā)展過程，但此類模型制作復(fù)雜，復(fù)制困難。內(nèi)毒素介導(dǎo)的MODS模型具有致傷因素單一、造模方法簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果便于分析等優(yōu)點(diǎn)。大小鼠、兔、綿羊和犬等動(dòng)物均可用于建立MODS模型［7-10］，大鼠、小鼠雖然價(jià)格低，但對(duì)內(nèi)毒素敏感性較差，解剖結(jié)構(gòu)與人差別較大；兔對(duì)內(nèi)毒素敏感性強(qiáng)，死亡率過高；小香豬模型接近人的發(fā)病過程，但成本過高；綿羊與其他動(dòng)物比較，對(duì)LPS敏感性較高，在小劑量LPS作用下就能誘發(fā)SIRS，繼而進(jìn)展至MODS［11］；另一方面，綿羊?yàn)榇笮蛣?dòng)物，便于實(shí)驗(yàn)觀察血流動(dòng)力學(xué)、氧代謝和肺機(jī)械力學(xué)的改變，而且其病理生理變化與人相近［12］。因此，本研究選擇靜脈泵入小劑量LPS建立綿羊MODS模型。

本研究結(jié)果表明，靜注LPS后，1～6h實(shí)驗(yàn)I組和II組PaO2均明顯下降（P＜0.01），氧合指數(shù)已達(dá)到急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的診斷標(biāo)準(zhǔn)；AST、ALT、TBIL和CRE兩實(shí)驗(yàn)組均在不同時(shí)點(diǎn)明顯或顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），但AST升高的時(shí)間較早（6h）。這表明在MODS的形成過程中，LPS對(duì)肝臟的損傷早于心臟和腎臟。血常規(guī)結(jié)果表明，靜注LPS后，兩實(shí)驗(yàn)組WBC數(shù)目在2h時(shí)均顯下降（P＜0.01），之后又明顯升高（P＜0.01）。此結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［13，14］。這提示LPS靜注后，首先對(duì)WBC具有急劇殺傷的作用，之后形成SIRS，使得WBC數(shù)目急劇升高。上述結(jié)果表明，本研究利用兩種劑量的LPS均成功建立了MODS模型。但兩實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果表明，6μg/kg的LPS對(duì)機(jī)體的損傷程度和死亡率大于3μg/kg。因此，作者認(rèn)為，若對(duì)MODS的發(fā)病機(jī)制研究，利用3μg/kg的LPS較理想。這樣，既節(jié)約時(shí)間，又節(jié)省試劑。若對(duì)MODS的干預(yù)研究，利用6μg/kg的LPS較理想，這樣可以更好地驗(yàn)證藥物的防治效果。

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