動(dòng)態(tài)分析沙鼠非酒精性脂肪肝病形成及生化影響

李 巍，石巧娟，郭紅剛，樓 琦，盧領(lǐng)群，薩曉嬰

（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪蓄積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合癥，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化。近年來(lái)，隨著人類(lèi)生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，NAFLD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病呈低齡化。然而，由于NAFLD病因復(fù)雜，確切致病機(jī)理至今仍尚未形成定論，對(duì)NAFLD的預(yù)防、診斷、治療策略也很有限。有關(guān)脂肪肝的病因?qū)W、預(yù)防和治療的研究具有極其重要的意義，并已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，部分NAFLD并不是一種良性的、靜止的病變，它可在較短期內(nèi)發(fā)展為不可逆的肝損害，其肝纖維化的發(fā)生率高達(dá)25％，其中約1.5～8.0％的患者可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化［1，2］。研究非酒精脂肪肝發(fā)展過(guò)程是澄清脂肪肝發(fā)病機(jī)理，開(kāi)發(fā)藥物和發(fā)展針對(duì)性預(yù)防和治療方案的關(guān)鍵所在。

動(dòng)物模型是研究人類(lèi)疾病的重要手段，現(xiàn)有的單純高質(zhì)飲食誘導(dǎo)的NAFLD動(dòng)物模型與人類(lèi)疾病的病因、病機(jī)及病程發(fā)展都存在一定的差別，對(duì)模型動(dòng)物在不同的造模時(shí)間所處的組織病理及相關(guān)生理生化變化鮮有報(bào)道。脂肪肝被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)形式，而長(zhǎng)爪沙鼠是研究代謝綜合征比較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，目前已建立了長(zhǎng)爪沙鼠高膽固醇血癥、Ⅱ型糖尿病模型及肥胖等代謝綜合征模型［3-6］。長(zhǎng)爪沙鼠的脂代謝有許多特點(diǎn)與人類(lèi)脂代謝相似［7，8］，同時(shí)由于其個(gè)體小，易于實(shí)驗(yàn)的管理和操作，是一個(gè)良好的研究脂代謝方面的動(dòng)物。本研究以單純高脂飲食建立沙鼠NAFLD模型，通過(guò)動(dòng)態(tài)分析肝臟病理變化，檢測(cè)同時(shí)期肝組織游離脂肪酸含量、脂質(zhì)代謝、肝功能、抗氧化等指標(biāo)，探討沙鼠NAFLD形成及發(fā)展的機(jī)理，為研究NAFLD的發(fā)病發(fā)展機(jī)制和治療靶點(diǎn)選擇提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：蛋黃粉為浙江省長(zhǎng)興縣艾格生物制品有限公司產(chǎn)品。膽固醇、三號(hào)膽鹽購(gòu)于華東醫(yī)藥股份有限公司。食用豬油購(gòu)于超市。天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GOT）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）和低密度脂蛋白（LDL-c）診斷試劑盒均購(gòu)自上海豐匯醫(yī)學(xué)科技有限公司。總蛋白定量測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、谷胱甘肽-過(guò)氧化物酶（GSH-PX）測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒和游離脂肪酸（FFA）測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，并由南京建成生物工程研究所完成盲樣檢測(cè)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器：意大利Autolab全自動(dòng)生化分析儀PM4000，日本Olympus生物顯微鏡SZX7、美國(guó)Media Cybernetics公司多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)，德國(guó)萊卡切片機(jī)，低溫高速臺(tái)式離心機(jī)TGLY6G。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：（50±10）g雄性長(zhǎng)爪沙鼠120只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2008-0034；使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2008-0114）。

1.1.4 飼料配方：普通飼料及高脂飼料由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心加工生產(chǎn)。高脂飼料配方為：普通飼料80.5％、蛋黃粉10％、豬油7％、膽固醇2％、三號(hào)膽鹽0.5％［9-12］。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為對(duì)照組與模型組，每組60只。對(duì)照組給予普通飼料作為陰性對(duì)照，模型組給予高脂飼料建立NAFLD模型。于對(duì)比飼養(yǎng)第1、2、4、6、8、16周末，隨機(jī)抽選模型組與對(duì)照組各10只沙鼠，進(jìn)行標(biāo)本采集及相應(yīng)的指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)本采集及指標(biāo)測(cè)定：動(dòng)物稱(chēng)重后用1％戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈采血方式致死。分離血清，測(cè)定CHO、TG、HDL-c、LDL-c、GOT及GPT的含量。取肝臟稱(chēng)重，以臟器重量/體重×100％計(jì)算臟器指數(shù)。將取自肝最大葉中部組織用4％甲醛固定并制備石蠟切片，進(jìn)行HE染色和Mallory三色染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察病理變化。另切0.5g肝右葉，勻漿后，測(cè)定SOD、GSH-px、CAT、FFA的含量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析軟件分析。各組間比較采用兩樣本均數(shù)的T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理學(xué)分析

2.1.1 外觀特征：對(duì)照組沙鼠肝臟均柔潤(rùn)，暗紅色，有光澤（圖1 A）。模型組（圖1 B～G）隨飼喂時(shí)間延長(zhǎng)，肝臟色澤逐漸由暗紅變成赭色（2周）、土褐色（6周）和奶黃色（16周）；肝臟邊緣由尖銳逐漸變?yōu)閳A鈍，包膜越來(lái)越緊張，腫脹程度逐步加劇。這表明，模型組沙鼠脂肪肝程度隨時(shí)間加劇。

圖1 隨高脂飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)沙鼠的肝臟外觀變化（圖中由A到G依次為對(duì)照組，1，2，4，6，8，16周）Fig.1 Gross appearance of the livers at different time points（A to G：control，1，2，4，6，8，16 weeks）

2.1.2 光鏡觀察：HE染色和Mallory三色染色顯示，對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝竇清晰可見(jiàn)，肝索排列整齊，小葉結(jié)構(gòu)及匯管區(qū)均未見(jiàn)異常，細(xì)胞完整（圖2）。模型組1、2、4、6、8、16周所有動(dòng)物肝組織均出現(xiàn)不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性，而且，NAFLD進(jìn)展程度與高脂飲食時(shí)間正相關(guān)。具體來(lái)講，1周時(shí)肝組織約10％～30％的肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性（圖3），肝索結(jié)構(gòu)尚存；2周約30％～40％肝細(xì)胞脂肪變性，肝索結(jié)構(gòu)排列紊亂（圖4），形成單純性脂肪肝模型；4周時(shí)約40％～60％肝細(xì)胞脂肪變性，模型動(dòng)物單純性脂肪肝進(jìn)一步加劇（圖5）；6周時(shí)60％～80％肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞排列混亂，部分動(dòng)物門(mén)管區(qū)有炎癥（圖6），形成脂肪性肝炎模型；8周肝細(xì)胞體積增大，胞質(zhì)疏松淡染，肝細(xì)胞內(nèi)充滿細(xì)小泡沫樣脂滴空泡，腺泡Ⅲ帶局灶性竇周/細(xì)胞周纖維化（圖7）；16周時(shí)，75％～90％肝細(xì)胞脂肪變性，腺泡Ⅲ帶肝細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一、形態(tài)各異的脂滴空泡，（圖8），局灶性或廣泛的中度橋接纖維化（圖9），形成脂肪性肝纖維化模型（圖2～9見(jiàn)彩插2）。

2.2 肝功能及肝指數(shù)指標(biāo)分析

由圖10可知，1周末，模型組沙鼠肝指數(shù)已高于對(duì)照組（P＜0.05），在1～16周模型組沙鼠肝指數(shù)表現(xiàn)出進(jìn)行性增長(zhǎng)趨勢(shì)，16周時(shí)模型組肝指數(shù)達(dá)到對(duì)照組的2倍以上。由表1可知8周末，GOT、GPT出現(xiàn)了升高但無(wú)顯著性；16周末，GOT、GPT出現(xiàn)了顯著性升高（P＜0.01）。數(shù)據(jù)說(shuō)明，8周末開(kāi)始模型組動(dòng)物出現(xiàn)肝細(xì)胞破損。

圖10 沙鼠肝指數(shù)的變化（n=10）Fig.10 Changes of liver index of the gerbils（n=10）

表1 沙鼠血清GOP及GTP肝指數(shù)的變化Tab.1 Changes of serum GOT and GPT levels and liver indexes of the gerbils（n=10）

表2 沙鼠血清CHO、TG、LDL-C和HDL-C的變化Tab.2 Changes of serum CHO，TG，LDL-C，HDL-C levels of the gerbils（n=10）

2.3 血脂分析（CHO、TG、LDL-C、HDL-C）

由表2可知，與同期對(duì)照組相比，模型組沙鼠1周末血清CHO、TG、LDL-C、HDL-C均已有顯著性升高（P＜0.05，P＜0.01），6周時(shí)血脂水平有所回落；除TG外，其余三項(xiàng)在8周時(shí)均有所回升，持續(xù)升高到16周末。此數(shù)據(jù)表明沙鼠在不同階段出現(xiàn)了不同程度的血脂紊亂。模型組沙鼠HDL-C雖有顯著性升高，但各階段HDL-C/CHO比值均低于對(duì)照組，表明沙鼠血漿中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)與人類(lèi)相同，即更多的依賴(lài)于低密度脂蛋白。

2.4 肝游離脂肪酸含量分析

由表3可知，與同期對(duì)照組相比，模型組1周后肝組織FFA含量即出現(xiàn)了顯著升高（P＜0.01），6周時(shí)有所回落，8周時(shí)回升持續(xù)升高到16周末。表明了沙鼠在高脂飲食1周后肝內(nèi)即有過(guò)量的FFA堆積。

表3 沙鼠肝組織FFA含量的變化Tab.3 Changes of FFA content in liver tissue of the gerbils（n=10）

2.5 抗氧化相關(guān)酶類(lèi)活性分析

由表4可知，1-4周末模型組CAT活性有顯著性降低（P＜0.01）；8-16周末GSH-px活性有顯著性降低（P＜0.01）；4、16周末SOD活性有降低（P＜0.01），但未出現(xiàn)持續(xù)性的變化。16周末，抗氧化酶活性（SOD、GHS-PX、CAT）活性都顯著性降低（P＜0.01），GSH-px、CAT活性為對(duì)照組酶活性的1/2。不同抗氧化酶在不同時(shí)期表現(xiàn)出的顯著性降低可能與沙鼠NAFLD模型病情的發(fā)展相關(guān)。

3 討論

人類(lèi)疾病動(dòng)物模型是醫(yī)學(xué)研究中建立的具有人類(lèi)疾病表現(xiàn)的動(dòng)物模型。人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展是十分復(fù)雜的，應(yīng)用人類(lèi)疾病動(dòng)物模型，可克服復(fù)雜因素，并增加方法學(xué)上的可比性，有利于更全面地認(rèn)識(shí)疾病的本質(zhì)。人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性等原則，已有的NAFLD動(dòng)物模型尚無(wú)法滿足上述的設(shè)計(jì)原則。目前，NAFLD模型可以分為先天性/誘導(dǎo)遺傳突變遺傳性脂肪肝和通過(guò)理化因素處理而產(chǎn)生的獲得性脂肪肝兩大類(lèi)。相比而言，高脂飲食法可克服其他方法存在的或費(fèi)用昂貴，或材料耗費(fèi)多、穩(wěn)定性差、成功率欠高、對(duì)動(dòng)物損傷過(guò)重或死亡率過(guò)高等弊端，最重要的是高脂飲食法更符合人類(lèi)膳食習(xí)慣與自然發(fā)病規(guī)律。高脂飲食法NAFLD動(dòng)物模型最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠，但該模型造模時(shí)間較長(zhǎng)，TG血癥難以出現(xiàn)或不穩(wěn)定。臨床上NAFLD隨病情的進(jìn)展可表現(xiàn)為單純性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化4個(gè)階段，而大鼠NAFLD模型停滯在脂肪性肝炎模型階段，進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化模型則需要輔以酒精［13，14］，與人類(lèi)NAFLD病程不符。目前尚缺乏滿足人類(lèi)疾病動(dòng)物模型設(shè)計(jì)原則的NAFLD動(dòng)物模型。本研究以長(zhǎng)爪沙鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物復(fù)制人類(lèi)NAFLD模型。該模型除滿足重復(fù)性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性等人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)原則外，最大的優(yōu)點(diǎn)在于該模型發(fā)病條件及病程進(jìn)展表現(xiàn)出與人類(lèi)NAFLD的相似性，在以符合人類(lèi)膳食習(xí)慣與自然發(fā)病規(guī)律相似的單純性高質(zhì)飲食條件的誘導(dǎo)下，2周后形成穩(wěn)定的脂肪肝模型，隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng)，脂質(zhì)蓄積不斷加劇，中期出現(xiàn)炎癥灶，中后期發(fā)展為脂肪性肝纖維化（部分動(dòng)物肝臟出現(xiàn)硬化），彌補(bǔ)了其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)法以單純的高脂飲食法復(fù)制肝纖維化模型的缺陷。

表4 沙鼠肝組織SOD，GSH-PX，CAT活性的變化Tab.4 Changes of SOD，GSH-PX and CAT enzyme activity in liver tissue of the gerbils（n=10）

綜合沙鼠NAFLD模型在不同的造模時(shí)間所處的肝臟病理變化及肝組織游離脂肪酸含量、脂質(zhì)代謝、肝功能、抗氧化等指標(biāo)的結(jié)果分析，我們發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂與氧化應(yīng)激在沙鼠NAFLD模型病程進(jìn)展中的發(fā)揮了不同的作用。流行病學(xué)顯示，高脂血癥為脂肪肝的重要危險(xiǎn)因素，關(guān)系最為密切的為高TG血癥。而過(guò)量的游離脂肪酸（外源性或內(nèi)源性），特別是不飽和FFA，在肝內(nèi)積聚是NASH的發(fā)病激發(fā)因素［15］。飼喂高脂飼料1周后，沙鼠出現(xiàn)了持續(xù)的血脂升高，肝組織FFA含量顯著性增加，推測(cè)這些變化都與肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。另一方面，肝內(nèi)FFA水平的升高為也為活性氧的大量產(chǎn)生提供了來(lái)源?，F(xiàn)代研究表明，活性氧增多和活性氧清除劑減少是NASH的重要發(fā)病機(jī)制［16］。機(jī)體活性氧清除劑主要包括超氧化物歧化酶（SOD）等酶類(lèi)和谷胱甘肽（GSH）等非酶類(lèi)活性氧清除劑?；钚匝踉龆嗪突钚匝跚宄齽p少引起氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激是引起單純的脂肪變性向脂肪性肝炎和肝硬化進(jìn)展的主要原因［17］。推測(cè)由于模型組沙鼠肝內(nèi)FFA水平持續(xù)升高導(dǎo)致大量活性氧的生成，CAT、SOD、GSH-PX酶活性在不同階段內(nèi)的顯著性降低，致使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，從而使得模型組沙鼠6周時(shí)肝臟出現(xiàn)了炎癥灶，8周時(shí)肝細(xì)胞破損，至16周末，在脂質(zhì)代謝紊亂與氧化應(yīng)激持續(xù)綜合作用下，動(dòng)物形成中度脂肪性肝纖維化。

實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)代謝方面，6周時(shí)模型的血脂與FFA同時(shí)有所回落，除TG外，在8周時(shí)都再次升高，推測(cè)6周沙鼠對(duì)高脂飲食做出了應(yīng)激性調(diào)整。沙鼠在實(shí)驗(yàn)前期1～4周內(nèi)有穩(wěn)定的高TG血癥，且沙鼠血漿中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)與人類(lèi)相同，即更多的依賴(lài)于低密度脂蛋白。因此，在高脂血癥模型動(dòng)物的選擇中沙鼠也有很大的優(yōu)勢(shì)。

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