豬流行性腹瀉疫苗研究進展

摘要：豬流行性腹瀉給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。文章介紹了目前豬流行性腹瀉病毒的流行情況和豬流行性腹瀉疫苗的研究進展，以期為豬流行性腹瀉的防控提供參考。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉；疫苗；研究進展

中圖分類號：S858.28

文獻標(biāo)識碼：B

豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea，

PED）是一種由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的，以腹瀉、嘔吐、脫水為主要癥狀的病毒性接觸性傳染病，該病主要侵害7日齡以內(nèi)的仔豬，其病死率甚至高達100%，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

1971年，英國首次報道豬群中發(fā)生PED（Chasey and Cartwright 1978；Wood 1977），當(dāng)時被認為是“流行性病毒性腹瀉（Epidemic Ciral Diarrhoes，EVD）”。1978年，該病在比利時和英國暴發(fā)，工作人員從患病豬的病料中分離出該病的病原，將其命名為CV777，經(jīng)試驗證實該病毒是一種能引起豬腹瀉的新型冠狀病毒。1982年，該疾病被正式命名為“豬流行性腹瀉（PED）”。1988年，Hoffman等人在培養(yǎng)基中加入胰蛋白酶，在非洲綠猴腎細胞上連續(xù)傳代，成功分離PED病毒。隨后，PED傳入日本、韓國、越南、泰國、中國等國家。

1973年，在我國上海豬群中首先發(fā)生類傳染性胃腸炎（TGE）的急性腹瀉，上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所研究人員從豬病料中分離到一種病毒，經(jīng)鑒定，確認為PEDV，并命名為“華株”（上海華漕毒株，H株）。直到1984年，宣華等人利用豬胎腸組織原代單層細胞培養(yǎng)物對李佑民自吉林某豬場分離的PEDV J株（吉毒株）進行了病毒粒子的培養(yǎng)與傳代試驗，并對其細胞傳代毒株進行電鏡檢查、交互中和試驗等各項鑒定，確定PED病毒在中國出現(xiàn)。2010年之前，PED在我國屬零星、地域性地出現(xiàn)，直到2010年10月，豬流行性腹瀉病毒變異株席卷我國豬群，甚至免疫過的豬群也未能幸免，以CV777經(jīng)典毒株開發(fā)的疫苗無法為豬群提供有效免疫，新生仔豬患病后死亡率高達100%。此后，我國華中、華南、東北等大部分地區(qū)出現(xiàn)的豬流行性腹瀉以仔豬發(fā)病率高、死亡率高等為主要特點，是危害豬場最嚴重的疾病之一，至今仍未得到有效控制，我國每年因豬腹瀉造成的損失達幾十億元。近幾年，該病已成為養(yǎng)豬業(yè)危害最大的疾病之一，引發(fā)全球養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)注。

1 豬流行性腹瀉病毒簡介

PEDV豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）為尼多病毒目冠狀病毒科α冠狀病毒屬的成員。

PEDV豬流行性腹瀉病毒直徑95～190 nm，具有囊膜纖突，基因組為單股正鏈RNA基因組，全長大約28 kb，基因組由5′非翻譯區(qū)（UTR）、開放閱讀框、和3′ UTE組成。其中開放閱讀框編碼結(jié)構(gòu)蛋白共4個：纖突蛋白（S）、囊膜蛋白（E）、膜蛋白（M）、核衣殼蛋白（N）；編碼非結(jié)構(gòu)蛋白共3個：ORF1a、ORF1b、ORF3。其中S蛋白是中和抗體的主要靶點。

通過系統(tǒng)進化樹分析，將PEDV劃分為GI群（經(jīng)典毒株）和GII群（變異毒株）。GI群可分為GIa和GIb亞群，其中GIa亞群主要包括歐洲早期出現(xiàn)的CV777和DR13；GIb亞群多為細胞適

應(yīng)株。GII群分為GIIa、GIIb、GIIc亞群，GIIa亞群由美國的AH2012、HuB102017、HuB7-2017重組產(chǎn)生；GIIb亞群典型毒株為中國、韓國、泰國的毒株AJ1102、CH/SD2014；GIIc亞群毒株主要來自歐洲，一部分來自中國和美國，包括OH851、CH/HNQX-3/14、AL29等典型毒株。

2 傳統(tǒng)疫苗

2.1 滅活疫苗

將發(fā)病豬的腸道組織或經(jīng)細胞培養(yǎng)的病毒滅活后，加入佐劑以增強免疫原性所制成的疫苗，包括細胞滅活苗和組織滅活苗。1993年，王明等人將上海PEDV攻毒所得的豬腸道組織懸液制成氫氧化鋁組織滅活疫苗，該疫苗在仔豬的主動免疫和被動免疫中攻毒保護率分別達85.00%和97.06%，成為國內(nèi)外首個與PED相關(guān)的疫苗。然而，由于組織滅活苗存在生產(chǎn)工藝較為復(fù)雜、滅活不完全、產(chǎn)品批次之間質(zhì)量不穩(wěn)定、成本高等缺點，這類疫苗很少用于臨床。1994年，馬思奇等[1]在添加胰酶的病毒培養(yǎng)液中對PEDV CV777毒株進行細胞體外培養(yǎng)，經(jīng)28代傳代后，以氫氧化鋁為佐劑，制備細胞滅活疫苗，其主動免疫和被動免疫的保護率分別達85.19%和85.00%，并成功研制了商品化的PEDV病毒和TGEV病毒二價滅活疫苗。2013年，PED病毒在美國暴發(fā)，Zoetis公司于2014年9月開發(fā)PED全病毒滅活疫苗，獲得美國農(nóng)業(yè)部許可，實驗證明，該疫苗能為仔豬提供良好的被動免疫。但仔豬接種滅活疫苗后，只能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IgG抗體，無法刺激機體產(chǎn)生IgA抗體，無法激發(fā)機體的黏膜免疫，這對于PED這種主要攻擊腸黏膜的病毒來說，意味著不能提供全面的保護[2]。陳振波[3]利用PEDV-YX株F10制備PEDV氫氧化鋁膠滅活疫苗，經(jīng)后海穴注射可獲得較好的免疫效果。郭振剛等[4]利用7日齡內(nèi)PED病毒患豬的小腸組織及內(nèi)容物分離病毒并制備滅活疫苗，對妊娠母豬進行免疫，結(jié)果顯示，妊娠母豬無應(yīng)激反應(yīng)，對所產(chǎn)仔豬能夠提供理想的母源抗體，且可維持到產(chǎn)后28 d，仔豬成活率提高25.00%。門程芳[5]利用15A佐劑制備PED病毒滅活苗免疫妊娠母豬，利用臨床分離的毒株對4日齡仔豬進行攻毒，臨床試驗證明，母源抗體對仔豬產(chǎn)生良好的被動免疫效果。目前，國內(nèi)市場上有多重商品化的PEDV病毒滅活疫苗，包括單聯(lián)、二聯(lián)、三聯(lián)疫苗（表1）。

2.2 減毒活疫苗

將人工致弱或自然篩選的弱毒株，經(jīng)培養(yǎng)后制備的疫苗被稱為減毒活疫苗。1998年，佟有恩等[6]利用Vero細胞對CV777強毒株進行傳代致弱，制備的細胞弱毒苗免疫母豬后，母豬主動免疫和仔豬的被動免疫保護率分別為95.92%和96.20%，這一成果填補了我國PED病毒減毒活疫苗領(lǐng)域的空白。李秀娟等[7]利用豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗（SD/L株+LW/L株）對發(fā)病豬群進行緊急免疫，發(fā)病豬10 d內(nèi)病情得到控制，核酸陽性率降低了90.00%，初乳中的SIgA抗體陽性率100%，這證明該疫苗能夠減少豬的病毒排毒，并刺激機體產(chǎn)生黏膜抗體。馮力等人成功研制了豬流行性腹瀉、豬傳染性胃腸炎、豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗，該疫苗于2015年3月上市。由于其能一針防三種病毒，大大減少了因多次注射疫苗引起的豬只應(yīng)激。目前，國內(nèi)商品化的PEDV病毒活疫苗多與TGE活疫苗制成二聯(lián)疫苗（表2）。

3 基因工程疫苗

隨著基因工程技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，亞單位疫苗、活載體疫苗及核酸疫苗等新型基因工程疫苗成為研究熱點。

基因工程疫苗是將病原的保護性抗原編碼的基因片段克隆入表達載體，用以轉(zhuǎn)染細胞或真核細胞微生物及原核細胞微生物后得到的產(chǎn)物?；蛘邔⒉≡亩玖ο嚓P(guān)基因刪除掉， 使其成為不帶毒力相關(guān)基因的基因缺失苗。基因工程疫苗需要構(gòu)建特定的載體與表達系統(tǒng)，能夠高效表達外來基因并保證疫苗的安全性。

基因工程疫苗包括重組活載體疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗等類型。

3.1 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗包括病毒活載體疫苗和細菌活載體疫苗。該類疫苗可在載體上插入多個不同抗原進行表達，從而達到一針防多病的目的，不僅降低了疫苗的成本，還減少了因頻繁注射疫苗給豬帶來的應(yīng)激。構(gòu)建PEDV病毒重組病毒活載體疫苗常用的病毒載體有：痘病毒、牛病毒性腹瀉病毒、水皰口炎病毒等。構(gòu)建PEDV病毒重組細菌活載體疫苗的載體有：乳酸桿菌、枯草芽孢桿菌等。雖然該種疫苗能刺激豬機體產(chǎn)生體液免疫、細胞免疫、黏膜免疫，但仍存在重組的風(fēng)險。袁曉民[8]以豬痘病毒為載體，構(gòu)建重組豬痘病毒rSPV-Sa株，能有效激活豬機體IgA抗體，同時顯著提升IgG抗體和細胞因子水平，對同源性毒株的保護率達到100%。王曉雪等[9]將PEDV病毒變異株S蛋白插入復(fù)制型重組人腺病毒4型基因組E3缺失區(qū)中，使S蛋白充分表達，所構(gòu)建的重組腺病毒免疫小鼠后，產(chǎn)生特異性體液和細胞免疫應(yīng)答。

3.2 亞單位疫苗

亞單位疫苗是將PEDV病毒結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白在體外高效表達并純化作為抗原，輔以佐劑制成的疫苗。

武旺盛[10]根據(jù)PEDV病毒流行毒株KM242131株S1基因，分別構(gòu)建慢病毒表達系統(tǒng)HEK-293T-S1和重組腺病毒Ad5-S1載體系統(tǒng)，制成亞單位疫苗。檢測結(jié)果顯示，這兩種疫苗均能誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生特異性黏膜免疫。劉家興[11]利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)制備PEDV病毒鐵蛋白納米顆粒亞單位疫苗，免疫仔豬后能產(chǎn)生高水平的體液免疫和細胞免疫。王雅婷[12]利用畢赤酵母表達系統(tǒng)對PEDV S1的COE進行表達，并通過COE與人和豬的IgG1 Fc進行融合，以提高COE抗原的免疫效果。制備的亞單位疫苗免疫小鼠后，42 d產(chǎn)生較高的抗體，能起到較好的保護作用。楊燦燦等[13]將PEDV S蛋白的COE區(qū)域（E1）、S1D區(qū)域（E2）、C端區(qū)域（E3）和M蛋白的M3區(qū)域（E4）串聯(lián)起來，設(shè)計成串聯(lián)表位亞單位（EC），插入桿狀病毒基因組使其表達，并制備亞單位疫苗免疫小鼠，實驗結(jié)果顯示，該疫苗能激發(fā)小鼠產(chǎn)生良好的體液免疫和細胞免疫。張璞[14]選取PEDV S蛋白的COE區(qū)域作為目的抗原，輔以ISA660VG 佐劑制備亞單位疫苗免疫于小鼠，實驗證明，該疫苗能刺激小鼠機體產(chǎn)生良好的細胞免疫和體液免疫。張楠楠[15]利用MultiBac多基因表達系統(tǒng)成功構(gòu)建含有不同S1基因拷貝數(shù)的重組桿狀病毒，使S1蛋白在昆蟲細胞中高效表達，所制備的PEDV亞單位疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性抗體。亞單位疫苗雖然安全性高、純度高、穩(wěn)定性好、產(chǎn)量高，但與傳統(tǒng)疫苗相比，其免疫效果較差。

3.3 核酸疫苗

核酸疫苗又稱基因疫苗，將編碼蛋白的外源基因直接導(dǎo)入動物的體內(nèi)細胞中，借助宿主細胞的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而預(yù)防、治療疾病，主要包括DNA疫苗和RNA疫苗。楊利敏等[16]選擇PEDV RBD（位于S1亞基C端的受體結(jié)合區(qū)）作為疫苗靶抗原，設(shè)計出一種包含當(dāng)前流行毒株GIIa和GIIb核心抗原的RBD異源二聚體，制備mRNA疫苗，并在小鼠和妊娠母豬上進行免疫原性評價，經(jīng)檢測，該疫苗可誘導(dǎo)良好的免疫應(yīng)答?？紤]到PEDV S蛋白中的COE區(qū)域和TGE S蛋白的A、D抗原位點結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有良好的免疫原性，張海燕[17]通過柔性Linker序列將上述抗原位點融合連接作為抗原基因，以大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素亞基B亞基的基因作為免疫佐劑因子，構(gòu)建的重組核酸疫苗免疫于小鼠，實驗證明，該疫苗具有良好的免疫原性。核酸疫苗雖成本低廉、免疫效果好，但存在致突變等危險，其生物安全性有待進一步驗證和改進。

3.4 轉(zhuǎn)基因植物疫苗

轉(zhuǎn)基因植物疫苗是利用基因工程技術(shù)，將PEDV病毒的免疫保護性抗原整合到植物中并在其中充分表達的疫苗。該種疫苗利用植物細胞壁對PEDV病毒抗原蛋白的保護，使豬免受胃分泌物的干擾，進入腸道后緩慢釋放，從而刺激豬腸黏膜產(chǎn)生免疫抗體。目前，參與載體疫苗生產(chǎn)的植物病毒包括：雀麥花葉病毒（BMV）、煙草花葉病毒（TMV）、馬鈴薯X病毒（PVX）、苜?；ㄈ~病毒（ALMV）等，所生產(chǎn)的疫苗都均有良好的免疫原性。該疫苗無需注射，可通過口服形式達到免疫預(yù)防作用。尹國友[18]將豬流行性腹瀉病毒抗原成功轉(zhuǎn)入番茄植株，使免疫原蛋白在番茄基因組中表達。經(jīng)在小鼠和仔豬上免疫實驗，這種疫苗具有較高的保護率，能夠抵抗病毒的感染。ERIN等[19]將豬流行性腹瀉病毒抗原基因重組于玉米基因組中，使其在玉米基因組上穩(wěn)定表達，表達量達20 mg·kg-1。轉(zhuǎn)基因植物疫苗雖有優(yōu)勢，但是也存在一些亟待解決的問題，例如，外源蛋白在植物載體中的表達水平較低，抗原蛋白在體內(nèi)運輸過程中可能存在不穩(wěn)定等問題。

4 小 結(jié)

當(dāng)前豬病疫情復(fù)雜，疫病防控是養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的必然趨勢。近年來，中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的全國主要動物疫病報告中，在二類主要動物疫病中，豬流行性腹瀉疫情持續(xù)高位運行，這凸顯了加強豬疫病防控工作的必要性，而接種疫苗是最有效的防控措施之一。目前，市面上主要的商品化疫苗是滅活疫苗和活疫苗，但隨著分子生物技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，基因工程疫苗將很快上市。養(yǎng)殖戶可根據(jù)豬場實際情況，制定合適的免疫程序，選擇適合的疫苗進行免疫，以期降低養(yǎng)殖戶因豬疫情造成的經(jīng)濟損失。

參考文獻

[1] 馬思奇，王明，周金法，等．豬流行性腹瀉病毒適應(yīng)Vero 細胞培養(yǎng)及以傳代細胞毒制備氫氧化鋁滅活疫苗免疫效力試驗[J]．中國畜禽傳染病， 1994（2）：15-19.

[2] 王英利，趙克強，吳志國，等．豬流行性腹瀉疫苗研究進展[J]．畜牧獸醫(yī)科技信息，2019（4）：4-6.

[3] 陳振波．豬流行性腹瀉病毒YX株的分離鑒定及其滅活疫苗免疫效力試驗研究[D]．廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[4] 郭振剛，胡江鋒，王婷，等．豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗的研制[J]．動物醫(yī)學(xué)進展，2021，42（2）：26-33.

[5] 門程芳．豬流行性腹瀉病毒基因工程滅活疫苗的免疫試驗研究[D]．泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[6] 佟有恩，馮力，李偉杰，等．豬流行性腹瀉弱毒株的培育[J]．中國畜禽傳染病，1998（6）：10-13.

[7] 李秀娟，李金波，趙明禮，等．豬染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗（SD/L+LW/L株）對豬流行性腹瀉臨床應(yīng)用效果追蹤[J]．山東畜牧獸醫(yī)，2020，41（8）：6-8.

[8] 袁曉民．TGEV和PEDV重組豬痘病毒活載體疫苗的效力及載體生物安全評價[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[9] 王曉雪，劉延珂，楊東東，等．表達PEDV中國變異株S蛋白復(fù)制型重組人腺病毒4型的構(gòu)建及其免疫原性研究[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2018，40（2）：127-132.

[10] 武旺盛．兩種豬流行性腹瀉病毒S1亞單位疫苗的免疫原性[D]．長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

[11] 劉家興．豬流行性腹瀉病毒鐵蛋白納米顆粒疫苗的制備及免疫效果評價[D]．南陽：南陽師范學(xué)院，2023.

[12] 王雅婷．基于S1蛋白核心中和表位區(qū)的豬流行性腹瀉亞單位疫苗研究[D]．咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2017.

[13] 楊燦燦，吳詩璟，張峒，等．豬流行性腹瀉病毒串聯(lián)表位亞單位疫苗的免疫原性[J]．華東理工大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2022，48（5）：624-630.

[14] 張璞．豬流行性腹瀉病毒COE區(qū)亞單位疫苗的制備及在不同佐劑下對小鼠免疫原性的研究[D]．晉中：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022.

[15] 張楠楠．豬流行性腹瀉病毒基因工程疫苗的研制[D]．南陽：南陽師范學(xué)院，2018.

[16] 楊利敏，王俊虹，徐明國，等．豬流行性腹瀉mRNA疫苗的制備與免疫原性評價[J]．生物工程學(xué)報，2023，39（7）：2624-2633.

[17] 張海燕．PEDV和TGEV的S蛋白融合抗原表位核酸疫苗的研究[D]．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019.

[18] 尹國友．豬流行性腹瀉病毒抗原基因在番茄中的表達及動物免疫試驗[D]．新鄉(xiāng)：河南師范大學(xué)，2020.

[19] ERIN E， CELINE H， GINA F， et al. Oral delivery of maize-produced porcine epidemic diarrhea virus spike protein elicits neutralizing antibodies in pigs[J].Plant Cell， Tissus and Organ Culture，2020，142（11）：79-86.