扁桃斑鳩菊葉不同溶劑提取物的抗氧化性和抑菌性分析

摘 要 以水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚等5種不同極性的溶劑對(duì)扁桃斑鳩菊葉浸提，分析其提取物的抗氧化性和抑菌活性，篩選針對(duì)扁桃斑鳩菊葉中抗氧化及抑菌活性成分提取的適宜溶劑。利用提取物進(jìn)行DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP總抗氧化能力試驗(yàn)，并通過(guò)藥敏抑菌圈直徑和抑菌率分析提取物的抑菌性?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物（E3）對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除效果和總抗氧化能力最好，清除率IC50值分別為VC的1.44、1.36倍，總抗氧化能力達(dá)0.69 mg Trolox·mg-1；抑菌圈直徑和抑菌率測(cè)定結(jié)果高度一致，二氯甲烷提取物（E4）的抑菌圈直徑最大，為15.51 mm，濃度相同時(shí)其抑菌率也最高，IC50值為0.14 mg·mL-1?？傮w上看，極性小的溶劑提取物的抗氧化性和抑菌活性相對(duì)更好，乙酸乙酯和二氯甲烷可分別作為提取扁桃斑鳩菊抗氧化和抑菌活性成分的優(yōu)選溶劑。

關(guān)鍵詞 扁桃斑鳩菊；提取物；抗氧化性；抑菌活性

中圖分類號(hào)：QS567.1；TS202.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.01.003

扁桃斑鳩菊（Vernonia amygdalina Delile）是菊科斑鳩菊屬植物，因原產(chǎn)于南非，故俗稱“南非葉”，又常被稱作“苦茶葉”“苦葉”等[1]，主要分布在非洲熱帶地區(qū)和東南亞地區(qū)[2]。扁桃斑鳩菊在尼日利亞當(dāng)?shù)爻Ｗ鳛樗幨硟捎弥参颷3]，具有抗腫瘤、抗氧化、清熱解毒、消炎、降血壓、降血糖等多種功效[4-9]。隨著“一帶一路”倡議合作持續(xù)深化拓展，扁桃斑鳩菊已被引進(jìn)在我國(guó)廣東、福建、海南等亞熱帶或熱帶地區(qū)種植，其葉曬干后可制成茶葉飲用。目前，關(guān)于扁桃斑鳩菊的研究主要在其化學(xué)成分的解析及藥理作用等方面[10-12]，而對(duì)其活性部位的篩選研究還少見(jiàn)報(bào)道。本研究以水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚分別對(duì)扁桃斑鳩菊葉進(jìn)行浸提，提取物經(jīng)濃縮揮干后，探究其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率和抗氧化活性，確定扁桃斑鳩菊中抗菌和抗氧化活性成分提取的較優(yōu)溶劑并評(píng)價(jià)其活性，以期為扁桃斑鳩菊資源的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 "材料與方法

1.1 "試驗(yàn)材料和試劑

材料：扁桃斑鳩菊葉采自海南省定安縣海島散養(yǎng)農(nóng)場(chǎng)，經(jīng)凈化、殺青后，于80 ℃下烘干，粉碎過(guò)60目篩，備用。

試劑：DPPH自由基清除能力試劑盒、ABTS自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力試劑盒（FRAP法），購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚（60～90 ℃）等化學(xué)品均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；LB培養(yǎng)基，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CICC10001），購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，由實(shí)驗(yàn)室保存；超純水。

1.2 "儀器設(shè)備

DHG電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；RV 10 digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA）；Heraguard ECO超凈工作臺(tái)（賽默飛世爾科技有限公司）；LHS-100CA恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LDZX-75L高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；PRACTUM224-1CN電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；4-20R冷凍高速離心機(jī)（上海托莫斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 "試驗(yàn)方法

1.3.1 "提取

稱取約20 g扁桃斑鳩菊葉粉末，按照1∶10（g·mL-1）的比例分別用水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等5種不同極性的溶劑于60 ℃水浴下浸提2次，每次200 W超聲輔助30 min，提取2 h，合并提取液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑，所得提取物分別記為E1、E2、E3、E4、E5，于60 ℃下烘干備用。

1.3.2 "體外抗氧化性試驗(yàn)

1.3.2.1 " "DPPH自由基清除率測(cè)定

將5種溶劑的提取物用80%乙醇配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1不同濃度的溶液，參考DPPH試劑盒使用說(shuō)明，按表1方式配制溶液，混勻，室溫（25 ℃）避光靜置30 min，12 000 rpm，室溫離心5 min，取上清液于517 nm處測(cè)定其吸光度；以同梯度濃度的VC作陽(yáng)性對(duì)照。

測(cè)定組（或陽(yáng)性對(duì)照組）、空白組和對(duì)照組的吸光度分別記為As、Ab、Ac，按照公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

[DPPH清除率=As?AbAc×100%] "（1）

1.3.2.2 " "ABTS自由基清除率測(cè)定

將5種溶劑的提取物用80%乙醇配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL-1不同濃度的溶液，參考ABTS試劑盒使用說(shuō)明，按表2方式配制溶液，混勻，室溫（25 ℃）避光靜置6 min，于734 nm處測(cè)定其吸光度；以同梯度濃度的VC作陽(yáng)性對(duì)照。

測(cè)定組（或陽(yáng)性對(duì)照組）、空白組和對(duì)照組的吸光度分別記為As、Ab、Ac，按照公式（2）計(jì)算ABTS自由基清除率。

[ABTS清除率=As?AbAc×100%] （2）

1.3.2.3 " "總抗氧化能力測(cè)定

①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考FRAP試劑盒使用說(shuō)明，用80%乙醇將試劑盒中的水溶性維生素E（Trolox）標(biāo)準(zhǔn)品配制成0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 μmol·mL-1濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，移取75 μL標(biāo)準(zhǔn)液，加入75 μL超純水和850 μL顯色液，混勻，室溫（25 ℃）反應(yīng)10 min，于590 nm處測(cè)定其吸光度；以75 μL的80%乙醇代替標(biāo)準(zhǔn)液作空白。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，ΔA（ΔA=A測(cè)-A空）為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

②FRAP總抗氧化能力測(cè)定

將5種溶劑的提取物用80%乙醇配制成1.0 mg·mL-1的樣品液，參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方案，測(cè)定吸光度；以75 μL的80%乙醇代替樣品液作空白?？偪寡趸芰σ? mg樣品所相當(dāng)?shù)腡rolox的質(zhì)量（mg）來(lái)表示，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線，可通過(guò)公式（3）用測(cè)得吸光度（ΔA）進(jìn)行計(jì)算，式中250.29為Trolox的相對(duì)分子量。

總抗氧化能力（mg Trolox·mg-1）=（△A-0.0147）÷2.668 8×250.29×10-3 "（3）

1.3.3 "抑菌試驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌為供試菌種，測(cè)定提取物的抑菌性。

1.3.3.1 " "菌懸液的制備

從菌落平板上挑選金黃色葡萄球菌單個(gè)菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、100 rpm·min-1培養(yǎng)24 h?；罨笫褂肞BS緩沖液配制成濃度約為1×105 CFU·mL-1的菌懸液。

1.3.3.2 " "抑菌活性測(cè)試

將5種溶劑的提取物用PBS緩沖液均配制成1 mg·mL-1的樣品液；取菌懸液100 μL加到LB固體培養(yǎng)基中，迅速倒平板，待其凝固后進(jìn)行打孔，然后將100 μL樣品液加到孔中，平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，比較抑菌圈的直徑大小。

1.3.3.3 " "抑菌率的測(cè)定

將5種溶劑的提取物用PBS緩沖液分別配制成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg·mL-1的樣品液；于96孔板中每孔加入1.3.3.1中所配制的菌懸液100 μL，再加入100 μL樣品液，以100 μL菌懸液和100 μL PBS緩沖液為對(duì)照組，以100 μL培養(yǎng)基和100 μL樣品液為空白組，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD600值（表示菌株密度），分別用Ac、As和Ab表示；抑菌率按照公式（4）計(jì)算：

[抑菌率=Ac?AsAc?Ab×100%] （4）

1.3.4 "數(shù)據(jù)處理

以上每個(gè)試驗(yàn)平行測(cè)定3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)Excel、SPSS軟件分析處理數(shù)據(jù)。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "提取物的抗氧化性

2.1.1 "DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率測(cè)定被廣泛用于抗氧化活性的評(píng)價(jià)[13-15]，5種溶劑的提取物對(duì)DPPH自由基的清除率如圖2所示，說(shuō)明5種提取物對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，提取物濃度與清除率呈量效關(guān)系。清除率與提取物濃度的對(duì)數(shù)回歸方程和IC50值見(jiàn)表3。由圖2和表3可知，5種提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力為乙酸乙酯提取物（E3）＞乙醇提取物（E2）＞二氯甲烷提取物（E4）＞石油醚提取物（E5）＞水提取物（E1），乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力最好，其IC50值約為VC的1.44倍。

2.1.2 "ABTS自由基清除率

ABTS自由基清除率常作為體外抗氧化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)[16-18]，5種溶劑的提取物對(duì)ABTS自由基的清除率如圖3所示，5種提取物對(duì)ABTS自由基表現(xiàn)出一定的清除能力，兩者之間呈量效關(guān)系。清除率與提取物濃度的對(duì)數(shù)回歸方程和IC50值見(jiàn)表4。由圖3和表4可知，5種提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力排序?yàn)橐宜嵋阴ヌ崛∥铮‥3）＞二氯甲烷提取物（E4）＞石油醚提取物（E5）＞乙醇提取物（E2）＞水提取物（E1），對(duì)ABTS自由基清除能力最好的仍是乙酸乙酯提取物，其IC50值約為VC的1.36倍。

2.1.3 "FRAP總抗氧化能力

FRAP法即測(cè)定樣品對(duì)鐵離子的還原能力，被普遍作為樣品總抗氧化能力的指標(biāo)[19-21]。5種溶劑的提取物均有一定的抗氧化能力，其FRAP總抗氧化能力結(jié)果如圖4所示，5種提取物的總抗氧化能力順序?yàn)橐宜嵋阴ヌ崛∥铮‥3）＞二氯甲烷提取物（E4）＞乙醇提取物（E2）＞石油醚提取物（E5）＞水提取物（E1），乙酸乙酯提取物與Trolox的抗氧化能力最為接近，達(dá)到0.69 mg Trolox·mg-1。

2.2 "提取物的抑菌活性

2.2.1 "抑菌圈直徑

5種提取物抑菌圈直徑的測(cè)定結(jié)果如表5，抑菌圈直徑越大說(shuō)明抑菌性越好。參考文獻(xiàn)[22-23]，說(shuō)明5種提取物均對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出一定的抑菌活性，其中水提取物（E1）的抑菌圈直徑僅為5.63±0.21 mm，抑菌效果不明顯，而其他提取物的抑菌圈直徑均大于10 mm，抑菌效果較好，其中二氯甲烷提取物（E4）的抑菌效果最佳。

2.2.2 "抑菌率

抑菌率可作為評(píng)價(jià)樣品抑菌能力的參考指標(biāo)并被廣泛應(yīng)用[24-26]，5種提取物的抑菌率測(cè)定結(jié)果如圖5，抑菌率與濃度呈正相關(guān)。抑菌率與提取物濃度的對(duì)數(shù)回歸方程和IC50值見(jiàn)表6。由圖5和表6可知，氯甲烷提取物（E4）、乙酸乙酯提取物（E3）和石油醚提取物（E5）對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力相對(duì)較強(qiáng)，其IC50值分別為0.14、0.17、0.18 mg·mL-1；而乙醇提取物（E2）和水提取物（E1）的抑制能力相對(duì)偏弱，其IC50值分別為0.43、0.75 mg·mL-1。

3 "小結(jié)

本研究采用水、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚等5種不同極性的溶劑分別對(duì)扁桃斑鳩菊葉進(jìn)行浸提，對(duì)所得提取物進(jìn)行了體外抗氧化活性和抗菌性試驗(yàn)。DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和FRAP總抗氧化能力試驗(yàn)結(jié)果表明所得提取物均有一定的抗氧化性，3種試驗(yàn)結(jié)果具有較大的一致性，其中乙酸乙酯提取物（E3）的抗氧化性最佳，水提取物（E1）最差，乙醇提取物（E2）、二氯甲烷提取物（E4）和石油醚提取物（E5）在3種試驗(yàn)中的結(jié)果雖不一致，但差異不大。抑菌圈直徑和抑菌率測(cè)定結(jié)果高度一致，二氯甲烷提取物（E4）的抑菌能力最強(qiáng)，石油醚提取物（E5）、乙酸乙酯提取物（E3）與其較為接近，但乙醇提取物（E2）和水提取物（E1）的抑菌能力相對(duì)偏低。分析不同溶劑提取物的抗氧化性和抑菌性存在差異的原因，可能是相應(yīng)功能活性成分不同，極性也有所不同，導(dǎo)致在不同極性溶劑中的溶出率不一致；而乙醇提取物（E2）、二氯甲烷提取物（E4）和石油醚提取物（E5）在3種不同抗氧化性試驗(yàn)中表現(xiàn)出的不一致性，可能是3種試驗(yàn)的作用機(jī)制不同而導(dǎo)致的?？傮w上看，極性小的溶劑所得提取物的抗氧化性和抑菌性更好，這與Tian等[27]的研究結(jié)果相似。研究結(jié)果可為后續(xù)選擇溶劑對(duì)扁桃斑鳩菊葉進(jìn)行提取并進(jìn)一步分離純化篩選高效抗氧化及抗菌活性成分提供參考，對(duì)扁桃斑鳩菊資源的開(kāi)發(fā)和利用具有積極的指導(dǎo)意義。

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（責(zé)任編輯：易 "婧）