梵凈山區(qū)域內(nèi)黑茶中冠突散囊菌的分離和利用

摘 要 采用貴州銅仁黑茶中冠突散囊菌為實驗菌株，用3種不同的培養(yǎng)基對冠突散囊菌進(jìn)行培養(yǎng)觀察，并記錄其生長情況，得出該菌在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)最佳。后選取單株優(yōu)勢菌轉(zhuǎn)入40%蔗糖蛋白胨的液體培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)7 d，得到球菌后打碎和營養(yǎng)液混勻并分為6個不同濃度梯度接種入黑茶散茶中進(jìn)行發(fā)花培養(yǎng)15 d，烘干后得到成茶，以不接種的黑茶為對照。檢測接種后黑茶中的茶多酚含量，并進(jìn)行感官評審，發(fā)現(xiàn)發(fā)花處理不會降解黑茶本身茶多酚，其中CKA6組的感官品質(zhì)最佳，具有明顯的陳香、金花香，滋味陳醇帶韻，明顯優(yōu)于對照組。說明金花菌改善黑茶品質(zhì)具有良好的應(yīng)用前景，可以進(jìn)行下一步發(fā)花條件優(yōu)化等研究。

關(guān)鍵詞 黑茶；冠突散囊菌；發(fā)花；資源利用；貴州省梵凈山

中圖分類號：S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.01.002

我國茶文化源遠(yuǎn)流長，根據(jù)制作工藝和發(fā)酵程度，茶葉可分為綠茶、白茶、黃茶、青茶、紅茶和黑茶6種類型[1]。茶是世界三大飲料之一[2]，貴州作為我國重要的茶葉生產(chǎn)大省，氣候宜人、土地優(yōu)渥、生態(tài)良好，非常適合茶葉的種植和生產(chǎn)，安順、遵義、六盤水、畢節(jié)等地都是重要的茶葉種植基地[3]。近年來，隨著規(guī)?；r(nóng)業(yè)種植越來越受重視，貴州省茶葉種植面積和規(guī)模進(jìn)一步擴(kuò)大，為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)，也為中國茶葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展注入了活力。

近年來，關(guān)于茶葉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的真菌的研究很多。周海燕等認(rèn)為，茶葉種植和生產(chǎn)過程中會涉及到一些潛在的有害微生物及真菌毒素污染，需加強(qiáng)茶葉中真菌及真菌毒素污染狀況與防控研究[4]；張建坤等對云南景邁和芒景古茶園的茶葉樣品進(jìn)行內(nèi)生真菌平板接種，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征挑選30個分離物進(jìn)行rDNA基因測序后發(fā)現(xiàn)，其中鬼傘菌最多，其次是多節(jié)孢菌、炭團(tuán)菌和輪層炭菌[5]；管飄萍等對湖南安化金花茯磚茶、天福普洱、天福茗茶、天福南糯山熟餅、天福白茶、安吉普洱茶、祁門紅茶和金茯茶等8種發(fā)酵茶葉通過真菌分離、純化、測序，得到擬莖點霉菌、變色栓菌、枝狀枝孢菌等23種有益真菌菌株[6]；周凌云等對貴州省湄潭縣感染斑點茶樹葉片進(jìn)行病原鑒定，利用ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，并進(jìn)行GenBank同源性比對，首次發(fā)現(xiàn)了茶葉上的鐮刀菌屬[7]；商瑞等對云南產(chǎn)區(qū)腎茶葉枯病樣本進(jìn)行真菌rDNA-ITS通用引物ITS1/ITS4擴(kuò)增及同源性分析，發(fā)現(xiàn)鐮刀菌是導(dǎo)致腎茶葉枯病的病原[8]。劉詩詩從桂香18號茶樹的根、莖、葉中共分離出24株內(nèi)生真菌，并從其中分離出一種具有較強(qiáng)廣譜抑菌性的鐮刀菌屬菌株[9]。綜上可以看出，我國學(xué)者已經(jīng)針對茶葉開展了大量的菌株分離鑒定理論和實踐研究，基本理清茶葉生長過程中真菌的助長和疾病誘發(fā)作用，掌握茶葉存貯霉變過程中不良霉菌及其代謝產(chǎn)物的危害，建立起茶葉天然品質(zhì)與內(nèi)在菌種之間的關(guān)系。由于我國茶葉種類繁多，各地區(qū)受種植環(huán)境、地理條件、制作工藝、保存方式等多因素影響，茶葉中含有的真菌類型各不相同，為此，仍有必要進(jìn)一步針對特殊的經(jīng)濟(jì)型茶葉，如黑茶來提高茶葉產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價值。

黑茶是中國特有的茶類，對胃腸道具有溫和的保健作用，且口感味濃香陳，滋味醇厚，受到越來越多的消費(fèi)者認(rèn)可和喜愛[10-11]。黑茶的這些特征與其加工過程中產(chǎn)生的冠突散囊菌密不可分。黃群等通過研究冠突散囊菌發(fā)酵液中的酶類在模擬腸液、胃液中的作用，發(fā)現(xiàn)冠突散囊菌發(fā)酵液對a-淀粉酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性都有激活作用，而對脂肪起到抑制作用，表明冠突散囊菌發(fā)酵液可起到降脂、減肥、調(diào)節(jié)新陳代謝的作用[12]。在鄧放明的實驗研究中，通過分析冠突散囊菌胞外多糖的相對分子質(zhì)量，判斷其具有抗腫瘤活性[13]。但是冠突散囊菌液體發(fā)酵提取物的成分相當(dāng)復(fù)雜，例如胞外多糖，它不但具有抗腫瘤活性，而且具有降血脂、抗氧化的功效。在冠突散囊菌液體發(fā)酵過程中，因菌體的生長作用，會分泌一定的胞外多糖。真菌多糖是一種非常好的免疫調(diào)節(jié)劑，能有效激活免疫細(xì)胞，參與宿主的特異性和非特異性免疫，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。Honda等的研究證實，來自真菌多糖的抗腫瘤活性與其相對分子質(zhì)量的大小有關(guān)，只有當(dāng)分子質(zhì)量大于 1.6×104時才具有抗腫瘤活性，但對于某些功效的特定成分還需要進(jìn)一步深入研究[14]。這些研究表明，黑茶中冠突散囊菌的液體發(fā)酵技術(shù)及其利用仍需深入研究和探討，相關(guān)研究都為這一領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展提供了重要參考。Charillon等研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素及其氧化物具有抗氧化、預(yù)防心血管疾病、引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤轉(zhuǎn)化等防癌抗癌功效及抗突變、抗輻射、抗菌抗病毒等多種藥理作用[15]。在鄧放明的研究中提到了一種綠原酸物質(zhì)[13]。綠原酸是一種有成效的酚型抗氧化劑，抗氧化能力優(yōu)于部分常見抗氧化劑。綜上可知，有關(guān)冠突散囊菌的研究取得了一些進(jìn)展，但大多都是研究其應(yīng)用方面，有關(guān)冠突散囊菌的生理功能及其與茶品質(zhì)的關(guān)系研究較少，該菌培養(yǎng)方面的研究也還很欠缺，同時還存在一些分歧，需深入研究，為未來冠突散囊菌發(fā)展提供新方向。

1 "材料與方法

1.1 "材料

黑茶（銅仁市松桃錦茶業(yè)有限公司，帶金花）; 試劑：甲醇水溶液、福林酚試劑、碳酸鈉（Na2CO3）溶液、沒食子酸工作液。馬鈴薯，瓊脂、葡萄糖、胰蛋白棟、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、蔗糖。

1.2 "儀器設(shè)備

ZK-CJ-2D型超凈工作臺（北京中科起源科技有限公司）；立式壓力滅菌器100HD；雙功能水浴鍋恒溫震蕩器SHZ92B；79-1磁力攪拌器。臺式低速離心機(jī)TDZ4-WS型；電熱恒溫水浴鍋HHSG型；可見分光光度計V1200型；電子天平BSM120.4型。

1.3 "培養(yǎng)基制作

1.3.1 "PDA培養(yǎng)基

將馬鈴薯切成玉米粒大小后，放入鍋中加入蒸餾水煮沸，用4層紗布過濾，在濾液中加入20 g葡萄糖再次加熱攪拌混勻，超純水定容至1 000 mL后，在120 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺內(nèi)分裝至培養(yǎng)皿備用。

1.3.2 "LB培養(yǎng)基

稱取胰蛋白胨8 g，酵母膏糖16 g，瓊脂15 g，然后加入超純水在鍋中慢火煮至沸騰，超純水定容至1 000 mL，分裝入5 00 mL錐形瓶，在120 ℃滅菌20 min，然后在超凈工作臺內(nèi)分裝至培養(yǎng)皿備用。

1.3.3 "40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基

稱取蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蔗糖40 g，瓊脂20 g，然后加入超純水在鍋中慢火煮至沸騰，超純水定容至1 000 mL，分裝入500 mL錐形瓶，在120 ℃下滅菌20 min，然后在超凈工作臺內(nèi)分裝至培養(yǎng)皿備用。

1.4 "發(fā)花黑茶制作

1.4.1 "液體發(fā)酵

選擇分離純化后長勢比較好的菌株，在超凈工作臺中用接種鏟移取菌株外圍一小塊至對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中（液體培養(yǎng)基和純化培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為同一種），放到轉(zhuǎn)速為144 r·min-1、溫度為23 ℃的震蕩培養(yǎng)箱中7 d，培養(yǎng)出球菌。

1.4.2 "母種制作

用純水將黑茶散茶（未帶金花）打濕至濕潤狀態(tài)，取250 g裝入240 mL組培瓶中至緊實后在120 ℃下滅菌20 min， 放置室溫完全冷卻后備用。

1.4.3 "接種發(fā)花

本實驗共設(shè)7個處理。用磁力攪拌器將液體發(fā)酵所得球菌打碎，使球菌和營養(yǎng)液混勻，備用。取滅菌后的黑毛茶7組，每組250 g，再向每組分別添加5、10、15、20、25、30 mL球菌混合液，以不添加液體菌株（0 mL）為對照組（CK），然后放室溫靜置培養(yǎng)15 d。

1.4.4 "烘干

將發(fā)花后的茶葉在80 ℃茶葉烘干機(jī)中烘120 min至足干后收集密封保存?zhèn)溆?，得到成茶樣品編號見?。

1.5 "茶多酚含量檢測

參照國標(biāo)GB/T 8313—2008，對發(fā)花黑茶樣品進(jìn)行茶多酚檢測。

1.6 "感官評審

參照國標(biāo)GB/T 23776—2009 ，圍繞外形、湯色、香氣、滋味、葉底等5項因子對發(fā)花黑茶樣品進(jìn)行茶樣感官評審。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "冠突散囊菌在不同培養(yǎng)基的生長形狀

冠突散囊菌在3種培養(yǎng)基中的生長形狀見圖1，圖片均為冠突散囊菌在23 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d時所拍。冠突散囊菌在LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基的形狀均近似圓形，飽滿，在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中是不規(guī)則圓形，說明培養(yǎng)基中的營養(yǎng)條件不均衡，需優(yōu)化其培養(yǎng)條件，但在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)的冠突散囊菌總體積要大于其余兩種培養(yǎng)基中生長的菌株，推測該培養(yǎng)基更適宜茶葉中的菌株生長。

2.2 "冠突散囊菌在不同培養(yǎng)基中的生長速度

將3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的冠突散囊菌均放在23 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每隔2 d測量1次冠突散囊菌的生長速度并“十”字畫線測量其直徑，平均生長速度結(jié)果見表2。開始時，冠突散囊菌在LB培養(yǎng)基中的生長由快到慢且較平緩，接種后2 d很快適應(yīng)環(huán)境，至第6天后生長緩慢，至第10天達(dá)到飽和生長。冠突散囊菌在PDA中的生長則不穩(wěn)定，第1天到第4天，生長平穩(wěn) ，第6天時生長較慢，第8天后持續(xù)生長。冠突散囊菌在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中接種后快速生長，在第4天時生長速度最快，可知，在這個時間段吸收養(yǎng)分最佳。

冠突散囊菌在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中的平均生長速率為0.72 cm，在3種培養(yǎng)基中是最快的，而在LB培養(yǎng)基的平均生長速率為0.56 cm，為最慢。

2.3 "茶多酚含量

不同發(fā)花處理黑茶樣品的茶多酚含量如表3所示。未添加液體菌株的CK組茶多酚含量最高，平均含量為0.51%±0.07%，而添加冠突散囊菌液體菌株20 mL和30 mL的黑茶中茶多酚含量最低，分別為0.39%±0.07%和0.41%±0.08%。經(jīng)差異顯著性分析，6個茶樣的茶多酚含量與對照組的差異均不顯著，并未過多降解茶葉中的茶多酚。在黑茶生產(chǎn)過程中，隨著冠突散囊菌與黑毛茶共同發(fā)酵的程度增加，所得茶葉產(chǎn)品的茶多酚含量則會越低。從表3可以看出，隨著液體菌株的投入量增加，發(fā)花黑茶的發(fā)酵程度隨之增加。當(dāng)投入量為20 mL（即0.08 mL·g-1）時，發(fā)酵程度趨于穩(wěn)定，可能此時液體菌株與黑毛茶已飽和，茶多酚含量也最低。

2.4 "感官評審結(jié)果

經(jīng)過發(fā)花處理的樣品都具有顯金花的外形特征，故實驗組的外形都高于CK組；湯色都具有明亮的特點，實驗組的湯色為橙黃，與CK組杏黃特點不同，說明金花菌本身的顏色對茶湯湯色也有影響。其中CKA4和CKA6是添加較多金花菌的處理，具有明顯金花香，不具有令人不悅的氣味，說明金花菌可以適當(dāng)提升黑茶香氣品質(zhì)，改善香型（見表3）。其中CKA6的茶樣外形油潤，金花遍布，滋味口感較好，總體得分85分，品質(zhì)最佳，推測這與發(fā)花條件下培養(yǎng)的茶樣金花含量最高有關(guān)系，表明利用金花菌發(fā)酵技術(shù)改進(jìn)黑茶加工工藝具有良好前景。

3 小結(jié)

從銅仁本地黑茶（帶金花）中提取分離到冠突散囊菌，將其純化接種于不同的培養(yǎng)基。經(jīng)觀察得知，冠突散囊菌在LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中的形狀為近圓形，在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中是不規(guī)則圓形。說明培養(yǎng)基中的營養(yǎng)條件不均衡，需優(yōu)化其培養(yǎng)條件，但在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)的冠突散囊菌總體積要大于其余2種培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，且數(shù)據(jù)分析得出冠突散囊菌在40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長平均速度最高，這可能是因為冠突散囊菌最適宜在此培養(yǎng)基中生長。為尋找穩(wěn)定且優(yōu)勢的冠突散囊菌培養(yǎng)條件，未來可對40%蔗糖蛋白胨培養(yǎng)基配方的比例進(jìn)行優(yōu)化實驗。經(jīng)茶多酚檢測結(jié)果得知，當(dāng)添加冠突散囊菌液體菌株15 mL時，黑茶的茶多酚含量最高；而當(dāng)添加量為20、30 mL時，茶多酚含量低。差異顯著性分析結(jié)果顯示，6個茶樣的茶多酚含量與對照組的差異均不顯著，說明發(fā)花處理不會降解黑茶本身的茶多酚含量。經(jīng)感官評審得出，在250 g黑茶中加入30 mL冠突散囊菌液體菌株，感官評審效果最好，得分最高，也可說明，加入冠突散囊菌適量會改善黑茶品質(zhì)。金花菌改善黑茶品質(zhì)具有良好的應(yīng)用前景，可以進(jìn)行下一步開發(fā)利用、發(fā)花條件優(yōu)化等研究。

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（責(zé)任編輯：敬廷桃）