圓齒野鴉椿CLE多肽的系統(tǒng)鑒定及功能分析

摘 要 采用生物信息學(xué)的方法，鑒定和分析了圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii Hayata）CLE基因家族組成及其表達調(diào)控作用機制。結(jié)果：從圓齒野鴉椿中共鑒定出15個CLE基因，分布在圓齒野鴉椿的6條染色體上，其編碼的前體肽大小介于94～920 aa，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量介于10 705.66～101 725.48 KD，理論等電點介于5.84～12.01。多序列比對和偏好性分析表明，圓齒野鴉椿CLE與擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]CLE的同源多肽較為一致，但是部分圓齒野鴉椿CLE在第9位氨基酸上表現(xiàn)出了對絲氨酸的偏好性。系統(tǒng)進化分析表明，圓齒野鴉椿CLE基因成員分為6大亞家族，分別為Group1（0個）、Group2（0個）、Group3（CLE1、CLE2）、Group4（CLE8、CLE9、CLE10、CLE13、CLE14、CLE15）、Group5（CLE11、CLE12）、Group6（CLE3、CLE4、CLE5、CLE6、CLE7）亞組。功能分析發(fā)現(xiàn)，CLE3、CLE4在根部維管束組織中表達，影響根的初生木質(zhì)部發(fā)育，CLE9、CLE10、CLE8、CLE13、CLE14、CLE15在根部韌皮部中表達，可以通過間接或直接相互作用，引導(dǎo)根的初生韌皮部細胞從分裂向分化轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞 圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii Hayata）；CLE多肽；系統(tǒng)進化；功能分析

中圖分類號：Q789 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2025.01.001

CLE（CLAVATA3/Embryo surrounding region-related）多肽是一種非常重要的植物生長調(diào)節(jié)劑，它在植物生長發(fā)育過程中，與細胞間的信號傳遞有關(guān)[1]，在分生組織細胞分裂和分化的維持中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)作用[2]。圓齒野鴉椿（Euscaphis konishii Hayata）屬于省沽油科（Staphylea）野鴉椿屬（Euscaphis），為落葉小喬木或灌木。圓齒野鴉椿除了具有觀賞價值外，還是功效極為出色的藥材，其根起到清熱解毒、祛濕的作用[3]。關(guān)于CLE多肽研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）中存在17個CLE基因[4]，楊樹（Populus L.）中具有50個CLE基因[5]，番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中含有15個CLE基因[6]。吳云飛等研究發(fā)現(xiàn)CLE多肽也調(diào)控維管組織分化與增殖的平衡，CLE40能促進干細胞的分化，對維持根頂端分生組織干細胞的動態(tài)平衡起著重要作用[7]。TDIF（Tracheary element differentiation inhibitory factor）是一種由百日草（Zinnia elegans Jacq.）和其他植物產(chǎn)生的小分子肽類信號物質(zhì)，在植物導(dǎo)管形成過程中具有重要作用。李曉旭研究發(fā)現(xiàn)百日草TDIF氨基酸序列與擬南芥CLE41/CLE44序列完全相同，TDIF/CLE41/CLE44類信號物質(zhì)是調(diào)控植物導(dǎo)管分化和組織發(fā)生的關(guān)鍵分子[8]。有研究表明，在擬南芥中，過表達CLE41/CLE44會導(dǎo)致原形成層細胞消耗，并造成導(dǎo)管斷裂，因此TDIF/CLE41/CLE44的作用是可以促進原形成層增殖，并對原形成層分化為導(dǎo)管進行抑制[9-11]。李天笑等提出PgCLE9、PgCLE14、PgCLE16等基因?qū)θ藚⒉欢ǜ种?shù)有抑制作用，而PgCLE5通過促進不定根的分支來增加不定根的分支數(shù)[12]。同時，在擬南芥的初生根系統(tǒng)中，這些成員都能夠顯著抑制主根和側(cè)根的生長。目前關(guān)于圓齒野鴉椿的分子研究集中在果色形成機制上[13]，對圓齒野鴉椿根生長發(fā)育的分子研究較少。本研究通過對圓齒野鴉椿CLE多肽功能分析及鑒定，進一步挖掘圓齒野鴉椿中的功能多肽及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在根生長發(fā)育中的功能，為圓齒野鴉椿初生根調(diào)控提供一定的理論支撐。

1 "材料與方法

1.1 "圓齒野鴉椿CLE基因的查找

在獲得圓齒野鴉椿基因組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上[14]，以模式植物擬南芥[15]作為參考，鑒定圓齒野鴉椿CLE多肽基因。在TAIR10數(shù)據(jù)庫（https：//www.Arabidopsis.org/）中以“CLAVATA3”作關(guān)鍵詞搜索[16]，獲取擬南芥的CLE多肽蛋白序列，利用ATCLE的peptide sequence，進行BLASTP檢索，E值≤10-10的基因作為候選基因。同以上方法，再用候選基因的peptide sequence進行二次查找。

1.2 "圓齒野鴉椿CLE基序圖譜的繪制

把圓齒野鴉椿CLE多肽序列和擬南芥CLE多肽序列合成一個文檔，以fasta格式，打開方式選擇MEGA7.0軟件，點擊“Align selected with MUSCLE”，再點擊“Align Protein”，進行多序列比對，根據(jù)已經(jīng)報道的擬南芥CLE多肽，找到對應(yīng)的圓齒野鴉椿保守序列，利用在線軟件WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制CLE基序圖譜，進行偏好性分析。

1.3 "多序列比對與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用MEGA 7.0軟件對獲得的CLE蛋白序列進行多重序列比對。以多序列比對結(jié)果為基礎(chǔ)，最大似然算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復(fù)測試（ReplicATions）設(shè)置為1 000[17]，輸出方式為Newick格式，打開FigTree v1.4.4軟件美化進化樹，對圓齒野鴉椿CLE多肽進行亞家族分類。

1.4 "圓齒野鴉椿CLE基因表達熱圖譜的構(gòu)建

根據(jù)本課題組測得的圓齒野鴉椿枝條、果實、葉片、花瓣、花瓣+萼片、雄蕊和雌蕊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得CLE基因表達量的FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值，打開TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists）v1.108軟件[18]，選擇Gra-phis中的HeatMap，粘貼EXCEL中整理好的基因表達量數(shù)值，點擊Start，得到表達量熱圖，利用Show Contronl Dialog調(diào)整色階梯度，使得熱圖具有最好的分辨率。最后以jpg格式輸出熱圖。

2 "結(jié)果與分析

2.1 "圓齒野鴉椿CLE多肽的鑒定與理化性質(zhì)

利用在線預(yù)測軟件SignalP 4.1Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）[19]，對圓齒野鴉椿CLE基因信號肽位置進行預(yù)測，獲得15個圓齒野鴉椿CLE基因，比對基因號，將其命名為Ej-CLE+阿拉伯?dāng)?shù)字（見表1）。

通過對圓齒野鴉椿CLE多肽基因家族的理化性質(zhì)分析（見表2），CLE基因家族編碼的長度介于94～920 aa；蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量介于10 705.66～101 725.48 KD；理論等電點介于5.84～12.01，偏酸性的只有EjCLE11，為5.84，其他14位成員均為堿性，平均為9.7，表明該基因家族多肽很大程度上偏堿性；不穩(wěn)定系數(shù)介于44.6～75.68，親水性總平均值大多為負數(shù)，表明圓齒野鴉椿的CLE蛋白大多為不穩(wěn)定的親水蛋白[20]，僅CLE7編碼的蛋白為不穩(wěn)定的疏水蛋白，其他的都為不穩(wěn)定的親水蛋白。

2.2 "圓齒野鴉椿CLE多肽基序

根據(jù)擬南芥和圓齒野鴉椿CLE基因編碼蛋白序列的多序列比對結(jié)果，圓齒野鴉椿CLE多肽的基序由12個氨基酸組成。其中，擬南芥CLE13與圓齒野鴉椿CLE3具有相同的基序，擬南芥CLE10和CLE9與圓齒野鴉椿CLE4具有相同的基序，圓齒野鴉椿CLE13與擬南芥CLE25具有相同的基序。利用MEGA7.0對圓齒野鴉椿CLE多肽與擬南芥CLE多肽的同源性進行了比較，發(fā)現(xiàn)它們與擬南芥CLE多肽的同源性較高（見圖1）。

利用Motif在線預(yù)測軟件MEME Suit v5.5.2（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對圓齒野鴉椿和擬南芥的CLE基因進行預(yù)測分析，并結(jié)合webLogo在線軟件（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）繪制CLE基序圖譜（如圖2）。通過圓齒野鴉椿15個CLE基序圖譜發(fā)現(xiàn)，每一個CLE基序都由12個氨基酸組成，不同CLE成員間氨基酸序列相似度較高。圓齒野鴉椿作為CLE蛋白家族的重要代表之一，在其CLE基序圖譜中也顯示出這些成員的一些保守和變異的特征。15個圓齒野鴉椿CLE基序的保守位點包括：第1位的精氨酸（Arg），第4、7、9位的脯氨酸（Pro），第6位的甘氨酸（Gly）及第11位的組氨酸（His）等。這些氨基酸殘基在CLE蛋白成員中起著核心性質(zhì)或者重要結(jié)構(gòu)性質(zhì)的作用[21]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，圓齒野鴉椿CLE多肽與擬南芥CLE多肽同源程度較高（見圖2、圖3），基序序列的偏好性類似。擬南芥CLE基序的保守位點包括：第1位的精氨酸（Arg），第4、7、9位的脯氨酸（Pro），第6位的甘氨酸（Gly），以及第11位的組氨酸（His）。

2.3 "圓齒野鴉椿CLE基因的染色體定位

利用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists） v1.108軟件的Gene LocATion Visualize from GTF/GEE功能，輸入圓齒野鴉椿的注釋文件，根據(jù)位置信息將15個CLE基因定位到圓齒野鴉椿染色體上（圖4，見封三），有15條CLE基因分布在6條染色體上，其中分布在4號染色體上的有6條，分別為CLE4、CLE5、CLE8、CLE10、CLE13、CLE15；2號染色體上分布有CLE2、CLE3、CLE7；7號染色體上分布有CLE7、CLE11；5號染色體上分布有CLE1、CLE6；8號染色體上分布有CLE12；3號染色體上分布有CLE14；1號、6號染色體上無CLE基因分布。

2.4 "圓齒野鴉椿CLE基因結(jié)構(gòu)

采用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists） v1.108軟件對15個圓齒野鴉椿CLE基因進行基因結(jié)構(gòu)的可視化分析，發(fā)現(xiàn)近一半的基因有內(nèi)含子，其中5個CLE基因有1個內(nèi)含子，2個CLE基因有2個內(nèi)含子，僅有1個CLE基因有多個內(nèi)含子（圖5-A，見封三）。

采用MEME（https：//meme-suite.org/meme/）在線軟件分析15個圓齒野鴉椿CLE蛋白全長序列特征，發(fā)現(xiàn)有5個保守基序（圖5-B，見封三），只有CLE5、CLE13、CLE14和CLE15包含Motif5，CLE1和CLE2包含Motif4，且只有CLE11不包含Motif2，所有基因都包含Motif1。Motif1包含了CLE多肽核心功能序列，位于CLE多肽蛋白序列的C端。

2.5 "圓齒野鴉椿CLE系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

根據(jù)以上方法利用MEGA7.0軟件對擬南芥CLE蛋白序列和圓齒野鴉椿CLE蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，根據(jù)擬南芥的CLE家族分類關(guān)系可以將這些成員分為6個亞組，分別用Group1、Group2、Group3、Group4、Group5、Group6表示（圖6，見封三），此外，15個圓齒野鴉椿CLE基因系統(tǒng)進化樹的分組結(jié)果與該結(jié)果也比較一致。其中Group1和Group2沒有圓齒野鴉椿CLE基因家族成員，僅有擬南芥CLE基因聚類在一起；Group4中基因家族成員最多，有CLE8、CLE9、CLE10、CLE13、CLE14、CLE15共6組基因；其次為Group6，有CLE3、CLE4、CLE5、CLE6、CLE7共5組基因；Group3和Group5基因家族成員都為2個，Group3有CLE1和CLE2，Group5有CLE11和CLE12。在這6個亞組中，Group3、Group4和Group5距離較近，Group1、Group2和Group6距離較遠。

2.6 "圓齒野鴉椿CLE基因家族成員表達模式

通過上述方法篩選出15個圓齒野鴉椿CLE基因表達量的FPKM，利用TBtools-Ⅱ（Toolbox for Biologists） v1.108軟件繪制熱圖譜（圖7，見封三）。

果實中圓齒野鴉椿CLE基因的表達量普遍較低，其中CLE1、CLE2、CLE3、CLE4、CLE5、CLE6、CLE7、CLE11、CLE13、CLE14的表達量最低，表明這些CLE基因在果實中的調(diào)控作用較小，但在果實Ⅰ中圓齒野鴉椿CLE9、CLE10、CLE12表達量較高，果實Ⅱ中圓齒野鴉椿CLE8、CLE15表達量較高。在枝條中圓齒野鴉椿CLE2、CLE6、CLE7、CLE13、CLE14的表達量較果實高很多，表明這些基因主要參與圓齒野鴉椿枝條調(diào)控。圓齒野鴉椿在葉片上CLE基因表達量普遍較低，僅有CLE4有較高的表達量，表明圓齒野鴉椿CLE基因在葉片中的調(diào)控作用較小。在花瓣和萼片中，圓齒野鴉椿CLE基因表達量普遍較低，表明圓齒野鴉椿CLE基因在花萼和萼片中的調(diào)控作用較小。在花瓣Ⅱ中，圓齒野鴉椿CLE1、CLE10、CLE14表達量較高，花瓣Ⅰ中圓齒野鴉椿CLE4、CLE5表達量較高，其余表達量均較低，表明圓齒野鴉椿CLE1、CLE4、CLE5、CLE10、CLE14在花瓣中的調(diào)控作用較其他CLE基因大。在雄蕊中僅CLE3表達量較高，雌蕊中僅CLE11表達量較高，表明圓齒野鴉椿CLE3和CLE11在雄蕊和雌蕊中的調(diào)控作用較大。

結(jié)合圓齒野鴉椿CLE基因亞家族分類可知，Group3和Group6的CLE基因在果實中的調(diào)控作用較小，Group4和Group5的CLE基因在果實Ⅰ和果實Ⅱ中的表達量較高，Group3、Group4和Group6的CLE基因在枝條、花瓣中的調(diào)控作用較大，表明Group3和Group6、Group4和Group5的關(guān)系較近，Group3和Group6的CLE基因共同調(diào)控圓齒野鴉椿花瓣、枝條的生長發(fā)育，Group4和Group5的CLE基因共同調(diào)控圓齒野鴉椿果實的生長發(fā)育。

3 "討論

擬南芥[Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.]的基因結(jié)構(gòu)較簡單，在當(dāng)今的植物發(fā)育學(xué)研究中，基于模式植物的生命機理研究越來越多。近年來，文獻數(shù)據(jù)庫PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）推動了植物分子生物學(xué)方面的研究[22]。對于目前已經(jīng)報道的關(guān)于CLE基因多肽的研究，擬南芥CLE多肽系統(tǒng)鑒定及功能研究比較透徹，其蛋白是一類小分子多肽，參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程中的細胞分化、干細胞維持和根系統(tǒng)發(fā)育等關(guān)鍵生理過程。通過對圓齒野鴉椿基因組數(shù)據(jù)的分析得知，圓齒野鴉椿基因組中存在多個可能編碼CLE蛋白的基因，這些基因在圓齒野鴉椿不同組織中的表達水平也存在差異，表明它們可能有不同的生物學(xué)功能。

擬南芥CLE1、CLE3、CLE4、CLE7與植物固氮相關(guān)，同時影響植物側(cè)根發(fā)生，其在植物的次生根中特異表達[23]。因此推測圓齒野鴉椿CLE11和CLE12可能執(zhí)行相似的功能，影響側(cè)根生長。CLE41、CLE44、CLE45等基因編碼的擬南芥CLE蛋白在擬南芥干細胞的維持和分化中發(fā)揮了重要作用，調(diào)節(jié)根尖中的細胞分裂、分化及芽梢生長方向等生理過程，CLE3和CLE29基因編碼的蛋白則參與了莖尖分生和根伸長等生理過程調(diào)控。因此，可以合理推測圓齒野鴉椿CLE蛋白也可能參與植物的干細胞維持和分化、根系和莖的生長發(fā)育等關(guān)鍵生理過程。

一些研究表明，在莖尖和根尖中，擬南芥CLE多肽激活了WUSCHEL（WUS）和CLAVATA3（CLV3）基因?qū)?yīng)的信號通路，這些基因編碼激素受體蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)莖尖和根尖中植物干細胞的自我更新和身份維持[24-26]。有研究表明，ATCLE40/CLE40信號途徑和CLV2/CRN信號途徑在擬南芥根發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，對了解植物根部組織的形成和調(diào)控機制具有重要意義[27-28]，因此推測與ATCLE40聚類在一起的圓齒野鴉椿CLE6也有相似的功能，維持根頂端分生組織干細胞的動態(tài)平衡。

維管系統(tǒng)又稱為維管組織系統(tǒng)（Vascular tissue system），包括植物體內(nèi)所有的維管組織，在植物的生長發(fā)育過程中起到物質(zhì)運輸[29]、機械支持和信號傳導(dǎo)等重要作用[30]。在擬南芥中，CLE45多肽在韌皮部中表達，外源施加ATCLE45多肽能夠抑制根初生韌皮部的分化，并抑制臨近半胞細胞和篩管分子前體細胞的發(fā)育，最終起到抑制根初生韌皮部分化的作用[31]。CLE9/10分泌肽也可以通過與BAM受體結(jié)合來抑制形成層細胞向木質(zhì)部的分化[25]。而CLE25多肽則通過與CLERK-CLV2受體復(fù)合物結(jié)合來促進維管系統(tǒng)中形成層細胞向韌皮部的分化[32]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，CLE25及其對應(yīng)受體BAM，能參與長途信號傳導(dǎo)以應(yīng)對缺水脅迫，產(chǎn)生從根到芽的信號，誘導(dǎo)ABA合成并導(dǎo)致氣孔關(guān)閉[33]。因此推測與ATCLE45聚類在一起的CLE8、CLE9和CLE10也有類似的功能，抑制根初生韌皮部的分化；CLE3、CLE4也與擬南芥CLE9/10有類似功能；CLE13、CLE14、CLE15和ATCLE25聚類在一起，推測CLE13、CLE14、CLE15可能執(zhí)行相似的功能。

本研究使用生物信息學(xué)的方法，首次系統(tǒng)分析圓齒野鴉椿CLE多肽基因家族，發(fā)現(xiàn)圓齒野鴉椿有15個CLE基因家族成員，這些基因與CLE多肽功能序列高度保守，每個基因都包含Motif1，大部分CLE都有內(nèi)含子。系統(tǒng)進化分析表明，CLE3、CLE4在根部維管束組織中表達，影響根初生木質(zhì)部的發(fā)育，CLE8、CLE9、CLE10、CLE13、CLE14、CLE15在根部韌皮部中表達，影響根初生韌皮部細胞的分化。本文為深入研究CLE多肽在圓齒野鴉椿生長中的作用奠定了研究基礎(chǔ)，有助于更好地理解植物生長發(fā)育的分子機制。

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（責(zé)任編輯：易 "婧）