慢性乙型肝炎功能性治愈離完全治愈還有多遠？

摘要： 功能性治愈是目前國內(nèi)外慢性乙型肝炎的理想抗病毒治療終點，其外周血HBsAg清除及HBV DNA檢測不到并維持24周以上，標(biāo)志著HBV感染的消退。然而，針對HBsAg清除后的肝內(nèi)HBV標(biāo)志物特點尚未有系統(tǒng)性描述。本文針對慢性乙型肝炎功能性治愈的最新定義、血清HBsAg清除后的肝內(nèi)病毒學(xué)標(biāo)志物特征、血清HBsAg高敏檢測意義及低水平HBsAg是否需要治療等問題等進行闡述，以期提高臨床醫(yī)生對慢性乙型肝炎功能性治愈的認識。

關(guān)鍵詞： 乙型肝炎， 慢性； 功能性治愈； 乙型肝炎表面抗原； DNA， 病毒

基金項目： 國家自然科學(xué)基金（82170612）； 廣州市科技計劃重點項目（2023B01J1007）； 廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金省市聯(lián)合基金項目（2023A1515110584）； 國家資助博士后研究人員計劃（GZC20233249）

How far is the functional cure of chronic hepatitis B from complete cure？

GAO Na， GAO ZhiliangDepartment of Infectious Diseases， The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author： GAO Zhiliang， gaozhl@mail.sysu.edu.cn （ORCID： 0000-0001-7611-4416）

Abstract： Functional cure is currently the ideal treatment endpoint for chronic hepatitis B （CHB） in China and globally. HBsAgseroclearance and HBV DNA that cannot be detected in peripheral blood for more than 24 weeks marks the regression of hepatitis Bvirus （HBV） infection. However， there is still a lack of systematic description of the characteristics of intrahepatic HBV markers afterHBsAg seroclearance. This article elaborates on the issues including the latest definition of functional cure， the characteristics ofintrahepatic virological markers after HBsAg seroclearance， the significance of ultrasensitive serum HBsAg detection， and antiviraltherapy for CHB patients with a low level of HBsAg， so as to improve the understanding of functional cure among clinicians.

Key words： Hepatitis B， Chronic； Functional Cure； Hepatitis B Surface Antigens； DNA， ViralResearch funding： National Natural Science Foundation of China （82170612）； Key Project of Guangzhou Municipal Science andTechnology Program （2023B01J1007）； Provincial-Municipal Joint Fund Project of Guangdong Provincial Basic and Applied Basic

Research Fund （2023A1515110584）； National Funding Program for Postdoctoral Researchers （GZC20233249）

全球超過2. 9億人患有慢性乙型肝炎（CHB），每年有超過80萬患者死于CHB相關(guān)并發(fā)癥［1］ ，世界衛(wèi)生組織（WHO）提出“2030年全面消滅病毒性肝炎”的目標(biāo)。血清HBsAg清除是目前臨床普遍接受的抗病毒治療終點，其中長期核苷（酸）類似物［nucleos（t）ide analogues，NAs］治療的累積 HBsAg 清除率僅為 0～5%；有限療程下的聚乙二醇干擾素（PEG-IFN）治療的血清 HBsAg 清除率為 3%～14%，致使針對 CHB 功能性治愈的研究受限［2］。

2019年我國推出《慢性乙型肝炎臨床治愈（功能性治愈）專家共識》［3］ ，明確將CHB功能性治愈定義為“持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答且血清 HBsAg陰轉(zhuǎn)或伴有抗-HBs陽轉(zhuǎn)、ALT正常、肝組織學(xué)病變輕微或無病變”。隨著臨床研究的進一步深入，CHB 功能性治愈的概念逐漸趨于完善，有了更多細化的標(biāo)準(zhǔn)。研究發(fā)現(xiàn)，部分CHB患者雖然血清HBsAg陰轉(zhuǎn)，但血清HBeAg仍為陽性，而停止抗病毒治療時血清HBeAg陽性是血清HBsAg復(fù)陽的危險因素（OR=12. 271）［4］。在終止PEG-IFN治療時，血清中抗-HBs抗體水平≥100 IU/L是血清HBsAg復(fù)陽的保護因素（OR=0. 110）［5］ ，這與宿主針對 HBV 的免疫功能恢復(fù)密切相關(guān)［6］ ；相反，對于那些在停止治療時血清抗-HBs抗體水平低于10 IU/L且已實現(xiàn)HBsAg陰轉(zhuǎn)的患者，血清HBsAg復(fù)陽率可達29. 5%［5］。除了血清HBsAg陰轉(zhuǎn)時的HBeAg及抗-HBs狀態(tài)是血清HBsAg復(fù)陽的危險因素外，停止抗病毒治療后僅一次確認血清HBsAg陰轉(zhuǎn)的患者其后續(xù)隨訪中血清HBsAg復(fù)陽率高于兩次確認（至少間隔24周）HBsAg 陰轉(zhuǎn)的患者［7］ 。美國肝病學(xué)會-歐洲肝病學(xué)會HBV-HDV治療終點會議中，將CHB功能性治愈定義為：停止抗病毒治療后24周持續(xù)的血清HBsAg陰轉(zhuǎn)和HBVDNA低于定量檢測下限（即HBV DNAlt;10 IU/mL），伴或不伴抗-HBs出現(xiàn)；同時需要滿足血清HBeAg持續(xù)陰轉(zhuǎn)、ALT復(fù)常，最終獲得肝組織學(xué)改善并降低肝癌的發(fā)生風(fēng)險，但肝臟中仍有cccDNA及整合HBV DNA［8］ 。CHB完全治愈則是在 CHB 功能性治愈的基礎(chǔ)上清除肝內(nèi)的cccDNA及HBV DNA整合，但由于cccDNA及HBV DNA整合位于肝細胞核內(nèi)，并且目前的NAs及PEG-IFN很難到達肝細胞核內(nèi)直接作用于cccDNA及HBV DNA整合，CHB完全治愈被認為在臨床實踐中難以達到。部分治愈定義更新為如下：停止抗病毒治療后血清HBsAg持續(xù)小于 100 IU/mL，血清 HBV DNA低于檢測下限，至少維持24周，但血清HBsAglt;100 IU/mL是否為具有臨床意義的安全閾值仍需臨床大數(shù)據(jù)進一步評判（表1）。

有文獻報道，完全抑制HBV復(fù)制后進一步清除血清HBsAg，8 年肝細胞癌（HCC）的累積發(fā)生率可下降至0. 6%［10］。中國慢性乙型肝炎臨床治愈（珠峰）工程項目、OSST研究、NEW SWITCH研究的數(shù)據(jù)提示，NAs經(jīng)治的優(yōu)勢患者的48周血清HBsAg清除率可達31. 43%、22. 2%和26. 5%［11-13］ ；其次，對CHB兒童、HBV感染孕婦產(chǎn)后等特殊人群亦有探索功能性治愈的相關(guān)研究，并取得一定療效［14-15］ 。例如，接受 PEG-IFN-α-2b 治療的 HBV 感染孕婦，48周時的HBsAg清除率為51. 06%。這些研究提示，在特殊人群中實現(xiàn) CHB 功能性治愈亦具有較強的可行性。

既往關(guān)于血清HBsAg清除后肝內(nèi)HBV標(biāo)志物的研究多在 HBV 隱匿性感染合并 HCC 的患者中進行。然而，經(jīng)過有限療程抗病毒治療達到血清HBsAg清除的患者，其肝內(nèi)HBV標(biāo)志物仍需進一步闡明。上述臨床研究為探討CHB功能性治愈的預(yù)測因素及探索肝內(nèi)HBV標(biāo)志物譜奠定了重要基礎(chǔ)。本文對當(dāng)前功能性治愈的血清學(xué)及肝組織學(xué)研究進展進行綜述，并討論了實現(xiàn)完全治愈面臨的挑戰(zhàn)和未來研究的方向。

1 CHB功能性治愈的血清學(xué)標(biāo)志物及其意義

1. 1 血清HBsAg檢測及其意義 HBsAg主要來自cccDNA和HBV DNA整合的轉(zhuǎn)錄合成，隨著CHB疾病進程的變化，cccDNA和整合HBV DNA來源的HBsAg的占比會發(fā)生變化。HBV感染的最初階段以含有cccDNA的肝細胞為主，含有HBV DNA整合的肝細胞只占很少數(shù)（每10 4 ～10 6 個細胞中含有1個HBV DNA整合）［16-17］ ，隨著宿主針對HBV免疫應(yīng)答的激活，免疫反應(yīng)傾向于靶向產(chǎn)生HBV聚合酶和HBeAg的肝細胞［18-19］ ，這些HBV蛋白主要由cccDNA產(chǎn)生，而非整合形式的HBV DNA產(chǎn)生，因此宿主免疫主要靶向cccDNA轉(zhuǎn)錄活躍復(fù)制的肝細胞，這就導(dǎo)致含有cccDNA的感染肝細胞死亡，而含有HBV DNA整合的肝細胞出現(xiàn)選擇性克隆擴增（圖1）［20］ 。同時，由于以微小染色體形式存在的cccDNA缺乏著絲粒，HBV感染的肝細胞可在有絲分裂過程中產(chǎn)生未受感染的子代細胞，導(dǎo)致殘存感染肝細胞中cccDNA池被稀釋，而整合在宿主基因組中的HBV DNA會隨著有絲分裂傳給子代肝細胞，從而導(dǎo)致HBV DNA整合得以保留。值得注意的是，子代肝細胞亦可發(fā)生新的感染，從而引發(fā)新的整合事件。這種清除、克隆擴增和再感染的循環(huán)會持續(xù)下去，導(dǎo)致血清病毒載量的波動，但HBsAg的波動幅度較小。這主要是因為HBV DNA整合來源的HBsAg占比會隨著含有HBV DNA整合的肝細胞比例的增加而增加，特別是在HBeAg陰性的CHB患者中，HBV DNA整合成為HBsAg的主要來源［21-23］。

血清中的HBV顆粒主要包含Dane顆粒、小球形顆粒和管型顆粒，以上這些病毒顆粒中HBsAg的主要成分是小HBsAg，中HBsAg僅占10%左右。管型顆粒和Dane顆粒含有約 25% 的大 HBsAg［24］ 。無論是大 HBsAg、中HBsAg及小HBsAg，其都含有“a”決定簇，血清HBsAg的檢測試劑主要針對“a”決定簇設(shè)計。目前 ARCHITECTAlinityi HBsAg 檢測（雅培實驗室）和 Elecsys HBsAg ⅡQuant 檢測（羅氏診斷）在臨床上被廣泛使用，兩者的定量 HBsAg 結(jié)果均以 IU/mL 為單位。雖然 ArchitectHBsAg 和 Elecsys HBsAg Ⅱ均以 0. 05 IU/mL 為判定界值，但二者靈敏度并不相同［25］ 。亦有研究提示，血清HBsAglt;0. 05 IU/mL并不能完全代表HBsAg清除［26-27］。

近期，有學(xué)者在一項包含36例患者的回顧性臨床研究中提出，雖然患者停止抗病毒治療時血清HBsAg低于0. 05 IU/mL，但仍有極低滴度的血清 HBsAg（0. 005 2～0. 05 IU/mL），這部分極低滴度 HBsAg 陽性的人群中62. 5%的患者在后續(xù)24周的隨訪中出現(xiàn)血清HBsAg復(fù)陽［27］。有研究提示，在傳統(tǒng)方法血清HBsAg檢測為陰性但HBV DNA為陽性的200名獻血員中使用高敏HBsAg檢測，其中5%仍被判定為陽性［28］ 。采用高敏HBsAg檢測法（檢測限為0. 005 2 IU/mL）可使得隱匿性HBV感染者的檢測率提高5%～7%。同時，高敏HBsAg檢測法在急性HBV感染中可以更早地檢測出血清HBsAg，這提示高敏 HBsAg 檢測在后續(xù)判定 CHB 功能性治愈及明確HBV 復(fù)發(fā)中可能起到重要作用［28］ 。除了檢測下限為0. 005 2 IU/mL 的高敏血清 HBsAg 檢測，超高靈敏定量HBsAg檢測試劑也被開發(fā)，其檢測下限為0. 000 5 IU/mL，較常規(guī)HBsAg檢測試劑檢測下限低100倍，除了檢測血清游離 HBsAg蛋白外，還能解離 HBsAg-抗 HBs免疫復(fù)合物，從而表現(xiàn)出更高的靈敏度；既往研究提示，在22例發(fā)生 HBV再激活的患者中，有 17例（77. 3%）可以通過超高靈敏HBsAg檢測確定基線血清HBsAg陽性［29］。

目前，CHB 功能性治愈治療終點中普遍接受將HBsAg檢測下限設(shè)置為 0. 05 IU/mL。針對臨床治療終點血清HBsAg檢測是否應(yīng)該使用更加靈敏的方法仍存在爭議［27，30］，未來需要進一步前瞻性多中心臨床隊列研究驗證高敏HBsAg檢測在功能性治愈終點中的評判效能。除了關(guān)注HBsAg檢測的靈敏度，仍需關(guān)注停止抗病毒治療后HBsAg低于檢測下限的維持時間（≥24周）及患者既往是否使用IFN鞏固治療等。既往研究提示，宿主免疫的恢復(fù)（高水平抗-HBs）和12～24周的PEG-IFN鞏固治療與血清 HBsAg 持續(xù)陰轉(zhuǎn)密切相關(guān)［4-5］ 。另一方面，肝臟中微量轉(zhuǎn)錄活化的cccDNA可導(dǎo)致患者持續(xù)暴露于微量HBsAg，這部分患者仍有發(fā)生肝硬化、肝癌及HBV復(fù)發(fā)再激活的風(fēng)險［31］ 。同時，HBV DNA整合來源的HBsAg更易潴留于肝細胞內(nèi)，未來需要進一步評估是否有必要將血清HBsAg與肝內(nèi)HBsAg檢測結(jié)合，以評判肝內(nèi)HBsAg清除情況。

當(dāng)HBsAg的“a”決定簇突變時會影響HBsAg的檢測效能［32-34］ 。如果AA141～145表位突變，則部分血清HBsAg檢測試劑無法識別HBsAg，臨床上會出現(xiàn)HBsAg檢測結(jié)果為陰性，但血清和/或肝臟中仍存在HBV DNA［31］ 。新的HBsAg定量測定已經(jīng)納入了一些經(jīng)典的AA突變對檢測結(jié)果的影響，如sK122I、sI126S和sG145R［35］ 。不同的HBsAg檢測試劑在靈敏度及檢測HBsAg突變時仍存在一定差異［36-37］ 。T123A 突變在 Architect 測定中定量不足，而 sP142L、sP142S 和 sG145K 突變在 Elecsys HBsAgⅡ Quant檢測中的結(jié)果低于Architect［36］ ，提示目前普遍使用的HBsAg檢測試劑在檢測HBsAg突變時存在一定差異。同時有研究報道，C、F和H基因型HBV的HBsAg蛋白中存在L110I突變，可損害HBsAg的抗原性，從而影響HBsAg的檢測，致使部分試劑在C基因型中的定量結(jié)果比預(yù)期值低［25］。除了HBsAg的突變影響檢測以外，血清HBsAg-抗HBs循環(huán)免疫復(fù)合物的形成也是HBsAg檢測為“陰性”的一個重要原因，但目前的Architect檢測和Elecsys HBsAg Ⅱ Quant 中均未加入上述“釋放”HBsAg-抗HBs循環(huán)免疫復(fù)合物中微量HBsAg的步驟［26，38］ ，未來可能需要進一步優(yōu)化試劑并進行深入研究。

1. 2 血清HBsAg成分 除了HBsAg總量的變化可以預(yù)測血清HBsAg清除外，血清HBsAg的成分變化亦與CHB功能性治愈密切相關(guān)。既往研究報道，血清HBsAg成分的比例在急性和慢性HBV感染的不同階段中并不相同，高水平的中 HBsAg 與 HBV 感染的高復(fù)制狀態(tài)密切相關(guān)［39］。多項研究提出，基線、12周時大HBsAg和中HBsAg水平可以預(yù)測非活動性HBsAg攜帶者使用PEG-IFN治療的血清HBsAg清除情況，并且預(yù)測值高于總HBsAg檢測［40-41］ 。在NAs治療達HBsAg清除的患者中發(fā)現(xiàn)NAs治療第6個月時中HBsAg檢測不到，這種中HBsAg清除發(fā)生在總HBsAg清除前（12. 8±8. 7）個月，中HBsAg比例變化是 NAs治療后達 HBsAg清除的早期預(yù)測因子［41］ 但HBsAg成分定量的大多數(shù)研究缺乏關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)品使用的信息，因此很難獲得可比較的結(jié)果［42］。未來的HBsAg成分研究需要納入對標(biāo)準(zhǔn)品的描述，進一步明確其臨床預(yù)測價值。

1. 3 血清HBV DNA檢測下限 既往研究提示，采用普通方法檢測HBV DNA結(jié)果為陰性（lt;500 IU/mL）的標(biāo)本，使用高靈敏度的HBV DNA檢測（檢測下限為10 IU/mL，低于10 IU/mL為陰性），其中63. 8%的標(biāo)本被判斷為陽性［43］ 。以上結(jié)果提示，隨著血清HBV DNA檢測下限越來越低，基于既往試劑檢測結(jié)果定義的CHB功能性治愈在使用更靈敏的檢測方法時可能會被歸為未治愈范疇。目前國際指南建議將 CHB 功能性治愈中的血清 HBVDNA陰性設(shè)置為低于檢測下限，即lt;10 IU/mL的水平［8］ 。為了更好地定義 CHB 功能性治愈并排除間歇性 HBVDNA檢測陽性，建議至少間隔24周檢測血清HBV DNA持續(xù)低于檢測下限。目前，部分HBV DNA定量檢測試劑靈敏度可達到 5 IU/mL，未來是否需要更加靈敏的HBV DNA檢測試劑來定義CHB功能性治愈需要進一步深入探索［44］。

1. 4 乙型肝炎核心相關(guān)抗原（HBcrAg）及前基因組RNA（pgRNA） HBcrAg是一種新型血清標(biāo)志物，由HBcAg、HBeAg和22 kD的前核蛋白（p22cr）組成。HBcrAg與傳統(tǒng)預(yù)測指標(biāo) HBsAg 及 ALT 相比，其預(yù)測 PEG-IFN 誘導(dǎo)的HBsAg清除的價值主要在于其可反應(yīng)cccDNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制情況。同時有研究指出，停止抗病毒治療時血清HBcrAglt;4 log 10 U/mL可識別可能實現(xiàn)持久CHB功能性治愈的應(yīng)答者［6］。隨著HBcrAg檢測靈敏度的提高，HBcrAg有望成為CHB 患者治療監(jiān)測和預(yù)后判斷的重要血清學(xué)標(biāo)志物之一［45］。

在隱匿性HBV感染合并HCC患者的癌旁組織中亦能發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)cccDNA及pgRNA，提示即使在HBV DNA低于檢測下限、甚至血清HBsAg轉(zhuǎn)陰后肝內(nèi)HBV RNA仍可存在［46］ 。前期研究亦發(fā)現(xiàn)，部分血清HBsAg陰性的患者肝內(nèi)HBV RNA及HBsAg陽性，但其血清HBV RNA低于檢測下限，提示目前的血清HBV RNA檢測靈敏度尚不能準(zhǔn)確反映肝內(nèi)cccDNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制狀態(tài)［47］ ，可能需要優(yōu)化引物設(shè)計及提高靈敏度等，未來需大樣本的前瞻性研究進一步闡明其臨床診斷價值及意義。

2 肝內(nèi)HBV標(biāo)志物

HBV為嗜肝病毒，肝內(nèi)HBV標(biāo)志物較血清HBV標(biāo)志物更能反映CHB功能性治愈患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險及預(yù)后。HBV的復(fù)制模板為肝內(nèi)cccDNA，但在HBV復(fù)制的過程中可產(chǎn)生副產(chǎn)物 — —雙鏈線性 HBV DNA，其可整合入宿主基因組中。HBV DNA整合可以導(dǎo)致插入突變、染色體不穩(wěn)定等，同時HBV DNA整合可插入多種癌癥通路相關(guān)宿主基因中，與HCC發(fā)生密切相關(guān)［17］ 。值得注意的是，在患者達到功能性治愈血清HBsAg清除后，肝內(nèi)的 cccDNA、HBV RNA、HBV DNA整合及其嵌合轉(zhuǎn)錄本水平明顯低于CHB未治愈患者，可能與血清HBsAg清除后患者的肝癌發(fā)生風(fēng)險降低密切相關(guān)［47-48］ 。同時，有31. 9%的血清HBsAg清除患者肝內(nèi)cccDNA低于檢測下限，可以認為這些患者已接近徹底治愈，可能與 PEG-IFN通過免疫調(diào)節(jié)作用介導(dǎo)HBV感染的肝細胞破壞及cccDNA池稀釋相關(guān)［47］。有研究報道，使用更加靈敏的數(shù)字液滴PCR方法檢測cccDNA，發(fā)現(xiàn)CHB功能性治愈患者肝內(nèi)cccDNA水平低于CHB患者50倍［49］ 。然而，部分血清HBsAg清除的患者肝內(nèi)仍可檢測到HBV RNA，提示肝內(nèi)仍有微量轉(zhuǎn)錄活化的HBV DNA整合和/或cccDNA［47］ 。同時，部分血清HBsAg清除患者肝內(nèi)的HBV RNA低于檢測下限，肝組織測序亦未檢測到HBV DNA整合來源的嵌合轉(zhuǎn)錄本，這預(yù)示著肝內(nèi)HBV可處于轉(zhuǎn)錄靜默狀態(tài)。需要關(guān)注在CHB功能性治愈患者中有兩種完全不同的肝內(nèi)HBV轉(zhuǎn)錄模式，即持續(xù)微量轉(zhuǎn)錄活化及轉(zhuǎn)錄靜默，二者后續(xù)的預(yù)后及復(fù)發(fā)風(fēng)險是否會不同，需要未來進一步深入研究。

研究［47］ 發(fā)現(xiàn)，盡管患者血清HBsAglt;0. 05 IU/mL，但25%的患者肝內(nèi)仍可殘存HBsAg，由此需考慮肝內(nèi)HBsAg的來源并評估其與HBV復(fù)發(fā)的相關(guān)性。通過研究發(fā)現(xiàn)，這部分殘余的HBsAg主要來自活化轉(zhuǎn)錄的HBV DNA整合，少部分來源于微量轉(zhuǎn)錄活化的cccDNA。這種微量活化轉(zhuǎn)錄的 cccDNA 與患者隨訪過程中 HBV再激活密切相關(guān)，提示目前的 CHB 功能性治愈定義中的血清HBsAglt;0. 05 IU/mL并不能完全代表血清及肝內(nèi)的HBsAg清除，需要關(guān)注血清-肝內(nèi)HBsAg檢測差異機制，這對臨床決定停止抗病毒治療時機有著重要意義。這種血清-肝內(nèi)HBsAg差異機制可能由三種原因所致：（1）目前血清HBsAg檢測試劑的靈敏度不夠，既往報道如果使用檢測下限為0. 005 2 IU/mL的血清HBsAg檢測試劑，90. 9%的血清HBsAg復(fù)陽患者（24周隨訪）在停止PEG-IFN治療時仍被判定為陽性（gt;0. 005 2 IU/mL），提示部分血清HBsAglt;0. 05 IU/mL的患者停止PEG-IFN治療時，其血清HBsAg 并未完全清除，肝內(nèi)可能仍有微量轉(zhuǎn)錄活化的cccDNA及HBV DNA整合［27］。 （2）血清及肝內(nèi)存在不同類型的HBsAg： HBV DNA整合表達的HBsAg分泌效率顯著低于cccDNA，可出現(xiàn)肝細胞內(nèi)潴留，同時部分HBV突變同樣會影響HBsAg分泌［50-51］ 。（3）血清中存在HBsAg-抗HBs循環(huán)免疫復(fù)合物遮蔽了HBsAg檢測位點：既往有研究在血清HBsAg陰性而HBeAg陽性的樣本中發(fā)現(xiàn)其中70%的樣本存在HBsAg-抗HBs循環(huán)免疫復(fù)合物，其為血清HBsAg檢測結(jié)果為“陰性”的一個重要原因［26］ 。以上結(jié)果提示，目前的血清 HBsAglt;0. 05 IU/mL并不能完全反映血清HBsAg清除。同時有研究指出，在AAV-HBV小鼠模型中清除血液中的HBsAg并不能改善HBV特異性T淋巴細胞免疫，清除肝臟內(nèi)的HBsAg才能打破HBV的免疫耐受［52-53］ ，這提示需要同時關(guān)注血清和肝內(nèi)HBsAg的檢測［22-23］。

3 完全治愈面臨的挑戰(zhàn)

3. 1 cccDNA的穩(wěn)定持續(xù)存在 cccDNA以微小染色體的形式穩(wěn)定存在于宿主細胞核內(nèi)，是病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄模板，其受到核膜的保護，難以被藥物或免疫因子直接影響。一方面，早期的研究普遍認為cccDNA的半衰期非常長，臨床研究模型推算發(fā)現(xiàn)NAs治療后HBV cccDNA清除期約為14. 5年［54］ ，另有研究亦提示NAs治療患者血清HBsAg清除的中位時間為52. 2年［55］ ，以上研究均提示患者可能需要長期口服NAs抗病毒治療。另一方面，雖然以拉米夫定耐藥位點作為特異性標(biāo)記的研究發(fā)現(xiàn)cccDNA的半衰期約為6個月［56］ ，但臨床中約有20%的接受規(guī)范NAs治療的患者其血清中仍存在低水平的HBV DNA，提示NAs競爭性抑制HBV DNA復(fù)制具有一定局限性，不能完全阻斷cccDNA池的補充［57］ ?，F(xiàn)有的NAs及PEG-IFN都不能直接清除cccDNA，目前針對HBV的治療手段仍具有一定局限性。雖然既往文獻報道肝細胞有絲分裂可導(dǎo)致殘存感染肝細胞中cccDNA池被稀釋，然而，HBV cccDNA在少數(shù)非增殖人肝細胞中持續(xù)存在，這些殘存的cccDNA是后期病毒學(xué)標(biāo)志物再次反彈的重要原因［58］ 。同時，低轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)的cccDNA更難被抗病毒藥物可及，治療難度增加［59］ 。因此，未來不僅需要研發(fā)阻斷cccDNA池補充的抗病毒藥物，也需要對直接靶向清除cccDNA進行藥物研發(fā)。

3. 2 宿主針對 HBV清除的免疫無法恢復(fù) 慢性 HBV感染可使宿主適應(yīng)性免疫及天然免疫反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)受損。

HBV除了可引起宿主T淋巴細胞耗竭外還影響固有免疫反應(yīng)，特別是樹突狀細胞和巨噬細胞的抗原呈遞功能障礙，損害了固有免疫和適應(yīng)性免疫的連接橋梁［60-62］ 。既往研究發(fā)現(xiàn)，HBV抑制單核細胞向M1-MDM（M1-單核細胞來源的肝內(nèi)巨噬細胞）分化，且增強了M2-MDM（M2-單核細胞來源的肝內(nèi)巨噬細胞）的激活，從而增強肝臟免疫耐受狀態(tài)；同時，HBV感染期間IL-10表達上調(diào)會損害淋巴細胞功能，亦影響HBV清除［63］ 。在慢性HBV感染患者中亦發(fā)現(xiàn)NK細胞免疫耐受及HBV特異性CD4 + 和CD8 + T淋巴細胞不能充分響應(yīng)，同時HBsAg特異性B淋巴細胞存在成熟缺陷。以上均為慢性HBV感染持續(xù)存在的重要因素［62］。

3. 3 宿主遺傳因素影響藥物應(yīng)答 不同CHB患者對抗病毒治療的反應(yīng)存在差異，影響治療效果。目前有多項研究提示宿主遺傳因素對CHB患者的抗病毒應(yīng)答發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，位于 1 號染色體的 TP53BP2（rs7519753）與PEG-IFN治療后CHB患者的HBsAg清除有關(guān)。SNP rs7519753的C等位基因利于TP53BP2在肝臟中的高表達，TP53BP2 能夠增強 IFN-α 的抗病毒作用［64］ 。同時亦有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，STAT4（rs7574865）突變體與PEG-IFN治療患者的血清HBsAg清除之間存在顯著相關(guān)性。在B基因型HBV感染患者中，rs7574865 TT患者中有7. 7%的HBsAg清除，而NAs治療的患者中rs7574865基因型與血清HBsAg清除無關(guān)［65］ 。以上研究提示宿主的遺傳因素在PEG-IFN治療中發(fā)揮重要作用，未來可通過檢測 rs7519753和 rs7574865的基因型來有效識別易于實現(xiàn)功能性治愈的CHB患者，實現(xiàn)個體化治療，提高治療成功率。

4 針對cccDNA的抗病毒治療

現(xiàn)有的NAs及PEG-IFN可以抑制病毒復(fù)制，但對于清除 cccDNA 并無有效作用。cccDNA 可通過細胞內(nèi)循環(huán)和細胞外循環(huán)兩種途徑進行補充。含有rcDNA的核衣殼可轉(zhuǎn)運至細胞核以細胞內(nèi)循環(huán)補充cccDNA池。同時，新合成的HBV DNA病毒顆粒亦可進入感染肝細胞內(nèi)，脫去外膜的rcDNA進入細胞核內(nèi)，形成cccDNA外循環(huán)補充。既往體內(nèi)實驗報道，cccDNA主要來自細胞內(nèi)循環(huán)，特別是來自新合成的病毒核衣殼補充，以維持cccDNA池［66-67］ 。衣殼組裝調(diào)節(jié)劑或抑制劑可以通過阻斷核衣殼形成從而抑制HBV復(fù)制，阻礙cccDNA內(nèi)循環(huán)補充，如ABI-H0731 和 RO7049389 可顯著減少 HBV DNA 和 HBVRNA［68-69］ 。同時，針對HBV通過鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白進入感染肝細胞的細胞外循環(huán)過程，Myrcludex-B可與病毒Pre-S1基序競爭鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運蛋白結(jié)合，從而阻斷HBV感染［70］ 。除了阻斷cccDNA的補充以外，最直接的抗 cccDNA 策略是特異性降解 cccDNA。近期有研究報道，口服小分子cccDNA抑制劑ccc_R08可有效降低cccDNA水平，而對線粒體DNA無明顯影響［71］。目前，基于CRISPR/Cas9的基因組編輯技術(shù)不僅能破壞HBV cccDNA，還能切割整合的HBV DNA，但該技術(shù)有誘導(dǎo)宿主基因組不穩(wěn)定和癌變的風(fēng)險［72］。除此以外，cccDNA的表觀遺傳修飾環(huán)節(jié)亦可調(diào)節(jié)沉默病毒基因轉(zhuǎn)錄，包括作用于cccDNA相關(guān)組蛋白的乙?；图谆^程。除了上述非溶細胞效應(yīng)相關(guān)的cccDNA清除外，亦可通過增強宿主免疫功能從而清除cccDNA，如Toll樣受體激動劑和程序性死亡受體1阻斷劑等。將阻斷HBV復(fù)制過程的抗病毒藥物與宿主免疫增強劑結(jié)合可增強抗病毒效應(yīng)，是未來抗病毒治療趨勢［73］。

5 HBsAglt;100 IU/mL是CHB功能性治愈的替代治療結(jié)局嗎？

相較于血清HBsAg清除的患者，在臨床中有許多患者經(jīng)過抗病毒治療后HBsAg下降并維持在低水平，但目前國際上針對血清HBsAglt;100 IU/mL的CHB患者繼續(xù)抗病毒治療追求血清HBsAg清除是否有更多臨床獲益存在爭論。血清HBsAglt;100 IU/mL的CHB患者發(fā)生肝硬化的累積風(fēng)險為4. 8%，發(fā)生HCC的累積風(fēng)險為1. 4%［74］ 。有研究［74］報道，血清HBsAg水平在100～999 IU/mL組的患者相較于血清HBsAglt;100 IU/mL組患者，發(fā)生肝硬化及HCC的風(fēng)險比分別為1. 68和2. 20；而在另一項針對HBeAg陰性患者的研究［75］ 中，HBsAg水平在100～999 IU/mL組與HBsAglt;100 IU/mL組之間的HCC發(fā)生率并無差異。針對HBsAglt;100 IU/mL CHB患者的肝硬化及肝癌發(fā)生風(fēng)險評估，未來需要前瞻性多中心研究進一步探索。前文已述HBV基因型、HBV DNA整合及HBsAg突變等可影響血清HBsAg分泌［27，32，47，50］ ，筆者團隊建議在分析血清 HBsAg水平與HCC的風(fēng)險時，需要納入上述因素對HBsAg分泌能力的影響，從而更加清晰地明確血清HBsAg水平分層與HCC發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。

血清HBsAglt;100 IU/mL但HBV DNAgt;10 4 拷貝/mL的患者 HCC 發(fā)生風(fēng)險較 HBsAglt;100 IU/mL 且 HBV DNAlt;10 4 拷貝/mL患者增加 1. 42倍，二者肝硬化發(fā)生風(fēng)險無統(tǒng)計學(xué)意義［74］ ，提示HBV DNA水平與低HBsAg水平人群發(fā)生HCC密切相關(guān)。有研究提示，雖然患者經(jīng)抗病毒治療后血清HBsAg水平下降，但是中HBsAg水平的增加與HBV驅(qū)動的HCC密切相關(guān)［76］ ，因此不建議僅關(guān)注血清HBsAg總量的變化，需要考慮HBsAg成分的變化，未來HBsAg成分檢測的臨床價值值得進一步研究。綜上所述，血清HBsAglt;100 IU/mL的患者仍有發(fā)生肝癌及肝硬化的風(fēng)險，需要結(jié)合HBV DNA載量、是否合并肝硬化及 HBsAg 組成成分的變化等進行判斷，同時需要考慮HBeAg、HBV基因型對于肝硬化及HCC發(fā)生的影響。

一方面，有研究報道較低的血清HBsAg水平與停止NAs治療后血清HBsAg清除相關(guān)，特別是在血清HBsAglt;100 IU/mL和/或HBcrAg低于檢測下限的非亞裔患者中，同時HBV基因型亦會影響其血清HBsAg清除率［77］。值得注意的是停止NAs治療的相關(guān)研究異質(zhì)性較大，薈萃分析提示停止NAs治療的患者中發(fā)生嚴重肝炎發(fā)作或肝功能失代償?shù)幕颊弑壤s為1. 21%，肝炎發(fā)作相關(guān)死亡或肝移植患者的比例約為0. 37%。未來針對NAs停藥安全性仍需進行多中心的前瞻性研究，并有充足的隨訪時間和明確的研究結(jié)局定義［78］。另一方面，血清HBsAglt;100 IU/mL的患者接受PEG-IFN治療后的HBsAg清除率可達81. 1%，提示低血清HBsAg水平患者容易獲得HBsAg清除［79］。對于血清HBsAglt;100 IU/mL的患者接受NAs或PEG-IFN治療后的臨床獲益情況，未來需要在前瞻性臨床研究中進一步探索，明確抗病毒治療后和未抗病毒治療組血清HBsAglt;100 IU/mL的患者肝癌及肝硬化等發(fā)生率有無差異，以揭示此類患者經(jīng)過抗病毒治療后是否有臨床獲益。

6 展望

CHB功能性治愈仍然是目前的理想治療終點，隨著研究的不斷深入，CHB功能性治愈患者部分可能已經(jīng)達到cccDNA低于檢測下限，但由于cccDNA和HBV DNA整合位于細胞核內(nèi)很難清除，目前的抗病毒治療方案仍較難達到CHB完全治愈。

目前，針對cccDNA及HBV DNA整合的新藥研發(fā)仍在進行中，siRNA和反義RNA可以通過結(jié)合cccDNA與HBV DNA整合來源的靶mRNA，靶向HBV RNA轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而沉默其表達。同時，基因編輯技術(shù)針對清除cccDNA及整合HBV DNA亦有一定前景。隨著更高靈敏的CHB功能性治愈血清學(xué)標(biāo)志物的開發(fā)及更加有效的抗病毒治療策略的產(chǎn)生，相信，對于CHB可以無限趨近于完全治愈。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明： 高娜負責(zé)文章撰寫；高志良負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)文章撰寫，修改論文并最后定稿。

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收稿日期：2024-10-17；錄用日期：2024-11-29

本文編輯：劉曉紅