小鼠股動脈結(jié)扎誘導下肢缺血后骨質(zhì)疏松癥的動物模型構(gòu)建與評價

摘要：本研究旨在建立與評價小鼠股動脈結(jié)扎誘導下肢缺血后骨質(zhì)疏松癥的動物模型。7周齡C57BL/6J雄性小鼠按每組10只隨機分為造模組和對照組。在股動脈主干近端進行雙重結(jié)扎小鼠作為造模組；僅切開皮膚小鼠作為對照組。術(shù)后，分別比較小鼠下肢血流、小鼠行為學和小鼠骨量的變化。本研究結(jié)果表明成功構(gòu)建小鼠股動脈結(jié)扎誘導下肢缺血后骨質(zhì)疏松癥模型，該模型骨丟失較明顯。

關(guān)鍵詞：股動脈結(jié)扎；缺血；骨質(zhì)疏松癥；動物模型

意外事故所致骨損傷逐年上升，由此而開展的骨折、截骨術(shù)也越來越普遍。各種原因引起的血管系統(tǒng)損傷難以恢復或不完全恢復。血管功能的異常破壞，引起血流供應減少導致骨骼中傷口及其周圍區(qū)域內(nèi)血氧供給長期降低（氧分壓范圍為0至10 mmHg）[1]。隨著全球人口老齡化的加劇，創(chuàng)傷性外傷和骨折等事件發(fā)生率顯著增加。長期活動受限使得下肢局部組織血液供應不足，氣體交換失衡，最終導致骨組織局部缺氧。血管附近的成骨細胞和破骨細胞相互密切作用以保持骨量和結(jié)構(gòu)[2]。在缺氧條件下，破骨細胞會啟動一系列分子和生理上的適應性調(diào)整，以維持其生存和功能[3]。因此，靶向低氧環(huán)境下的破骨細胞生成研究可能是血管—骨偶聯(lián)的潛在方向。

目前，探究血供異常組織缺血缺氧導致骨質(zhì)疏松癥的動物模型尚無明確報道。為探究缺血缺氧后對局部組織骨量的影響，我們擬建立小鼠股動脈結(jié)扎誘導下肢缺血后骨質(zhì)疏松癥模型進行研究，對其活動能力、下肢骨量進行統(tǒng)計分析以評價本實驗模型的成功建立。

1 材料和方法

1.1 時間及地點

實驗于2024年4～6月在廣西醫(yī)科大學動物實驗中心完成。

1.2 材料

一 實驗動物 C57BL/6J小鼠20只，SPF級，7周齡，雄性，體重18±2 g。隨機分組，5只/籠，12 h的光照與12 h的黑暗交替周期，自由采食飲水。實驗操作嚴格遵循實驗動物倫理標準，并經(jīng)廣西醫(yī)科大學實驗動物管理委員會、實驗動物倫理委員會批準。實驗動物購自廣西醫(yī)科大學動物實驗中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號為 SYXK（桂）2020-0004。實驗倫理編號（NO.202403013）。

二 主要儀器設備 Micro-CT skyscan1170（美國Bruker公司）；激光散斑血流成像儀（中國深圳瑞沃德公司）；顯微手術(shù)器械（重慶奧特光學儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

一 實驗分組：20只小鼠適應性喂養(yǎng)7 d后按照隨機數(shù)字表法分為左股動脈結(jié)扎組和對照組，每組10只。

二 模型制備：所有實驗小鼠在造模前12 h禁食、不禁水。

第一，左股動脈結(jié)扎組：腹腔注射1.25% 阿佛丁（0.2 mL/10 g），待小鼠進入麻醉狀態(tài)后，小鼠左側(cè)下肢剃毛，仰臥體位固定于手術(shù)臺，碘伏酒精消毒待開創(chuàng)皮膚，縱向于大腿內(nèi)側(cè)腹股溝部做一長約1.0 cm切口，暴露內(nèi)側(cè)肌肉，鈍性分離股動脈，自股動脈主干近端起進行雙重結(jié)扎，后將兩個結(jié)扎點中間血管離斷。最后，使用5-0縫合線縫合筋膜層和皮膚層。小鼠右側(cè)下肢則切口后縫合。

第二，對照組：小鼠雙側(cè)下肢切口后縫合。

三 激光散斑血流成像儀觀察術(shù)后小鼠下肢血流量變化

術(shù)后第0、7、14天對造模組小鼠進行下肢血流檢測，造模組小鼠進行麻醉，雙下肢剃毛，碘伏酒精消毒，使用激光散斑血流成像儀檢測雙側(cè)下肢血流信號，掃描記錄5 s內(nèi)雙側(cè)下肢血流灌注（perfusion unite，PU）值。比較造模組小鼠左側(cè)與右側(cè)下肢的PU值。

四 術(shù)后小鼠行為學觀察與評估

待小鼠適應環(huán)境后，每次將小鼠取出置于另一空籠中，手部輕敲鼠籠的一側(cè)產(chǎn)生聲響與震動，觀察小鼠活動能力和狀態(tài)，對兩組小鼠的反應能力及活動范圍進行綜合評估。觀察記錄人員按照表1的準則進行小鼠活動能力簡易標準化評定。以下計分以2人計分的平均值作為分析數(shù)據(jù)。

五 Micro-CT掃描觀察小鼠術(shù)后脛骨骨量變化

兩組小鼠在術(shù)后第28天時，用1.25% 阿佛?。?.2mL/10克）腹腔注射麻醉，采取頸椎脫臼法處死。使用CT儀（Bruker Skyscan）對小鼠脛骨進行掃描，掃描參數(shù)為：旋轉(zhuǎn)步長0.4，電壓50 kV，像素尺寸9μm，0.5mm鋁制濾波器，源電流500μA。掃描完成后通過利用CTAn和CTVoL軟件對掃描數(shù)據(jù)進行三維建模分析。選取脛骨遠端生長板上方1～1.5mm骨小梁作為感興趣區(qū)域進行分析。我們對骨小梁體積/組織體積（Trabecular Volume/Tissue Volume， BV/TV），骨小梁厚度（Trabecular thickness， Tb.Th），骨小梁數(shù)量（Trabecular Number， Tb.N）和骨小梁分離度（Trabecular Separation， Tb.Sp）進行了計算。

六 石蠟切片HE染色觀察兩組小鼠骨量變化

處死小鼠后，我們制作了小鼠的石蠟切片，染色前先進行脫蠟。將切片用蠟筆畫圈后加入蒸餾水水合切片。吸出蒸餾水加入蘇木素染液5 min，蒸餾水漂洗切片，放入分化液分化30 s，漂洗切片。放入伊紅Y染色30 s。染色完成后脫水封片。顯微鏡獲取圖片。

1.4 統(tǒng)計學處理

使用Prism Software 9.5 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及量化繪圖。統(tǒng)計方法選用獨立樣本t檢驗。所有實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。P值為＜0.05被認為是有統(tǒng)計學上的顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物數(shù)量分析

參與動物實驗的20只小鼠均未死亡，全部進入實驗數(shù)據(jù)分析。

2.2 股動脈結(jié)扎誘導下肢缺血（FAL）小鼠模型的成功構(gòu)建

研究期間，我們運用激光散斑血流成像儀檢測左股動脈結(jié)扎組小鼠雙側(cè)下肢血流變化情況，術(shù)后，造模組小鼠左側(cè)結(jié)扎下肢血流信號明顯弱于右側(cè)下肢血流信號，左側(cè)下肢血管離斷明顯（圖1A）；左側(cè)下肢PU值（圖1B）顯著低于右側(cè)下肢PU值。同樣地，術(shù)后第7、14天左側(cè)下肢PU值（圖1C、D）明顯低于右側(cè)下肢PU值?；谝陨蠈嶒灧治觯覀冋J為成功構(gòu)建了FAL小鼠模型。

A：激光多普勒成像檢測造模組小鼠雙下肢血流變化情況；B-D：造模組小鼠第0、7、14天下肢血流灌注量統(tǒng)計。

2.3 術(shù)后兩組小鼠行為學變化

造模組小鼠術(shù)后行為學表現(xiàn)為步態(tài)紊亂、跛行、舔舐左側(cè)下肢及手術(shù)切口、左側(cè)下肢出現(xiàn)懸掛、活動減少等，且術(shù)后的活動能力均隨時間延長而逐漸增強。FAL組小鼠的步態(tài)與活動能力于術(shù)后第11天基本恢復正常水平，于術(shù)后第14天完全恢復對照組小鼠活動水平（圖2）。

2.4 FAL小鼠發(fā)生骨丟失

為了評估FAL小鼠骨微結(jié)構(gòu)的變化，我們使用Micro-CT掃描小鼠脛骨并分析了脛骨遠端，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAL小鼠與對照組相比出現(xiàn)明顯的骨丟失和骨微結(jié)構(gòu)的改變；如（圖3A）所示。骨參數(shù)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學定量分析結(jié)果與Micro-CT結(jié)果一致，與對照組相比，F(xiàn)AL組BV/TV（圖3B），Tb.N（圖3C）出現(xiàn)明顯下降，Tb.Th（圖3D）沒有顯著的變化趨勢，Tb.Sp（圖3E）明顯升高。這些結(jié)果都表明FAL小鼠發(fā)生了骨丟失。

A：兩組小鼠左側(cè)脛骨Micro-CT的代表性圖像；B-D：兩組小鼠骨微參數(shù)BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp定量分析（n=4）。

2.5 FAL小鼠發(fā)生骨丟失

同樣地對兩組小鼠骨組織進行了HE染色，與Micro-CT結(jié)果一致，造模組小鼠骨量明顯下降（圖4）。

A：兩組小鼠左側(cè)脛骨HE染色的代表性圖片（n=4 ）。

結(jié)語

血液供應不足導致骨組織細胞處于缺氧環(huán)境當中，缺氧是骨質(zhì)疏松癥和類風濕性關(guān)節(jié)炎這些疾病的常見特征。此外，已知與缺氧相關(guān)的許多因素，包括能量代謝的變化、酸堿平衡等都會影響骨代謝。缺氧導致線粒體能量產(chǎn)生不足和活性氧過多，從而損害線粒體功能，導致骨穩(wěn)態(tài)被破壞[4]。許多證據(jù)表明，缺氧誘導途徑在介導骨代謝變化中起著不可或缺的作用?；谙嚓P(guān)研究報道，我們猜想下肢血管損傷導致的局部組織缺血缺氧可能會導致骨質(zhì)疏松癥。

血管的再生是骨再生和骨代謝的一個研究熱點，但缺乏一種能有效模擬股動脈損傷后缺血所致骨質(zhì)疏松癥的標準化實驗動物模型[5]。目前，動脈結(jié)扎缺血模型常被用于心血管疾病研究，但對于血管損傷缺血導致骨質(zhì)疏松癥的研究鮮有報道[6]。對于下肢由于缺血缺氧導致骨丟失的研究中，尚沒有適宜的造模方法。因此，本研究致力于建立一個穩(wěn)定模擬下肢動脈血流受阻導致局部缺血缺氧的動物模型。常見的動物如兔、大鼠、小鼠、犬等常作為研究下肢缺血疾病的動物模型[7]。考慮到小鼠具有來源方便、成本低、飼養(yǎng)周期短等優(yōu)勢，因此以小鼠為下肢缺血誘導骨質(zhì)疏松癥的動物模型更占據(jù)優(yōu)勢[8]。本實驗選取C57BL/6J小鼠作為研究對象，通過股動脈結(jié)扎法造成血供異常、局部骨組織細胞缺血缺氧，成功建立了小鼠股動脈結(jié)扎骨質(zhì)疏松癥模型。

在本實驗，我們通過血流觀測分析在造模后小鼠的第0、7、14 d三個時間點，發(fā)現(xiàn)左側(cè)下肢的血流灌注量顯著低于右側(cè)下肢，這提示血管結(jié)扎成功。此外，行為學觀察與評估顯示，造模后小鼠的活動能力有所下降，但在14天后逐漸恢復至正常水平。通過影像學檢查和石蠟切片染色分析，我們觀察到造模組小鼠出現(xiàn)了明顯的骨量丟失，這一發(fā)現(xiàn)證實了我們的缺血后骨質(zhì)疏松癥模型構(gòu)建成功。這些結(jié)果表明，該模型能夠有效地模擬缺血缺氧骨質(zhì)疏松癥的病理過程，為研究其發(fā)病機制及評估治療效果提供了可靠的實驗基礎(chǔ)。這或許能為進一步研究血管損傷缺血導致骨質(zhì)疏松癥的臨床治療提供新見解、新思路?！?/p>

參考文獻：

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收稿日期：24-11-18

基金資助：國家自然科學基金項目（82460434），項目負責人：劉倩

作者簡介：王莉（2000—），女，研究生，研究方向：中草藥單體防治骨質(zhì)疏松癥疾病的研究。

通訊作者：劉倩。