基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探討槲皮素通過p53信號(hào)通路抗結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

摘要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和體外實(shí)驗(yàn)探討槲皮素通過p53信號(hào)通路抗結(jié)直腸癌的分子作用機(jī)制。借助TCMSP和GeneCards數(shù)據(jù)庫分別獲取槲皮素的藥物靶點(diǎn)和結(jié)直腸癌的疾病靶點(diǎn)，并通過Venn圖映射出藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn);借助String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape_v3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，同時(shí)進(jìn)行GO和KEGG富集分析、分子對(duì)接及核心靶點(diǎn)的表達(dá)量及生存分析；最后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性、細(xì)胞凋亡水平和細(xì)胞周期阻滯變化、用藥前后核心靶點(diǎn)及p53通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果提示AKT1、TP53為槲皮素抗結(jié)直腸癌的核心靶點(diǎn)；GO和KEGG分析篩選出槲皮素主要參與PI3K/Akt、p53信號(hào)通路；分子對(duì)接表明槲皮素與核心靶點(diǎn)AKT1、TP53具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，TP53既在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，又可影響結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素能抑制HCT-116細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該機(jī)制可能調(diào)控TP53、AKT1等核心靶點(diǎn)，激活p53信號(hào)通路，參與HCT-116細(xì)胞的增殖與凋亡，進(jìn)而起到抗結(jié)直腸癌的作用。

關(guān)鍵詞：槲皮素；結(jié)直腸癌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)：R288""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""" 文章編號(hào)：1002-4026（2025）01-0032-12

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

DOI：10.3976/j.issn.1002-4026.20240052【藥理與毒理】

收稿日期：2024-04-04

基金項(xiàng)目：上海申康醫(yī)院發(fā)展中心臨床三年行動(dòng)計(jì)劃資助項(xiàng)目（SHDC2020CR4049）；上海市進(jìn)一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動(dòng)計(jì)劃（2021LPTD-010）；第五批全國中醫(yī)臨床優(yōu)秀人才研修項(xiàng)目資助（國中醫(yī)藥人教函〔2022〕1號(hào)）

作者簡介：韓惠杰（1981—），男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合診治消化道腫瘤。E-mail：hanhuijie601@163.com

*通信作者，王松坡（1971—），男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療消化道疾病及腫瘤。E-mail：13386259791@163.com

A study based on network pharmacology and experimental verification exploring

the mechanism of quercetin against colorectal cancer

through the p53 signaling pathway

HAN Huijiea， LIU Huia，ZHAO Yongbob， WANG Songpoa*

（a.Department of TCM； b.Department of Neurology， Shanghai General Hospital， Shanghai 200080， China）

Abstract∶Based on network pharmacology， molecular docking， and in vitro experiments， this study explores the molecular mechanism of quercetin against colorectal cancer through the p53 signaling pathway. The drug targets quercetin， and the disease targets colorectal cancer， which was obtained via the Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform and Gene Cards database， respectively. The common drug and disease targets were mapped using a Venn diagram， and the protein-protein interaction network map was constructed with the help of the String database and Cytoscape_v3.7.2 software. At the same time， GO and KEGG enrichment analysis， molecular docking， core target expression， and survival analysis were also performed. Finally， cell proliferation activity， level of apoptosis， cell cycle arrest， and changes in the expression of core targets and key proteins of the p53 pathway were detected through cellular experiments. Network pharmacology suggests that AKT1 and TP53 are the core targets of quercetin against colorectal cancer， GO and KEGG analysis demonstrate that quercetin is mainly involved in the PI3K/Akt and p53 signaling pathways， molecular docking demonstrates that quercetin exhibits strong binding activity with the core targets AKT1 and TP53， and TP53 is found to be both highly expressed in colorectal cancerand also affect the survival and prognosis of patients with colorectal cancer. The results of cellular experiments show that quercetin can inhibit the proliferation of HCT-116 cells， induce G0/G1 cell-cycle arrest in HCT-116 cells， and promote apoptosis. This mechanism may regulate core targets such as TP53 and AKT1， activate the p53 signaling pathway， participate in the proliferation and apoptosis of HCT-116 cells， and thus function to resist colorectal cancer.

Key words∶quercetin; colorectal cancer; network pharmacology; molecular docking

據(jù)報(bào)道，2020年新發(fā)結(jié)直腸癌占新發(fā)惡性腫瘤的10%左右，其發(fā)病率在全球惡性腫瘤中位居第三位，死亡率躍居第二位，是臨床上常見的惡性消化道腫瘤之一［1］。結(jié)直腸癌具有高隱匿性，早期常無癥狀，而一旦出現(xiàn)便血、腹痛等典型癥狀，病程或已到中晚期，甚則出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［2］，并且結(jié)直腸癌還逐漸呈現(xiàn)出年輕化趨勢(shì)，已嚴(yán)重威脅社會(huì)發(fā)展及人民健康。結(jié)直腸癌的治療常采用手術(shù)、放化療、免疫或靶向等常規(guī)手段，但仍不能改變其高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特征［3］，并具有嚴(yán)重的毒副作用［4］，因此臨床尋找低毒高效的新型藥物成為防治結(jié)直腸癌及其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移研究的重中之重。

臨床和臨床前研究提示，植物化學(xué)物質(zhì)可通過抑制有絲分裂、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗癌活性［5］，因此，使用植物化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行抗腫瘤可以改善疾病的預(yù)后，并可能成為治療結(jié)直腸癌的新方法［6］。槲皮素是一種具有抗腫瘤作用的天然黃酮類化合物，其大多存在于多種水果、蔬菜、堅(jiān)果、花朵以及樹葉中［7］，在抗腫瘤方面具有顯著的作用。研究顯示［8-9］，槲皮素具有抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和促進(jìn)凋亡的作用，但其具體作用機(jī)制以及發(fā)揮關(guān)鍵作用的通路尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將網(wǎng)絡(luò)分析與系統(tǒng)藥理完美結(jié)合，通過檢索數(shù)據(jù)庫、分析高通量數(shù)據(jù)、模擬計(jì)算機(jī)等多種手段，構(gòu)建復(fù)雜的“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而分析藥物與靶點(diǎn)、通路、疾病之間相互作用的關(guān)系。分子對(duì)接技術(shù)是利用計(jì)算機(jī)的高精度對(duì)接模擬功能來評(píng)估蛋白與配體結(jié)合的潛在能力，使得發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)藥物靶點(diǎn)更快捷、更有效［10］。

本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)槲皮素抗結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)和信號(hào)通路，并使用分子對(duì)接技術(shù)評(píng)估槲皮素和核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性，最后通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為槲皮素抗結(jié)直腸癌的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料

1.1" 數(shù)據(jù)庫與軟件

TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），Swiss Target數(shù)據(jù)庫（https：//www.sib.swiss/），Swiss Target Prediction模塊（http：//www.swisstargetprediction.ch/），Uniprot數(shù)據(jù)庫http：//www.uniprot.org/），GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/），String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），Cytoscape_v3.7.2軟件（http：//www.cytoscape.org/），Bioconductor的R包（https：//www.r-project.org/），Pubchem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/），GEPIA數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn /index.html），TCGA數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）。

1.2" 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

HCT-116細(xì)胞株購于中科院細(xì)胞庫，存儲(chǔ)于-180 ℃液氮罐中。

1.3" 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

槲皮素購于上海源葉科技有限公司（批號(hào)B20527），胎牛血清購于美國Gibco公司（批號(hào)16000-044），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司（批號(hào)556420），RNAiso Plus、PrimeScriptTM RTMaster購于日本TAKARA公司（批號(hào)9109、RR036A），PVDF膜購于美國Millipore公司（批號(hào)IPVH00010），Bax抗體購于美國Proteintech公司（批號(hào)50599-2-Ig），Bcl-2抗體購于美國Abclonal公司（批號(hào)A19693），p53抗體購于武漢博士德生物工程有限公司（批號(hào)PB0076），Goat anti-rabbit IgG （H+L） -HRP二抗購于美國Jackson Immuno Research公司（批號(hào)111-035-003）。

1.4" 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo公司，型號(hào)MK3），流式細(xì)胞儀（美國BD公司，型號(hào)FACSCalibur），轉(zhuǎn)移電泳槽（上海天能科技有限公司，型號(hào)VE186）。

2" 方法

2.1" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

2.1.1" 槲皮素靶點(diǎn)收集

以“quercetin”為關(guān)鍵詞在TCMSP系統(tǒng)中檢索槲皮素對(duì)應(yīng)的蛋白作用靶點(diǎn)進(jìn)行匯總；從Pubmed數(shù)據(jù)庫下載槲皮素的分子結(jié)構(gòu)，再導(dǎo)入SwissTarget數(shù)據(jù)庫的Swiss Target Prediction模塊預(yù)測(cè)相關(guān)靶點(diǎn)；使用Uniprot數(shù)據(jù)庫去除重復(fù)靶點(diǎn)并添加基因縮寫。

2.1.2" 疾病靶點(diǎn)的收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索疾病關(guān)鍵詞“colorectal cancer”，收集“結(jié)直腸癌”的疾病靶點(diǎn)。

2.1.3" 共有靶點(diǎn)獲取

將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)通過VennDiagram軟件包映射出交集靶點(diǎn)，即槲皮素抗結(jié)直腸癌的潛在作用靶點(diǎn)，并輸出Venn圖。

2.1.4" PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建共有靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并使用NetworkAnalyzer工具對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，將degree值大于等于2倍中位數(shù)節(jié)度值的靶點(diǎn)蛋白根據(jù)Node degree distribution值進(jìn)行可視化。

2.1.5" GO生物功能富集分析和KEGG通路富集

借助Bioconductor中的R包Clusterprofile對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行以Plt;0.05為閾值的GO和KEGG富集分析，其結(jié)果以可視化的氣泡圖形式展示。

2.1.6" 槲皮素與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

將槲皮素與PPI網(wǎng)絡(luò)degree值前2位的靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，通過Pubchem和PDB數(shù)據(jù)庫分別下載核心活性化合物小分子配體及相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白受體的2D結(jié)構(gòu)的sdf格式文件［11-12］?；贏utoDock軟件準(zhǔn)備PDBQT文件和確定活性口袋，一般認(rèn)為小分子配體和靶點(diǎn)的結(jié)合能≤-7.0 kJ/mol則視為兩者具有強(qiáng)烈的對(duì)接活性［13］，最終利用Vina軟件及pymol軟件完成槲皮素與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證。

2.2" 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1" 細(xì)胞培養(yǎng)及分組給藥

在37 ℃、5%CO2和95%空氣的無菌培養(yǎng)箱中，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素培養(yǎng)HCT-116細(xì)胞，并用細(xì)胞完全培養(yǎng)基傳代。

實(shí)驗(yàn)共分為兩組，正常對(duì)照組（HCT-116細(xì)胞，不加藥物干預(yù)）和槲皮素組（槲皮素濃度為296.5 μmol/L）。

2.2.2" CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

將密度為1×104 mL-1且處于對(duì)數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞接種到96孔板中，并設(shè)置空白對(duì)照組和槲皮素組（5、20、80、320、640 μmol/L）。藥物處理24 h后，將96孔板取出，拍照，吸盡后丟棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL工作液（90 μL培養(yǎng)基+10 μL CCK8原液），在細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育0.5～1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值并算出IC50值。

2.2.3" 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯和凋亡

六孔板中，每孔約接種3×105 mL-1處于對(duì)數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜；吸棄培養(yǎng)基后，加入槲皮素濃度為296.5 μmol/L的液體作為試驗(yàn)組，未加入槲皮素的作為對(duì)照組，處理24 h后，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞。將20 μL的PI加入重懸離心的PBS中，并使用錫箔紙包住避光染色30 min，使用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞周期比例變化。細(xì)胞收集、處理及洗滌方式同前，先后加入Annexin V-FITC及PI染色液，避光孵育20 min后置于冰浴中，重懸細(xì)胞2～3次改善染色效果后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞凋亡率=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。

2.2.4" RT-qPCR檢測(cè)核心靶點(diǎn)AKT1、TP53 mRNA表達(dá)水平

槲皮素干預(yù)24 h后各孔加入適量Trizol裂解細(xì)胞后提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)AKT1、TP53 mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用2－△△CT法進(jìn)行相對(duì)定量分析，引物序列見表1。

2.2.5" Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax、p53蛋白的表達(dá)

將處于對(duì)數(shù)生長期且密度為3×105 mL-1的HCT-116細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h后加入濃度為296.5 μmol/L的槲皮素處理細(xì)胞，給藥結(jié)束后，用RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，隨后進(jìn)行蛋白電泳分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBST清洗3次后分別加入相應(yīng)一抗（Bax抗體：1：1 000（稀釋比例，下同）；Bcl-2抗體：1：1 000；p53抗體：1：1 000；GAPDH抗體：1：10 000），置于4 ℃冰箱孵育過夜；TBST漂洗3次后加入二抗（1：5 000）孵育2 h；PBST清洗5次后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶灰度值，分析和計(jì)算出Bcl-2、Bax、p53蛋白的表達(dá)：各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=各蛋白灰度值/GAPDH內(nèi)參灰度值。

2.3" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

繪圖采用GraphPad Prism 5軟件，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0，試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次，以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示計(jì)量資料，組間比較采用t檢驗(yàn)，以Plt;0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3" 結(jié)果

3.1" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果

3.1.1" 槲皮素靶點(diǎn)收集

將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出的154個(gè)作用靶點(diǎn)和通過Swiss Target Prediction模塊預(yù)測(cè)和篩選到100個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行匯總并刪除重復(fù)后，最終獲得槲皮素作用靶點(diǎn)共230個(gè)。

3.1.2" 疾病靶點(diǎn)的收集

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫，以“colorectal cancer”為疾病關(guān)鍵詞，收集到“結(jié)直腸癌”的疾病相關(guān)靶點(diǎn)共12 983個(gè)。

3.1.3" 共有靶點(diǎn)獲取

將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)利用R Studio的VennDiagram包進(jìn)行映射，得到槲皮素抗結(jié)直腸癌的潛在作用靶點(diǎn)共214個(gè)，進(jìn)一步輸出Venn圖（如圖1）。

3.1.4" PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別通過String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape_v3.7.2軟件構(gòu)建共有靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中共有214個(gè)節(jié)點(diǎn)（即靶點(diǎn)），共有4 449條邊（即靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系），中位數(shù)節(jié)度值為41.6。我們選取degree值≥2倍中位數(shù)節(jié)度值的靶點(diǎn)蛋白并根據(jù)node degree distribution值進(jìn)行可視化，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)（如圖2），在本PPI網(wǎng)絡(luò)中，degree值≥2倍中位數(shù)節(jié)度值，且排名前2的靶點(diǎn)分別是AKT1（degree值=147）、TP53（degree值=140），提示這兩個(gè)靶點(diǎn)是槲皮素抗結(jié)直腸癌的核心靶點(diǎn)，可能在網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。

3.1.5" GO分子功能富集結(jié)果

GO富集到5 415個(gè)條目，其中生物過程（BP）條目占比82.53%（4 469）個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目占比6.65%（360）個(gè)，分子功能（MF）條目占比10.82%（586）個(gè)，詮釋候選靶標(biāo)的抗腫瘤生物過程。本研究利用R語言，以Plt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出GO富集結(jié)果中BP、CC、MF各項(xiàng)排名前10位的條目，共30條，繪制成可視化的氣泡圖予以展示（如圖3）。結(jié)果提示，槲皮素抗結(jié)直腸癌主要涉及：transcription coregulator binding等。

3.1.6" KEGG通路富集結(jié)果

KEGG富集到233條信號(hào)通路。本研究利用R語言，以Plt;0.05為標(biāo)準(zhǔn)，將結(jié)果中排名前30位的信號(hào)通路，繪制成可視化的氣泡圖予以展示（如圖4）。

結(jié)果提示，槲皮素抗結(jié)直腸癌主要集中于在細(xì)胞增殖、凋亡方面起重要作用的通路，如PI3K-Akt信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等。

3.1.7" 藥物與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

通過AutodockVina軟件將槲皮素和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，獲得小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的自由能，同時(shí)得到槲皮素和核心靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接模式（如圖5）。結(jié)果顯示，槲皮素與排名前2的靶點(diǎn)AKT1、TP53的結(jié)合能分別為-7.67 kJ/mol、-7.85 kJ/mol，故槲皮素與結(jié)直腸癌的核心靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的結(jié)合作用。

3.1.8" 核心靶點(diǎn)基因的表達(dá)量及生存分析

將排名前2名的核心靶點(diǎn)基因帶入GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)通過TCGA數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸癌的數(shù)據(jù)（479個(gè)結(jié)直腸癌組織、42個(gè)癌旁組織）并做差異表達(dá)。結(jié)果顯示，2個(gè)核心靶點(diǎn)基因中，只有TP53既在結(jié)直腸癌組織中顯著表達(dá)（如圖6（a），Plt;0.001），又能影響結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后（如圖6（b），Plt;0.05）。

3.2" 體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果

3.2.1" 槲皮素對(duì)HCT-116細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果提示，槲皮素可以抑制HCT-116細(xì)胞的增殖，且成劑量依賴性（如圖7）。不同濃度槲皮素作用于HCT-116細(xì)胞24 h后，5、20、80、320、640 μmol/L組的細(xì)胞活力逐漸降低，且20、80、320、640 μmol/L組相較于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01、Plt;0.001、Plt;0.000 1），并計(jì)算得出槲皮素作用于HCT-116細(xì)胞24 h的IC50值為296.5 μmol/L。

3.2.2" 槲皮素對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響

流式檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，加入槲皮素培養(yǎng)24 h后，HCT-116細(xì)胞的凋亡水平極顯著升高（Plt;0.01），表明槲皮素對(duì)HCT-116細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用（如圖8）。

3.2.3" 槲皮素對(duì)HCT-116細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組HCT-116細(xì)胞周期比例變化，結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，槲皮素作用于HCT-116細(xì)胞24 h后，槲皮素組HCT-116細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例由（19.737±3.359）%上升至（43.433±1.497）%（Plt;0.01）；G2/M期細(xì)胞比例由（36.033±0.435）%下降至（19.347±2.164）%（Plt;0.01）；而S期細(xì)胞比例無明顯變化（Pgt;0.05）。結(jié)果表明，槲皮素可抑制細(xì)胞G1期向G2/M期的轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)G0/G1期阻滯（如圖9、圖10）。

3.2.4" 槲皮素對(duì)HCT-116細(xì)胞核心靶點(diǎn)AKT1、TP53 mRNA表達(dá)水平的影響

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，槲皮素組HCT-116細(xì)胞中AKT1mRNA的表達(dá)量顯著降低（Plt;0.05）；而TP53 mRNA的表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.01），見圖11。

3.2.5" 槲皮素對(duì)HCT-116細(xì)胞Bcl-2、Bax、p53蛋白表達(dá)的影響

Western Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，槲皮素組Bax、p53蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01、Plt;0.05）；槲皮素組Bcl-2/Bax的比值較對(duì)照組明顯降低（Plt;0.05）；而兩組Bcl-2蛋白表達(dá)水平無明顯變化（Pgt;0.05），見圖12。

4" 討論

結(jié)直腸癌是由多種因素導(dǎo)致的以臟腑功能失調(diào)為本，痰濕毒瘀積聚為標(biāo)的一種臨床常見腫瘤，但其具有的高發(fā)病率和高死亡率，使人類的健康受了到嚴(yán)重威脅。近年來，具有網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)作用的中藥在輔助治療CRC方面取得了良好的療效。植物來源的天然化合物具有潛在的抗癌作用，而天然黃酮類化合物槲皮素在抗炎、抗病毒、抗氧化應(yīng)激和降糖等方面具有強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，對(duì)結(jié)直腸癌具有一定的防治功效［14-15］。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)槲皮素抗結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制顯得十分有必要。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞對(duì)外源性或內(nèi)源性刺激做出的防御性反應(yīng)，是基因調(diào)控下細(xì)胞程序性死亡的一種形式，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的主要機(jī)制［16-17］。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白，他們分別可以通過抑制和促進(jìn)線粒體中Cytc的釋放而起到抑制細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［18］。有研究表明p53蛋白能夠特異的促進(jìn)Bax的表達(dá)，降低Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［19］；且Bcl-2/Bax比率的變化可啟動(dòng)半胱天冬酶信號(hào)傳導(dǎo)，激活caspase-3，引起凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［20］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提示槲皮素可能通過214個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用，而對(duì)靶點(diǎn)蛋白構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，AKT1、TP53可能是槲皮素抗結(jié)直腸癌的核心靶點(diǎn)。AKT異常活化會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生［21］，AKT1被磷酸化激活后參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡，且具有促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力［22］，因此，在結(jié)直腸癌組織中，AKT1常高表達(dá)，而腫瘤浸潤深度、臨床分期及有無淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移則是影響AKT1是否高表達(dá)的重要因素［23］；TP53是一種編碼p53的抑癌基因，可誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控，同時(shí)發(fā)揮基因監(jiān)視功能［24］，而喪失抑癌功能的野生型TP53可誘導(dǎo)正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的發(fā)病［25］，且結(jié)直腸癌患者TP53基因突變的發(fā)生率為60%［26］，這使得其監(jiān)視作用喪失，失去抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化的功能。GO功能富集和KEGG通路富集相互聯(lián)系，相互補(bǔ)充，從不同側(cè)面揭示槲皮素可能參與了細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程及調(diào)節(jié)PI3K/Akt signaling pathway、p53 signaling pathway等信號(hào)通路，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，發(fā)揮抗結(jié)直腸癌的作用。PI3K/Akt信號(hào)通路及p53信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡方面有著重要的作用［27-28］，Yu等［29］的研究表明，抑制PI3K/AKT磷酸化可誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡，Huang等［30］研究證實(shí)槲皮素可通過下調(diào)PI3K和AKT的表達(dá)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而抑制HCT-116細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；而p53信號(hào)通路的相關(guān)蛋白上調(diào)可使血管生成受到抑制、細(xì)胞凋亡加速而起到抗腫瘤作用［31］。

分子對(duì)接結(jié)果表明，槲皮素與關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、TP53的結(jié)合能均小于-7.0 kJ/mol，提示槲皮素與其蛋白受體相互結(jié)合的能力極強(qiáng)，發(fā)生相互作用的可能性最大；但兩個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中只有TP53既在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，又可影響結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后，因此推測(cè)槲皮素可能通過這一關(guān)鍵靶點(diǎn)介導(dǎo)p53信號(hào)通路，發(fā)揮復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)功能，進(jìn)而起到抗結(jié)直腸癌的作用。

在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接分析的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，CCK-8結(jié)果提示，槲皮素對(duì)HCT-116細(xì)胞的增殖具有劑量依賴性的抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，槲皮素具有促進(jìn)HCT-116細(xì)胞凋亡的作用，且槲皮素可將HCT-116細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞周期，從而使增殖活性降低，加速凋亡；RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，HCT-116細(xì)胞經(jīng)過槲皮素干預(yù)后，關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1 mRNA的表達(dá)顯著降低（Plt;0.05），TP53 mRNA的表達(dá)顯著升高（Plt;0.01）；Western blot檢測(cè)顯示，p53、Bax蛋白表達(dá)明顯升高（Plt;0.01、Plt;0.05），Bcl-2/Bax的比值明顯降低（Plt;0.05），HCT-116細(xì)胞的凋亡率極顯著增加（Plt;0.01），提示槲皮素可能通過上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，提升Bax的分泌，調(diào)整Bcl-2/Bax比值，加速HCT-116細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到抗結(jié)直腸癌的作用，這與我們網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的預(yù)測(cè)結(jié)論相符。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)槲皮素抗結(jié)直腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)、重要通路方面做了初步分析，并通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，槲皮素可能通過調(diào)控TP53、AKT1等核心靶點(diǎn)，激活p53信號(hào)通路，調(diào)控HCT-116細(xì)胞的增殖與凋亡，進(jìn)而起到抗結(jié)直腸癌的作用，為槲皮素的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。然而，本研究并未研究在動(dòng)物體內(nèi)的藥效及作用機(jī)制，使結(jié)論具有一定局限性。因此，槲皮素如何在體內(nèi)調(diào)控上述信號(hào)通路起到抗結(jié)直腸癌的作用將成為課題組后續(xù)研究重點(diǎn)。

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