根腫菌效應蛋白PBRA_000499功能研究

關鍵詞： 蕓薹屬根腫菌； 效應蛋白； 植物免疫

1 引言

蕓薹屬根腫菌（Plasmodiophora brassicae）引發(fā)的根腫?。╟lubroot disease）是一種對十字花科作物極具破壞性的土傳性疾?。?］，嚴重影響十字花科經(jīng)濟作物的產(chǎn)量和質量. 在極端年份，平均產(chǎn)量損失為20%～30%，田間損失甚至超過60%［2］. 隨著現(xiàn)代農業(yè)活動的擴大，油菜及十字花科蔬菜根腫病的發(fā)病面積正迅速增加，在四川、湖北、云南、安徽等省份尤為嚴重［3］. 根腫菌的休眠孢子可在土壤中存留20 年仍然具有侵染能力［4］，且根腫菌具有復雜的生理小種分化［5］，現(xiàn)有的防治措施或效果欠佳，或成本過高，尋找新的、更有效的抗病基因并培育廣譜抗性品種是現(xiàn)階段根腫病防治的重要任務［6］，因此更需深入了解根腫菌致病機理及其與宿主植物互作的關系［7］.

在植物與病原菌長期的“ 軍備競賽”中，病原菌會在侵染期間分泌多種不同類型的效應分子，包括效應蛋白、小RNA、植物激素及其衍生物等進入宿主細胞的不同亞細胞區(qū)室以干擾各種生物學過程. 如大豆疫霉菌和大麗輪枝菌分泌的效應蛋白PsIsc1 和VdIsc1 可以水解水楊酸前體異支分酸，抑制宿主體內水楊酸介導的先天免疫反應［8］.番茄葉霉菌分泌的效應蛋白Avr4 可以與真菌細胞壁中的幾丁質結合，保護病原菌的細胞壁不被植物幾丁質酶的水解，從而增強了病原菌的致病能力［9， 10］. 黃單胞菌的效應蛋白XopJ 靶向宿主細胞高爾基體并抑制胼胝質沉積［11］. 小麥條銹菌分泌的效應蛋白PgtSR1 改變了參與寄主防御過程的sRNA 豐度，促進對多種病原體的易感性，并抑制了部分抗性基因介導的多種防御反應［12］. 黑粉病菌侵染玉米時，通過分泌Rsp3 效應蛋白與菌絲細胞壁結合，保護菌絲不被玉米抗真菌蛋白AFP1 和AFP2 破壞，進而抵消植物的防御反應［13］. 因此，探究根腫菌分泌蛋白與宿主互作的分子機制是了解根腫菌的一個重要層面，同時也為挖掘根腫病抗病基因和培育廣譜抗性品種夯實理論基礎［14］. 目前關于根腫菌效應蛋白的鑒定僅有少量報道，PbBSMT 是目前研究較為深入的根腫菌效應蛋白. PbBSMT 是一種甲基轉移酶，可以將宿主體內的SA 轉化為更易揮發(fā)的MeSA，從而降低宿主防御能力，幫助根腫菌入侵和定殖［15］. 另一方面，PbBSMT 也可能消除幾丁質誘導的植物防御反應［16］. 除此之外，SSPbP53 ［17， 18］、PbZF1［19］、Pb?ChiB4 和PbChiB2［20］等效應蛋白也被證實對根腫菌發(fā)揮致病能力至關重要.

PBRA_000499 是前期鑒定的一種具有分泌功能的根腫菌蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)PBRA_000499 包含RING 型結構域，具有E3 泛素連接酶活性［21， 22］. 為了進一步探究PBRA_000499 的功能，本研究采用煙草瞬時表達系統(tǒng)驗證其在植物免疫系統(tǒng)中的作用，并將PBRA_000499 在擬南芥中穩(wěn)定表達，探究其在根腫菌侵染過程中發(fā)揮的作用. 以期在根腫菌與寄主的互作關系中提供新的見解，為根腫菌的致病機理研究和十字花科病害防治提供一定的理論依據(jù).

2 材料與方法

2. 1 實驗材料

根腫菌：采集于四川省廣漢市西高鎮(zhèn)，根據(jù)SCD（Sinitic clubroot differential）分類系統(tǒng)鑒定為Pb3［23］，于-20 ℃保存?zhèn)溆?

植物材料：擬南芥哥倫比亞型（Arabidopsisthaliana，Col-0）和煙草（Nicotiana benthamiana）由本實驗室提供.

2. 2 實驗方法

2. 2. 1 RNA 提取及重組載體構建 取保存的感病植株的腫根，用無菌水清洗后置于液氮中研磨成粉，用KK 超快植物總RNA 提取試劑盒（莊盟生物）按照說明書提取RNA. 使用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super?Mix 試劑盒（全式金）按照說明書進行反轉錄合成cDNA，所得產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?

以根腫菌cDNA 為模板，擴增得到PBRA-000499 和PBRA_000499△ sp 基因片段，根據(jù)不同載體的酶切位點設計引物（表1），分別構建pGR107-PBRA_000499△ sp、PBI221-PBRA_000499-eGFP、pFGC5941-PBRA_000499-FLAG 重組載體；挑取陽性克隆提取質粒送測序，于-20 ℃保存測序正確的質粒備用.

2. 2. 2 PBRA_000499 煙草瞬時表達 將重組質粒pGR107-PBRA_000499△ sp 轉化到農桿菌感受態(tài)GV3101 中，經(jīng)培養(yǎng)后挑取陽性克隆，繼續(xù)擴大培養(yǎng). 8000 r/min 離心5 min 收集菌體，用提前配制好的細胞重懸液（10 mmol/L MgCl2，10 mmol/LMES，0. 15 mmol/L AS）重懸至OD600 為0. 8～1. 0，室溫下黑暗處理2 h；使用1 mL 的注射器吸取菌液，用針頭輕輕地在煙草葉片背面點一個小口，去掉針頭后，從葉片傷口處將菌液注射到葉片中；將注射后的煙草移入黑暗環(huán)境中培養(yǎng)12 h，然后在正常光周期下培養(yǎng)2. 5～4 d；使用1 cm 的打孔器截取注射位置的煙草，浸泡在5 mL 的ddH2O 中，室溫靜置3 h ，測量電導率記為E1；100 ℃ 加熱25 min，冷卻至室溫后再次測定電導率，記為E2；計算電解質滲漏率.

2. 2. 3 亞細胞定位 選取厚實且葉脈較少的葉片，蘸取少量金剛砂輕輕地揉搓煙草下表皮絨毛，將葉片切成1 mm 左右細條，均勻置于酶解液（1. 5% Cellulose R10，0. 4% Macerozyme R10，0. 4 mol/L Mannitol，20 mmol/L MES pH=5. 7，20 mmol/L KCl ，10 mmol/L CaCl2，0. 1% BSA）當中；黑暗條件下，30 ℃培養(yǎng)2 h 左右；挑出培養(yǎng)皿中的葉片殘渣及雜質，緩慢輕柔地加入1 倍體積的預冷W5 溶液（10 mmol/L MES，125 mmol/LCaCl2，5 mmol/L KCl，154 mmol/L NaCl），使用200 目過濾網(wǎng)過濾溶液，并將濾液轉移至50 mL 圓底EP 管中；200 r/min 離心3 min，緩慢吸取上清，加入等體積預冷的W5 溶液；冰浴1 h；200 r/min 離心2 min，吸去上清，沿管壁緩慢加入2 mL MMG溶液（0. 4 mmol/L MES，400 mmol/L Mannitol，15 mmol/L MgCl2）后輕輕混勻；吸取30 μL 質粒PBI221-PBRA_000499-eGFP、PBI221-eGFP（ 陽性對照），加至2 mL 無菌EP 管中，分別向其中加入200 μL 原生質體和230 μL 40% PEG4000 溶液，迅速輕柔混勻，室溫條件下轉化20 min；加入920 μL 已預冷的W5 溶液；200 r/min 離心2 min，吸去上清，沿管壁加入1 mL預冷的W（I 500 mmol/LMannitol，20 mmol/L KCl，0. 4 mmol/L MES）溶液，重懸原生質體；將EP 管水平放置，25 ℃黑暗培養(yǎng)16～18 h；200 r/min 離心2 min，緩慢吸去上清，用預冷的W5 溶液清洗2 次，留存100 μL 原生質體；吸取10 μL 原生質體制作臨時玻片，在正置熒光顯微鏡下觀察原生質體.

2. 2. 4 擬南芥的培養(yǎng)及遺傳轉化 將重組質粒pFGC5941-PBRA_000499-FLAG 轉化到農桿菌GV3101 感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆進行PCR 鑒定，將正確的單克隆接種至含有Kan 和Rif 的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，至OD600 為0. 6；4500 g 離心5 min 收集菌體后，用1/2 MS 液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后再次離心棄上清；用擬南芥花序浸染液（1/2 MS 培養(yǎng)基，5% 蔗糖，0. 03% Silwet L-77）稀釋菌體，至OD600 為0. 8～1，黑暗處理0. 5～2 h；選取長勢優(yōu)良的植株，剪去角果，將花序浸沒在浸染液中，30～50 s，覆膜保濕，黑暗培養(yǎng)24 h；每隔5～7 d 侵染1 次，重復3 次；收集成熟種子，即獲得T0代種子；將T0代種子春化3 d 后撒播在土壤基質中，至長出2 片真葉后，早晚各噴灑1 次0. 05%Basta 溶液. 5～7 d 后可觀察到非陽性株枯萎死亡，將陽性植株轉移至新的土壤基質中繼續(xù)培養(yǎng).2～3 w 后取適量葉片組織提取RNA 后反轉錄得到cDNA，以其為模板進行PCR、RT-qPCR 檢測，相關引物見表2. 使用2-△△Ct 法計算基因相對表達量，選取轉錄水平較高的3 個株系單株收取種子后擴繁，直至T3 代獲得純合穩(wěn)定轉化的株系.

2. 2. 5 擬南芥的根腫菌侵染 采集感病植株的根部組織，攪碎成勻漿狀后過濾，3000 r/min 離心10 min 后棄去上清液；用50%（w/v）蔗糖溶液重懸菌體沉淀，3000 r/min 離心10 min 后棄去上清液；清洗沉淀3～5 次；用2% 的氯胺-T 溶液重懸沉淀，室溫靜置20 min 后加入抗生素（頭孢噻肟鈉、鹽酸萬古霉素和硫酸粘桿菌素，終濃度均為0. 1%），25 ℃靜置過夜；3000 r/min 離心10 min，棄上清；洗滌菌體3～5 遍，加入少量無菌水，即得到休眠孢子懸浮液，利用血球計數(shù)板對稀釋后的懸浮液測定濃度；種子春化3 d 萌發(fā)后，挑選大小相近的幼苗，單株移栽. 每株擬南芥根部注射1 mL 濃度為1×107 個/mL 的根腫菌休眠孢子懸浮液，同時設置對照組為根部注射1 mL ddH2O.

分別記錄不同擬南芥材料接種根腫菌后7 d、14 d、21 d、28 d 的表型，同時記錄接種后21 d 和28 d 的根部情況. 為了確保實驗的準確性和可信度，每種擬南芥材料至少種植30 株，進行3 次重復試驗；將不同材料置于同一個育苗托盤中培養(yǎng)，以減少由于培養(yǎng)條件不同造成的誤差. 計算病情指數(shù)DI.

DI=100× Σ（發(fā)病等級數(shù)×各等級對應擬南芥株數(shù)）/（擬南芥總調查株數(shù)×最高發(fā)病等級數(shù)）.

3 結果與分析

3. 1 PBRA_000499 影響植物細胞免疫響應

小鼠促凋亡因子BAX［24］、卵菌中的激發(fā)子INF1［25］誘導的細胞程序性死亡與植物防御相關的HR 相似. 因此，檢測BAX、INF1 誘導的細胞死亡的抑制作用是評估病原菌效應物在抑制植物免疫方面的毒力功能的有效策略. 將構建好的pGR107-PBRA_000499△sp 融合表達載體轉化農桿菌，注射本氏煙草進行瞬時表達，結果如圖1a 所示. 注射PBRA_000499△sp 后并沒有出現(xiàn)細胞死亡現(xiàn)象，即PBRA_000499 不會直接誘導細胞死亡.為了驗證PBRA_000499 是否會抑制植物的免疫反應，在注射PBRA_000499△sp 12 h 后，在相同位置分別注射BAX 和INF1，并將單獨注射eGFP、單獨注射BAX 或INF1、注射eGFP 12 h 后相同位置再注射BAX 或INF1 作為對照，7 d 后觀察并記錄葉片注射點狀態(tài). 結果如圖1b 所示，單獨注射eGFP 后煙草葉片生長狀態(tài)良好，而分別單獨注射INF1、BAX、eGFP-INF1 或eGFP-BAX 的煙草葉片出現(xiàn)了明顯的細胞壞死，而注射PBRA_000499△sp-BAX 和PBRA_000499△sp-INF1 的煙草葉片均未出現(xiàn)明顯的細胞死亡現(xiàn)象. 在注射第7 d時對煙草葉片進行電解質滲漏率測定. 結果表明（圖2），陰性對照和陽性對照存在極顯著差異，注射PBRA_000499△sp-BAX 和PBRA_000499△sp-INF1 與eGFP-BAX 和eGFP-INF1 之間也存在極顯著差異，這與煙草葉片上所呈現(xiàn)的表型一致.

3. 2 PBRA_000499 亞細胞定位

為了明確效應蛋白PBRA_000499 發(fā)揮功能的具體位置，對PBRA_000499 進行亞細胞定位分析. 將表達載體（pBI221-PBRA_000499-eGFP、pBI221-eGFP 載體）轉化至當天制備的高質量煙草原生質體中，黑暗培養(yǎng)后通過正置熒光顯微鏡觀察拍照，結果如圖3 所示. 實驗結果發(fā)現(xiàn)，PBRA_000499 在細胞質當中出現(xiàn)明顯的熒光；結果表明PBRA_000499 是一個可以靶向植物細胞內發(fā)揮功能的效應蛋白.

3. 3 PBRA_000499 擬南芥穩(wěn)定轉化植株的獲得

以根腫菌總RNA 反轉錄得到的cDNA 作為模板，擴增得到PBRA_000499 基因片段，利用雙酶切技術，將目的基因導入pFGC5941 載體中. 使用35S 和ocs-R 引物鑒定重組質粒，凝膠電泳顯示，在1077 bp 處有特異條帶，與預測大小一致（圖4a）

將測序結果正確的重組質粒轉入農桿菌中，采用花序浸染的方式轉入野生型擬南芥中. 收取種子后使用Basta 篩選陽性株系，即T0 代（圖4b）；通過半定量結果可以看出，相較于Col-0，PBRA_000499 過表達株系可以擴增得到PBRA_000499基因片段（圖4c），說明成功構建PBRA_000499 轉基因擬南芥株系；qPCR 檢測了各穩(wěn)定轉化株系中PBRA_000499 基因的轉錄水平（圖4d），選取表達量最高的3 個株系，擴繁至T3代并保存種子以便后續(xù)實驗.

3. 4 PBRA_000499 基因加重擬南芥植株根腫病病情

接種前14 d，PBRA_000499 轉基因株系及Col-0 兩種材料都能正常生長，且相互之間沒有明顯差異；接種21 d 時，Col-0 植株普遍矮小，呈現(xiàn)受脅迫表型，葉片發(fā)紫，且葉片邊緣變黃，根部出現(xiàn)腫塊. 35S ∷ PBRA_000499 相較于Col-0，植株更小且受脅迫程度更深，部分側根腐爛，主根腫大.接種28 d 后，35S∷PBRA_000499 和Col-0 材料大多已經(jīng)萎蔫，根部腫塊變大；但35S ∷ PBRA-000499 情況更甚，地上部分基本枯萎死亡，地下根部側根腐爛僅保留了腫大的主根，僅有少數(shù)植株保留一定量的側根（圖5a、5b）. 根據(jù)表型記錄計算21 d 和28 d 不同材料的病情指數(shù)，在兩個時期與Col-0 相比，35S∷PBRA_000499 的病情指數(shù)較高（圖6）. 綜合表型統(tǒng)計和病情指數(shù)結果來看，35S∷PBRA_000499 擬南芥對根腫病抗性較弱，更易感.

4 討論

效應分子在病原菌與寄主互作的過程中發(fā)揮了重要功能. 生物營養(yǎng)型病原菌，如玉米黑粉菌、小麥條形柄銹菌等，分泌效應物抑制寄主免疫力，同時最大程度地減少對宿主細胞的損傷，以便病原菌可以在活細胞中繁殖［26， 27］. 死體營養(yǎng)型病原菌在大多數(shù)情況下分泌效應物誘導宿主細胞壞死，便于它們在死亡組織上增殖，例如灰霉菌和小麥葉斑病菌［26， 28］. 而像稻瘟病菌和禾谷鐮孢菌這樣的半生物營養(yǎng)型病原菌則采取多種功能效應子組合的方式，在生物營養(yǎng)階段抑制寄主先天免疫，在壞死期引發(fā)非特異性細胞死亡［27， 28］. 關于病原菌效應物與寄主體內蛋白互作的研究越來越多，已經(jīng)成為探究各類病原菌致病機制的一個重要方向. 因此，研究鑒定根腫菌的效應蛋白功能具有重要的科學意義. 本研究通過農桿菌介導的煙草瞬時表達系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)PBRA_000499 可以抑制BAX、INF1 誘導的煙草細胞程序性死亡，表明PBRA_000499 可以抑制煙草的免疫反應，推測PBRA_000499 可能幫助BAX、INF1 逃避了植物的免疫監(jiān)控，沒有被植物的免疫系統(tǒng)識別，因此煙草葉片上并沒有表現(xiàn)出細胞死亡癥狀.

病原菌效應子按其發(fā)揮功能所在的空間位置，分為質外體效應分子和胞內效應分子；細胞內效應物還通過與質膜上的不同細胞成分相互作用靶向植物免疫系統(tǒng)和代謝途徑，細胞核，細胞質和細胞器，包括葉綠體和線粒體［29-31］，干擾受體介導的防御信號傳導和植物激素信號傳導，改變基因轉錄和蛋白質穩(wěn)定性，甚至調節(jié)RNA 干擾、降解和選擇性剪接［32］. 大麥白粉病分泌蛋白CSEP0105作為一種胞質效應蛋白靶向胞質溶膠中的小熱休克蛋白并抑制其伴侶活性以促進毒力［33］. 為了確定效應蛋白PBRA_000499 分泌進入宿主細胞后的作用位置進行了亞細胞定位分析，結果顯示PBRA_000499 在細胞質中，所以PBRA_000499 可能是根腫菌分泌的一種胞質效應蛋白.

一部分效應蛋白可以發(fā)揮自身毒性功能，以不同的方式抑制寄主免疫反應，降低寄主的抗病性. 研究發(fā)現(xiàn)條銹菌分泌的PgtSR1 改變了參與寄主防御過程的sRNA 豐度，促進對多種病原體的易感性，并抑制了部分抗性基因介導的多種防御反應［12］. 條銹菌分泌的PstGSRE1 與ROS 相關轉錄因子TaLOL2 相互作用并干擾TaLOL2 的核定位，從而抑制了ROS 爆發(fā)和寄主的抗病能力［34］.大豆疫霉菌分泌的Avr1b 可以抑制BAX 誘導的程序性細胞死亡，異源表達該效應子后寄主的抗病能力降低［35］. 此外，還有一類效應蛋白可以被寄主識別并激活免疫反應，這類效應蛋白也被稱為無毒效應子，如曲霉中的酶活性RNase 效應子Zt6 誘導細胞死亡［36］；大豆疫霉菌分泌的XEG1 觸發(fā)寄主細胞死亡等防御反應［37］，稻瘟病菌候選效應蛋白MoCDIE2 能誘導非寄主植物細胞死亡［38］. 我們構建了PBRA_000499 轉基因擬南芥，觀察根腫菌侵染后的表型，病情調查結果分析發(fā)現(xiàn)，35S ∷PBRA_000499 轉基因擬南芥相比Col-0，感病程度更高. 根腫菌效應蛋白PBRA_000499 可能抑制了寄主的免疫反應，降低寄主的抗病能力.

綜上所述，本研究認為PBRA_000499 可以作為根腫菌分泌的胞質效應蛋白，通過調節(jié)寄主免疫反應進而調控根腫病的發(fā)生. 但具體的調控機制還有待進一步研究，之后將利用酵母文庫、雙分子熒光互補、GST-pull down 等方法進篩選寄主植物中與PBRA_000499 互作蛋白，探究PBRA_000499 在根腫菌侵染和定殖過程中發(fā)揮的作用，進一步解析根腫菌的致病機制.