擬南芥轉錄因子ATAF1介導植物熱形態(tài)建成的研究

關鍵詞： 熱形態(tài)建成； 轉錄因子； ATAF1； NAC 家族； 擬南芥

1 引言

溫度是影響全球植物分布和生長發(fā)育的關鍵環(huán)境因素，高溫下植物通過蛋白質變性和活性氧（ROS）積累導致不可逆的損傷，從而導致細胞器和光合作用的功能故障［1-3］. 一般來說，植物有兩種不同的高溫耐受機制：第一個是關于抗高溫的內在能力，通常被稱為基礎耐熱性；第二個是植物預先暴露于輕度高溫下誘導對高溫的適應性，這一過程稱為熱形態(tài)建成［4］. 典型的熱形態(tài)建成反應包括下胚軸伸長、葉片向上運動、葉柄伸長、氣孔密度降低和葉片變小、變?。?，6］. 由熱形態(tài)建成形成的開放式蓮座結構通過蒸騰作用有助于增強冷卻能力，并避免太陽熱流［7，8］. 高溫引發(fā)的熱脅迫會嚴重影響植物的生長性能，導致營養(yǎng)生長減少和產量下降，這與農業(yè)生產尤其相關. 因此了解植物如何感知溫度并將這些信息整合到其發(fā)育中，對于確定植物適應氣候變化機制以及氣候適應型作物的育種非常重要［9］. 植物在高溫下生長的結構反應包括莖和葉柄伸長［8］. 當氣溫上升到 40 ℃以上，植物經(jīng)歷嚴重的熱脅迫，導致全身性損傷、功能障礙，甚至細胞死亡［10］. 植物熱形態(tài)發(fā)生的特征主要包括下胚軸和葉柄生長較快、初生根生長加快、葉片發(fā)育遲緩、開花早、果實開裂加快和產量降低等［11-14］. 在這些性狀中，長下胚軸的伸長常被用作植物熱形態(tài)發(fā)生研究的證據(jù)［15］. 通過增強冷卻能力，熱形態(tài)發(fā)生可以在次優(yōu)溫度條件下實現(xiàn)最佳性能. 當溫度進一步升高時，可以誘導熱脅迫耐受機制，使植物能夠在壓力溫度下生存，這通常包括細胞保護機制和對其的記憶［16］.

NAC 家族是一個植物特異性轉錄家族，在植物對不同生物和非生物脅迫（包括水分虧缺、鹽度脅迫和溫度脅迫）的響應中發(fā)揮重要作用［17，18］. 一些 NACs 已被報道參與擬南芥和作物的高溫脅迫反應. 根據(jù)保守的N 端NAC 結構域內外的序列相似性，轉錄因子NAC 家族被分為幾個亞家族［19］，其中一個亞家族被稱為ATAF，已被證明是植物應對病原體攻擊反應的重要調節(jié)因子［20，21］.ATAF2 是一種參與創(chuàng)傷、水楊酸、茉莉酸和鹽應激反應的基因，其過表達導致真菌病原體易感性增加，致病相關基因表達降低［20］. 擬南芥在干旱和ABA 脅迫下相關基因的表達受到NAC 轉錄因子ATAF1 的負調控［18］，ABA-insensitive（ abi）突變體在萌發(fā)過程中表現(xiàn)出鹽敏感和干旱敏感的表型，過表達ABA 反應通路基因（ 如SDIR1、ABF3 和ABF4）的植物，則不耐旱且對鹽不敏感，而過表達ATAF1 的突變體對干旱耐受性顯著增強，對鹽脅迫高度敏感［20，22］. ATAF 在單子葉和雙子葉植物滲透調節(jié)中是保守的［22］，研究發(fā)現(xiàn)ATAF1 參與植物衰老調控，其中H2O2 作為生理信號或代謝物.ATAF1 通過直接調控關鍵的光合作用和衰老轉錄級聯(lián)，將ABA 和H2O2 依賴的信號通路與衰老整合在一起［17］. 在生長發(fā)育及鹽脅迫引起的葉片衰老過程中，ATAF1 的表達增加［23，24］. 在擬南芥中，應激誘導ABA 產生，進一步促進擬南芥激活ATAF1/ANAC002 基因的表達. ATAF1 蛋白通過與擬南芥ORE1/ANAC092 基因直接結合，誘導衰老調節(jié)因子ORE1/ANAC092 基因表達，抑制葉綠體維持因子（GLK1）基因表達，從而促進衰老進程，發(fā)揮調控作用［17］. 此外，研究表明 ATAF1 過表達系對高鹽度、ABA、氧化應激和壞死性病原體感染高度敏感［18］.

研究顯示，在本世紀下半葉，氣候變暖可能會對重要主糧作物的產量產生負面影響，而培育適應高溫的作物可以改善這種不利局勢［25］. 因此了解熱形態(tài)建成背后的分子遺傳通路，對抵抗環(huán)境溫度的變化至關重要. 研究表明轉錄因子ATAF1同源基因參與了水稻、小麥、玉米熱耐受性的調控［26-29］，且ATAF1 負調控植物的熱記憶應答［30］，因此探究ATAF1 在適度高溫下的調控機制將為理解龐大的植物特異性轉錄因子NAC 家族的存在意義提供新的證據(jù). 本文探究了 ATAF1 在植物熱形態(tài)建成中的功能，通過本研究不僅可以拓寬對NAC 家族轉錄因子的認識，也為理解植物響應全球氣候變化調控熱形態(tài)建成提供新的理論依據(jù).

2 材料方法

2. 1 材料

本研究中使用的擬南芥野生型Col-0（Columbia）以及突變體ataf1-2（ SALK_057618）為本實驗室原有35S：：ATAF1-HA、proATAF1：：GUS 和proATAF1：：ATAF1-GFP 轉基因植株通過根癌農桿菌（GV3101）浸染獲得35S：：ATAF1-HA、proATAF1：：ATAF1-GFP ataf1-2 通過遺傳雜交篩選所得.

2. 2 實驗方法

2. 2. 1 構建表達載體 以野生型的cDNA 為模板采用PCR 擴增目的序列，擴增采用Takara 公司的PrimeSTAR 高保真酶，將上述反應液放入PCR儀，采用三步法擴增. DNA 膠回收采用生工公司的SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，質粒小量提取采用生工公司的SanPrep 柱式質粒DNA 小量抽提試劑盒，將提取的質粒用Thermo 公司的FastDigest 快切酶進行載體線性化處理，線性化后的載體與目的片段用諾唯贊公司的無縫克隆試劑盒構建載體.

2. 2. 2 GUS 染色 對經(jīng)過處理的幼苗進行避光染色，使用上海生工科技有限公司的GUS 染色液（Sangon Biotech，Cat no. A610085-0025），在37 ℃下染色2 h，隨后使用 75% 乙醇進行脫色. 觀察染色結果，利用熒光顯微鏡采集圖像.

2. 2. 3 數(shù)據(jù)處理 使用GraphPad Prism 9 進行顯著性分析和柱狀圖繪制，誤差線表示3 次生物學重復實驗的標準差，*表示兩者間有顯著性差異，a、b、c由大到小表示有顯著性差異的平均數(shù)，Plt;0. 05.

2. 2. 4 免疫印跡實驗（Western Blot， WB） 選取擬南芥幼苗部分組織使用液氮將植物組織磨成細粉，加入2× loading buffer，煮沸后離心，吸取上清液用作植物總蛋白提取物. 使用上海雅酶提供的快速制備試劑盒制備PAGE 凝膠，將蛋白樣品上樣至組裝好并加入電泳緩沖液的電泳裝置中，設置電泳參數(shù)（恒壓120 V，1 h）；電泳結束后，使用干轉儀進行膜轉移，設置轉膜參數(shù)（ 恒壓25 V，40 min）；將PVDF 膜轉至孵育盒，加入封閉緩沖液后放入搖床封閉（37 ℃ ，90 r/min，1 h）；倒掉封閉液，加入一抗溶液后搖床孵育（37 ℃ ，90 r/min2 h）；倒掉一抗溶液，加入TBST 緩沖液后置于搖床中重復清洗3 次（37 ℃，90 r/min，10 min）；加入二抗溶液，搖床孵育（37 ℃，90 r/min，1 h）；倒掉二抗溶液，加入TBST 緩沖液后置于搖床中重復清洗3 次（37 ℃，90 r/min，10 min）；倒掉二抗，加入8mL TBST 緩沖液清洗PVDF 膜，置于搖床清洗（37 ℃ ，90 r/min，10 min），重復清洗3 次；最后用Bio-Rad 化學顯影成像系統(tǒng)進行顯影. 相關緩沖液見表1.

3 結果

3. 1 溫和高溫抑制ATAF1 的轉錄

溫度是影響植物生長發(fā)育的關鍵因子， 為了適應不斷變化的環(huán)境， 植物在高溫下通常會表現(xiàn)出下胚軸和葉柄伸長的表型［16］. 有研究表明NACs 家族成員廣泛參與植物生長代謝的多個過程，其中ATAF1 被證明為植物的熱響應基因［30］.為了進一步探究 ATAF1 在植物熱形態(tài)建成中的功能，本研究首先對ATAF1 響應溫和高溫的表達模式進行了分析. 將Col-0 植株分別放置在22 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中生長5 d，提取幼苗總RNA，通過RT-qPCR 檢測下胚軸和葉柄中ATAF1 基因的表達水平. 研究表明，與對照組相比，28 ℃幼苗的下胚軸和葉柄中ATAF1 表達均受到抑制（圖1a）. 另一方面，通過proATAF1：：GUS 轉基因植株的GUS 染色發(fā)現(xiàn)，ATAF1 轉錄活性在28 ℃下減弱，且轉錄物變化主要發(fā)生在葉柄和下胚軸中（圖1b）.

3. 2 ATAF1 蛋白積累溫和高溫下被抑制

為了進一步研究 ATAF1 在溫和高溫下的響應機制，我們構建了一系列 ATAF1 相關材料，包括缺失突變體ataf1-2，回補材料ataf1-2PATAF1：：ATAF1-GFP，過表達材料proATAF1：：ATAF1-GFP 以及超表達轉基因材料35S：：ATAF1-HA，并通過RT-qPCR 和western-blot 檢測了ATAF1 轉錄水平和蛋白積累（圖2），最終獲得符合要求的實驗材料.

接下來我們探究了在不同溫度生長的幼苗中ATAF1 蛋白的積累水平. 如圖3a 所示，在內源啟動子驅動表達的proATAF1：：ATAF1-GFP 植株中，28 ℃ 條件下下胚軸和葉柄中的ATAF1-GFP蛋白量積累明顯低于22 ℃下生長的植株中的蛋白量. 而在35S 強啟動子驅動的35S：： ATAF1-HA中，ATAF1-HA 蛋白在28 ℃下的積累量顯著低于22 ℃（圖3b）. 這些實驗結果表明溫和高溫信號降低ATAF1 蛋白水平.

3. 3 ATAF1 溫和高溫下抑制葉柄和下胚軸伸長

上述結果表明溫和高溫下，ATAF1 的轉錄水平與蛋白積累量在下胚軸和葉柄中都發(fā)生了變化，我們推測ATAF1 會影響擬南芥下胚軸和葉柄在溫和高溫下的生長發(fā)育. 為了證明這個猜想，我們觀察了Col-0、ataf1-2、ataf1-2 pATAF1：：ATAF1-GFP 和35S：：ATAF1-HA 分別在22 ℃和28 ℃生長5d 的幼苗的下胚軸和葉柄表型. 結果表明：與22 ℃ 相比，在28 ℃ 下35S：：ATAF1-HA 的下胚軸幾乎不伸長，葉柄也明顯較短；在缺失突變體ataf1-2 中，22 ℃條件下下胚軸和葉柄與野生型沒有差異，而28 ℃下明顯長于野生型，回補材料表現(xiàn)出了與 Col-0 一致的表型（圖4a）. 同時，我們測定了不同溫度下葉柄和下胚軸的長度，統(tǒng)計分析顯示缺失突變體ataf1-2 和過表達植株35S：：ATAF1-HA 的下胚軸和葉柄長度在28 ℃下與野生型相比存在顯著性差異（圖4b、4c）. 這些實驗結果表明ATAF1 負調控溫和高溫下葉柄和下胚軸的伸長.

接下來，我們在顯微鏡下觀察不同溫度生長下的下胚軸和葉柄表皮細胞長度. 在正常溫度下，缺失突變體ataf1-2 下胚軸表皮細胞略長于野生型，而在28 ℃下，ataf1-2 的細胞長度顯著長于野生型（圖5a、5c）. 葉柄表皮細胞長度呈現(xiàn)了與下胚軸一致的變化趨勢（圖5b、5d）. 以上結果表明，在溫和高溫下ATAF1 介導了植物的下胚軸和葉柄的伸長生長.

4 討論

全球溫度加速上升，植物的生長發(fā)育面臨巨大挑戰(zhàn)，糧食作物面臨營養(yǎng)生長減少、產量下降的威脅［9］. 為了適應升高的環(huán)境溫度，植物體的下胚軸、葉柄、初生根的生長狀態(tài)發(fā)生變化［9］. 隨著我們對于NAC 轉錄因子在不同植物中調控功能的認識不斷加深，我們發(fā)現(xiàn)脅迫響應型NAC 轉錄因子可作為在逆境條件下高產的耐脅迫轉基因植株的候選基因［28，29，31］. 本研究主要探索了NAC 轉錄家族ATAF1 轉錄因子在熱形態(tài)建成過程中的功能，由于AFAF1 存在于多個物種且功能具有相似性，因此闡明ATAF1 的熱應答工作機制，可以為新型耐高溫品種選育提供一定指導. ATAF 亞家族在多個物種中有保守的生物學功能，ATAF1 及其同源基因在玉米、水稻、小麥、大豆等多個物種中被證明是熱響應基因［27，29，31］. ATAF 亞家族中的ATAF1 在多種生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮作用［32］. 許多NAC 轉錄因子在高溫下都有響應，并且ANAC042、ATAF1 以及NAC05 負調控擬南芥的熱脅迫記憶應答［22，33］. 因此探究NAC 轉錄因子在熱下的調控機制將為理解這個龐大的植物特異性轉錄因子家族的存在意義提供新的證據(jù). 同樣，熱形態(tài)建成作為植物對高溫的一種適應性生長，NAC 轉錄因子可能也參與對該進程的調控.

熱形態(tài)建成是一種適應性生長，可能會減少潛在的有害高溫條件造成的損害［11］. 在擬南芥中，溫暖的環(huán)境變化會引發(fā)不同的發(fā)育、生理和形態(tài)反應，包括對芽和根的生長、氣孔分化、開花、免疫和產量的調節(jié)，統(tǒng)稱為熱形態(tài)建成［12，34，35］. 在這些特征中，下胚軸的伸長發(fā)育通常被用作植物熱形態(tài)建成研究的標志性表型. 本研究發(fā)現(xiàn)，28 ℃幼苗的下胚軸和葉柄中ATAF1 表達均受到抑制. 通過proATAF1：：GUS 轉基因植株的GUS 染色發(fā)現(xiàn)，ATAF1 轉錄活性在28 ℃下減弱，且轉錄物變化主要發(fā)生在葉柄和下胚軸中. 接下來，構建pro?ATAF1：：ATAF1-GFP 和35S：： ATAF1-HA 突變體，通過對比內源啟動子和35S 強啟動子驅動的植株中28 ℃和22 ℃條件下蛋白積累量，得出結論高溫信號降低ATAF1 蛋白水平. 進一步觀察Col-0、ataf1-2、ataf1-2 pATAF1：：ATAF1-GFP 和35S：：ATAF1-HA 分別在22 ℃和 28 ℃生長5 d 的幼苗的下胚軸和葉柄表型并測量長度，實驗結果表明ATAF1 負調控溫和高溫下葉柄和下胚軸的伸長. 又通過顯微鏡觀察不同溫度生長下的下胚軸和葉柄表皮細胞長度，發(fā)現(xiàn)下ATAF1 介導了植物的下胚軸和葉柄的伸長生長. 綜上所述，本文探究了ATAF1 在植物熱形態(tài)建成中的功能，解析了NAC 家族轉錄因子調控的新進程.

由于ATAF1 在多物種中的保守性，這將為指導培育耐熱性農作物提供新的可能方向. 在高溫脅迫過程中活性氧和NO 大量產生，半胱氨酸過氧化、S-亞硝基化等翻譯后修飾也被誘導，這些修飾是植物應對熱環(huán)境的一種重要翻譯后調控策略，可能也在熱形態(tài)建成進程中扮演重要角色［36］. 而真核生物蛋白質組中存在兩種最普遍的翻譯后修飾，磷酸化和泛素化修飾，磷酸化是調節(jié)細胞信號轉導的主要機制，而泛素化在蛋白降解中發(fā)揮了重要的作用，二者之間的交叉調控可采取很多形式. 本研究發(fā)現(xiàn)，ATAF1 在熱下蛋白穩(wěn)定性下降從而導致豐度降低，猜測或許會受到上述翻譯后修飾的調控，進一步研究ATAF1 在熱形態(tài)建成進程中的蛋白穩(wěn)定性變化機制有助于更全面的認識熱形態(tài)應答. 基于本研究的結果，進一步探索溫和高溫誘導 ATAF1 蛋白降解的分子機制將為徹底揭示 NAC 轉錄因子在熱下的響應機制提供重要證據(jù)，也可為完善植物熱形態(tài)建成領域的研究提供有益參考，研究熱下ATAF1 的翻譯后修飾將是潛在的突破口. 解析溫度響應因子在熱形態(tài)建成中的調控機制是理解植物如何響應熱環(huán)境來改變內源蛋白質的穩(wěn)定性、活性以降低高溫損傷的關鍵，也可作為分子育種培育耐熱作物的重要參考點. 本研究有助于理解植物響應全球氣候變化調控熱形態(tài)建成的機制，為提高植物的耐熱性和保障糧食安全提供新的理論依據(jù).