紫色馬勃降解孔雀石綠染料的條件優(yōu)化

摘要" 本研究以紫色馬勃為試驗對象，以孔雀石綠染料為降解基質(zhì)，從菌體平板降解、發(fā)酵液培養(yǎng)時間（4、5和6 d）、降解處理溫度（22、26、30和34 ℃）及染料濃度（50、100、150、200、250和300 mg/L）4個方面探討其對孔雀石綠染料的降解效果。結(jié)果表明，紫色馬勃發(fā)酵液制備條件為在26 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)4 d；以200 mg/L孔雀石綠染料作為基質(zhì)，在30 ℃條件下，降解24 h，此時降解率達(dá)98.34%。研究結(jié)果為孔雀石綠染料的降解研究提供參考。

關(guān)鍵詞" 紫色馬勃；液體發(fā)酵；孔雀石綠；染料降解

中圖分類號" X703" " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A" " " "文章編號" 1007-7731（2025）02-0078-04

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.02.014

Optimization of conditions for degradation malachite green dyes by Calvatia lilacina

WANG Yinhui" " ZHOU Bin" " WANG Dan" " XIONG Aiqun" " YANG Zhonglei" " LI Zhengpeng

（Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， China）

Abstract" In this study， Calvatia lilacina was selected as the test object， malachite green dyes were used as the degradation substrate， and the degradation effect of the Calvatia lilacina on malachite green dyes was discussed in 4 aspects： bacterial plate degradation， culture time （4， 5， and 6 d）， degradation temperature （22， 26， 30， and 34 ℃）， and dye concentration （50， 100， 150， 200， 250， and 300 mg/L）. The results showed that Calvatia lilacina fermentation liquid was prepared under the condition of oscillating at 26 ℃， 160 r/min for 4 days. Using 200 mg/L malachite green dyes as the substrate， the degradation rate reached 98.34% at 30 ℃ for 24 h. The results provide references for the degradation of malachite green dyes.

Keywords" Calvatia lilacina; liquid fermentation; malachite green; dye degradation

隨著染料工業(yè)的發(fā)展，工業(yè)染料廢水成為生態(tài)環(huán)境重要污染源之一，水中的染料使得水體富營養(yǎng)化造成污染，導(dǎo)致水的色度增加，溶解氧減少，陽光穿透能力減弱，一些水生植物的光合能力也相應(yīng)減弱，從而對水生環(huán)境造成一定的破壞[1-2]?？兹甘G是一種三苯甲烷類染料，其結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，官能團(tuán)穩(wěn)定，可生物降解性低，毒性強(qiáng)[3]，如何實現(xiàn)其有效降解成為亟待解決的問題。

對于工業(yè)廢水染料，一般采用物理或化學(xué)處理方法。物理方法有吸附、絮凝、過濾和超聲波法等，其中吸附、絮凝和過濾效果一般、成本較高，且容易造成二次污染；超聲波法可以起到降解作用，但容易受到環(huán)境影響；化學(xué)方法有電化學(xué)氧化、超臨界水氧化等，其中電化學(xué)氧化法存在產(chǎn)物的分離問題，超臨界水氧化法的應(yīng)用受材料和設(shè)備限制，規(guī)模化應(yīng)用有限。目前生物降解法成為處理工業(yè)廢水染料的研究熱點，包括生物降解和生物吸附，該方法因其具備高效、經(jīng)濟(jì)、綠色和無二次污染等特點，將逐步替代物理和化學(xué)處理方法[4]。Palma等[5]和宋金龍等[6]研究表明，可降解染料的微生物主要包括細(xì)菌、真菌、放線菌和藻類等，其中對真菌的研究較深入。真菌在自然界中廣泛分布，具有較強(qiáng)的木質(zhì)纖維素分解能力。司靜等[7]研究表明，木質(zhì)纖維素降解酶對染料具有較強(qiáng)的降解效果。使用真菌降解染料具有高效性、適用性強(qiáng)，能耗低，以及污染小等優(yōu)點[8]。紫色馬勃 （Calvatia lilacina）屬擔(dān)子菌門的大型真菌，分布較廣，藥理作用表現(xiàn)多樣，應(yīng)用前景備受關(guān)注[9]。朱月等[10]研究表明，紫色馬勃水溶性多糖對氧自由基具有清除作用，而其在染料降解方面的應(yīng)用研究鮮有報道?；诖?，本研究初步探討了紫色馬勃降解孔雀石綠染料的條件，了解其降解特性，為進(jìn)一步開發(fā)利用紫色馬勃和改善染料降解問題提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 紫色馬勃由安徽科技學(xué)院綜合實驗中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂16 g和水1 000 mL。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，磷酸氫二鉀3 g，硫酸鎂1.5 g和水1 000 mL。

1.1.3 試驗試劑 蛋白胨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、蔗糖和瓊脂，均由中國醫(yī)藥上海化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；馬鈴薯購自市場。

1.1.4 試驗儀器 高壓滅菌鍋，北京海峰致遠(yuǎn)科技有限公司；恒溫?fù)u床，上海利聞科學(xué)儀器有限公司；UV-1800PC紫外可見光光度計，濟(jì)南慧紅醫(yī)療設(shè)備有限公司；培養(yǎng)箱，湖南力辰儀器科技有限公司；移液槍，德國Eppendorf有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 孔雀石綠染料的平板降解 在經(jīng)高壓蒸汽滅菌的PDA培養(yǎng)基中加入過濾除菌的孔雀石綠溶液，使其終濃度達(dá)到1.0 g/L，冷卻至50 ℃左右倒入平板，待充分凝固后，無菌操作接入直徑約0.5 cm的紫色馬勃菌塊于平板中央，倒置于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌絲體生長與染料的降解效果。

1.2.2 液體培養(yǎng)方法 將一支已活化的紫色馬勃菌絲體接入250 mL三角瓶中，加入100 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于26 ℃、160 r/min 的搖床中振蕩培養(yǎng)，待液體菌種培養(yǎng)好后，用高速分散器10 000 r/min處理30 s，按10%的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，按設(shè)計加入孔雀石綠染料母液進(jìn)行降解處理。

1.2.3 培養(yǎng)時間對染料降解的影響 將5 mg/mL的孔雀石綠染料母液分別加入到26 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)4、5和6 d的紫色馬勃發(fā)酵液中，使染料的終濃度為100 mg/L，于26 ℃培養(yǎng)箱中振蕩處理，24 h后取樣，以不加染料的發(fā)酵液為對照，測定OD值，并計算降解率ω，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 處理溫度對染料降解的影響 將5 mg/mL的孔雀石綠染料母液加入26 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)4 d的紫色馬勃發(fā)酵液中，使染料的終濃度為100 mg/L，分別于22、26、30和34 ℃的培養(yǎng)箱中振蕩處理，24 h后取樣，以不加染料的發(fā)酵液為對照，測定OD值，并計算降解率ω，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 染料濃度對染料降解的影響 將5 mg/mL的孔雀石綠染料母液分別加入26 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)4 d的發(fā)酵液中，使染料的終濃度分別為50、100、150、200、250和300 mg/L，于26 ℃培養(yǎng)箱中振蕩處理，24 h后取樣，以不加染料的發(fā)酵液為對照，測定OD值，并計算降解率ω，設(shè)3次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)和方法

根據(jù)柏曉冉等[11]的方法，將待測培養(yǎng)液8 000 r/min離心2 min，取上清液，在616 nm波長下測定其OD值，計算降解率ω。在此基礎(chǔ)上考察培養(yǎng)時間、處理溫度和染料濃度對孔雀綠色降解率的影響。降解率計算如式（1）。

ω（%）=（C0-Ct）/C0×100 （1）

式中，C0為剛加染料液的OD值；Ct為加染料t時間后的OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，利用SPSS軟件進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 孔雀石綠染料的平板降解

由圖1可知，紫色馬勃在孔雀石綠終濃度為1.0 g/L的PDA平板上可以生長，但在此濃度下孔雀石綠對菌絲的生長具有一定的抑制作用。隨著培養(yǎng)時間的延長，菌絲生長速度有所提高；同時平板中孔雀石綠的顏色隨培養(yǎng)時間的增加逐漸變淺，說明紫色馬勃可以通過代謝降解該染料。

2.2 培養(yǎng)時間對染料降解率的影響

由圖2可知，培養(yǎng)4、5和6 d的發(fā)酵液處理染料溶液24 h的降解率分別為93.62%、94.62%和90.81%，呈現(xiàn)先升后降的趨勢。4與5 d的降解率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05），但均高于6 d（Plt;0.05）。因此，初步確定培養(yǎng)時間以4 d為宜。

不同小寫字母表示差異在0.05水平上具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 處理溫度對染料降解率的影響

由圖3可知，22、26、30和34 ℃培養(yǎng)的發(fā)酵液處理染料溶液24 h的降解率分別為91.33%、93.50%、96.28%和89.60%，其中30 ℃處理下，降解率最高，與其余組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。說明紫色馬勃發(fā)酵液在不同溫度處理下，對染料降解率均較高，初步確定處理溫度以30 ℃為宜。

2.4 染料濃度對染料降解率的影響

由圖4可知，在26 ℃、160 r/min 下培養(yǎng)4 d的發(fā)酵液中分別加入50、100、150、200、250和300 mg/L的染料，在30 ℃培養(yǎng)箱中處理24 h的降解率分別為99.55%、99.34%、99.21%、98.34%、95.30%和94.78%，呈緩慢下降趨勢。其中50、100、150和200 mg/L的染料降解率明顯高于250和300 mg/L組（Plt;0.05）。因此，確定處理染料濃度以200 mg/L為宜。

3 結(jié)論與討論

真菌對于染料的脫色作用主要依靠兩個過程：吸附和生物降解[11]。菌絲體的吸附能力不僅與底物的親和力相關(guān)，還與染料分子的結(jié)構(gòu)密不可分[12]。染料分子結(jié)構(gòu)變化會影響染料的降解率，不同的染料降解菌對不同結(jié)構(gòu)的染料降解率有較大區(qū)別。杜曉明等[13]研究表明，染料芳香環(huán)上取代基團(tuán)的種類、數(shù)量、位置以及染料分子量的大小均能影響其降解的效果。因此，同一種真菌對不同種染料的降解能力因染料分子結(jié)構(gòu)不同以及真菌本身的降解酶不同而表現(xiàn)出差異性[14]。不同處理時間及溫度均會對真菌的酶活性和反應(yīng)速率產(chǎn)生影響，從而影響其降解率。本試驗研究紫色馬勃對孔雀石綠染料的降解性能，發(fā)現(xiàn)隨著紫色馬勃發(fā)酵液培養(yǎng)時間的延長，降解率呈先增后減的趨勢，可能是該菌在不同的培養(yǎng)時間下，產(chǎn)生的酶量與活性不同導(dǎo)致的；隨著溫度的增加，其降解率呈先增后減的趨勢，可能是在溫度逐漸升高的情況下，發(fā)酵液中的酶活性上升且利于菌絲的生長，因此降解率開始上升。研究還發(fā)現(xiàn)，紫色馬勃對孔雀石綠染料的降解率與初始染料濃度成反比，原因可能是過高的染料濃度對菌絲的生長和產(chǎn)酶量具有抑制作用，同時微生物胞外酶的分泌能力有限，也會導(dǎo)致降解能力下降。紫色馬勃作為生物降解方法，處理染料廢水具有高效、低成本、綠色、適應(yīng)性強(qiáng)和無二次污染等優(yōu)點，有著較好的應(yīng)用前景。但本次試驗是在實驗室環(huán)境下進(jìn)行的，而實際的工業(yè)染料廢水環(huán)境并非是單一環(huán)境，因此會有較多因素對試驗結(jié)果造成影響，如初始pH及一些金屬離子等[15]，這些因素是否會對紫色馬勃的降解性能產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步驗證。

綜上，本研究通過制備紫色馬勃發(fā)酵液，研究其在不同的培養(yǎng)條件下對于孔雀石綠降解率的影響，得出紫色馬勃制備條件為26 ℃，160 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d；孔雀石綠染料濃度為200 mg/L時，在30 ℃溫度下，降解24 h，降解率98.34%。

參考文獻(xiàn)

[1] AFIYA H，AHMET E E，SHAH M M. Enzymatic decolorization of remazol brilliant blue royal （RB 19） textile dye by white rot fungi[J]. Journal of applied and advanced research，2019：11-15.

[2] GUO K Y，GAO B Y，YUE Q Y，et al. Characterization and performance of a novel lignin-based flocculant for the treatment of dye wastewater[J]. International biodeterioration amp; biodegradation，2018，133：99-107.

[3] 肖旭倩，胡正龍，邵廣晴. 細(xì)菌降解三苯甲烷類染料廢水的研究進(jìn)展[J]. 中國資源綜合利用，2019，37（7）：83-85.

[4] 李慶云，韓洪晶. 偶氮類染料廢水處理技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 當(dāng)代化工，2016，45（9）：2217-2220，2223.

[5] PALMA C，CARVAJAL A，VáSQUEZ C，et al. Wastewater treatment for removal of recalcitrant compounds：a hybrid process for decolorization and biodegradation of dyes[J]. Chinese journal of chemical engineering，2011，19（4）：621-625.

[6] 宋金龍，穆迎春，阮志勇，等. 微生物降解三苯甲烷類染料的研究進(jìn)展[J]. 中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017，7（6）：10-16.

[7] 司靜，崔寶凱，戴玉成. 東方栓孔菌在染料脫色中的應(yīng)用及其脫色條件的優(yōu)化[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2011，30（3）：364-371.

[8] SI J，CUI B K. A new fungal peroxidase with alkaline-tolerant，chloride-enhancing activity and dye decolorization capacity[J]. Journal of molecular catalysis B：enzymatic，2013，89：6-14.

[9] 穆雙雙，步洪石，胡德，等. 紫色禿馬勃的生物學(xué)特性[J]. 菌物研究，2020，18（1）：31-36，42.

[10] 朱月，袁樹先，李冰. 紫色禿馬勃水溶性多糖對氧自由基的清除作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（8）：4053-4055.

[11] 柏曉冉，朱孟娟，張少巖，等. 毛木耳對孔雀石綠染料降解條件的優(yōu)化[J]. 菌物學(xué)報，2020，39（6）：1175-1186.

[12] 張富美，侯瑞. 煙管孔菌G11對活性染料的脫色[J]. 菌物學(xué)報，2019，38（9）：1527-1537.

[13] 杜曉明，劉厚田. 偶氮染料分子結(jié)構(gòu)特征與其生物降解性的關(guān)系[J]. 環(huán)境化學(xué)，1991，10（6）：12-18.

[14] 趙振. 白腐真菌對偶氮染料酸性橙7的降解及其產(chǎn)物分析[D]. 杭州：浙江工商大學(xué)，2018.

[15] 司靜，閆志輝，崔寶凱，等. 絨毛栓孔菌菌絲體在無營養(yǎng)條件下對偶氮染料剛果紅的脫色作用[J]. 微生物學(xué)通報，2014，41（2）：218-228.

（責(zé)任編輯：胡立萍）