微型月季‘玲之妖精’的離體培養(yǎng)研究

摘要" 為促進(jìn)微型月季‘玲之妖精’的種苗規(guī)?；a(chǎn)以及后續(xù)利用細(xì)胞工程方法進(jìn)行種質(zhì)改良，以微型月季‘玲之妖精’為試驗材料，利用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行離體培養(yǎng)研究，主要包括不同外植體消毒滅菌處理、愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織增殖、腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)、腋芽繼代增殖以及生根誘導(dǎo)等。結(jié)果表明，葉片外植體合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌5 min，適合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-芐基腺嘌呤（6-BA） 0.5 mg/L+2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D） 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+萘乙酸（NAA） 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L；莖段外植體合適的滅菌方式為75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌8 min，適合腋芽萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，腋芽繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L；生根適宜的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂 6.5 g/L。本研究為微型月季品系改良和遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

關(guān)鍵詞" 微型月季；離體培養(yǎng)；愈傷組織誘導(dǎo)；繼代增殖

中圖分類號" Q813.1" " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A" " " "文章編號" 1007-7731（2025）02-0040-06

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2025.02.008

Research on in vitro culture of miniature Chinese rose ‘Lingzhi Yaojing’

FANG Hefang" " ZHOU Xinping" " KANG Xudong" " PENG Xiaolong" " LI Tongjian" " JIA Mingliang

（Jiujiang University， Jiujiang 332000， China）

Abstract" In order to promote the large-scale seedling production and subsequent germplasm improvement by cell engineering methods， the goblins of miniature Chinese rose ‘Lingzhi Yaojing’ were used as experimental materials to study in vitro culture， including different explants disinfection and sterilization， callus induction， callus proliferation， axillary bud germination induction， axillary bud subculture proliferation， and rooting induction. The results showed that the suitable sterilization method for leaf explants was 75% ethanol disinfection for 30 s+0.1% mercury chloride sterilization for 5 min， and the suitable callus induction medium was MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. Callus proliferation medium was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. The appropriate sterilization method for stem explants was 75% ethanol disinfection for 30 s+0.1% mercury chloride sterilization for 8 min. The medium suitable for axile germination was MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. The subculture proliferation medium for axillary bud was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. The suitable medium for rooting was 1/2MS+NAA 0.1 mg /L+sucrose 30 g/L+agar 6.5 g/L. This study provides a reference for the improvement and genetic transformation of microrose strains.

Keywords" miniature Chinese rose; in vitro culture; callus induction; subculture proliferation

月季為薔薇科薔薇屬多年生觀賞植物，觀賞價值極高。月季品種繁多，其中微型月季是一類適合盆栽及地被栽培的品種，具有較高的市場價值[1]?，F(xiàn)已有諸多關(guān)于微型月季的研究，如馬俊麗等[2]通過研究68種微型月季種質(zhì)資源發(fā)現(xiàn)，其表型性狀間存在差異，品種間變異系數(shù)較高；彭華等[3]對江西地區(qū)引種的微型月季品種進(jìn)行了鑒定評估，認(rèn)為北京紅和紫色美地蘭綜合表現(xiàn)較好；付存念等[4]研究表明，溫州地區(qū)引種的微型月季品種中，人間天堂、羽毛等品種綜合評價較高。此外，關(guān)于盆栽微型月季生產(chǎn)的裝備化[5]和自動化[6]方面也有相關(guān)研究。微型月季種苗的主要生產(chǎn)方式為扦插，對此有諸多報道，如周丹燕[7]研究發(fā)現(xiàn)，微型月季白柯斯特適合扦插的基質(zhì)配比為草炭∶珍珠巖=2∶3；瞿輝等[8]研究表明，萘乙酸（NAA）和吲哚丁酸（IBA）處理對微型月季扦插生根有明顯的促進(jìn)作用；王燕等[9]對華南地區(qū)冬季溫室微型月季扦插母株進(jìn)行補光處理，提高了其插穗品質(zhì)。由于微型月季株型矮小、莖節(jié)數(shù)量較少，因此扦插方式繁殖系數(shù)較低，難以滿足市場需求，因此對其離體培養(yǎng)的研究主要集中在不同的微型月季品種的外植體滅菌、腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)以及增殖和生根等方面[10-12]。‘玲之妖精’是微型月季的典型代表之一，具有植株矮小、花朵大、重瓣和抗病等特點，花朵具有玫瑰香氣，深受人們喜愛。瞿素萍等[13]、彭奎莉等[14]研究表明，不同品種微型月季對培養(yǎng)條件的響應(yīng)既有同一性，又有一定的特異性，因此對其進(jìn)行離體培養(yǎng)具有重要意義，可為‘玲之妖精’種質(zhì)資源的進(jìn)一步開發(fā)和品系改良提供參考。

本文以‘玲之妖精’幼嫩葉片為外植體，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和增殖研究，同時利用帶芽莖段進(jìn)行了腋芽萌發(fā)、增殖及生根誘導(dǎo)成苗的研究，完善了微型月季‘玲之妖精’的離體培養(yǎng)體系，為其品系改良和遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為微型月季‘玲之妖精’植株，外植體選擇無病蟲害且生長狀態(tài)良好的當(dāng)年生半木質(zhì)化中段枝條。將當(dāng)天采摘枝條剪成帶1～2個芽的莖段，將從枝條上剝離的葉片作為葉片外植體，去掉葉片后暴露腋芽的枝條作為莖段外植體，流水沖洗去除其表面污漬，吸去表面殘留水分后，分別置于培養(yǎng)瓶中備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌條件篩選 將清洗好的葉片外植體直接用升汞（0.1% HgCl2水溶液）浸泡滅菌（浸泡時間梯度設(shè)置為3、5、8和12 min），無菌水沖洗6次，得到滅菌后的葉片外植體（編號A1～A4）；將清洗好的葉片外植體采用75%乙醇浸泡30 s消毒，后用無菌水沖洗3次，再用升汞浸泡滅菌（浸泡時間梯度設(shè)置為3、5、8和12 min），最后用無菌水沖洗6次，以洗凈殘留的升汞為準(zhǔn)，得到無菌葉片外植體（編號A5～A8）。莖段外植體采用與葉片外植體相同的滅菌方式，編號B1～B8。滅菌后的外植體接種至培養(yǎng)基[MS+6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8]中培養(yǎng)觀察。14 d后統(tǒng)計污染率和褐化率，并記錄污染和生長情況，計算如式（1）～（2）。

污染率（%）=出現(xiàn)污染的組織塊數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100 （1）

褐化率（%）=出現(xiàn)褐化的組織塊數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100 （2）

1.2.2 葉片愈傷組織誘導(dǎo) 利用1.2.1中篩選得到的合適滅菌條件進(jìn)行葉片滅菌，用無菌濾紙將葉片表面水分吸干后，將其剪成1 cm×1 cm的碎片，而后將碎葉片接種至含有不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和6-BA的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)試驗（培養(yǎng)基為MS+激素組合+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為C1：2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；C2：2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C3：2，4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L；C4：2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L；C5：2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C6：2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L；C7：2，4-D 5.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C8：2，4-D 5.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L；C9：2，4-D 5.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L。接種30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率、褐化率，并觀察愈傷狀態(tài)，計算如式（3）。

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=愈傷組織的誘導(dǎo)個數(shù)/葉柄外植體總數(shù)×100 （3）

1.2.3 愈傷組織增殖及再分化誘導(dǎo) 將1.2.2誘導(dǎo)的愈傷組織與葉片分離，切割后轉(zhuǎn)入愈傷增殖及再分化培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織增殖及再分化誘導(dǎo)（培養(yǎng)基為MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為D1：NAA 0.01 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+噻苯達(dá)唑（TDZ）0.02 mg/L；D2：NAA 0.01 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D3：MS+NAA 0.01 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D4：NAA 0.2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D5：NAA 0.2 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L；D6：NAA 0.2 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 0.02 mg/L。接種30 d后統(tǒng)計再分化誘導(dǎo)率、褐化率，并觀察愈傷增殖情況，計算如式（4）。

再分化誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出芽的組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100 （4）

1.2.4 腋芽萌發(fā)誘導(dǎo) 利用1.2.1中篩選得到的合適滅菌條件進(jìn)行莖段滅菌，用無菌濾紙將莖段表面水分吸干后，將形態(tài)學(xué)上端向上接種至含有不同濃度6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)試驗（培養(yǎng)基設(shè)定為MS+激素組合+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為E1：6-BA 0.5 mg/L；E2：6-BA 1.0 mg/L；E3：6-BA 2.0 mg/L；E4：6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；E5：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；E6：6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。接種21 d后統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率，并觀察生長情況，計算如式（5）。

腋芽萌發(fā)率（%）=萌發(fā)出腋芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100 （5）

1.2.5 腋芽繼代增殖誘導(dǎo) 將萌發(fā)的腋芽與莖段切開，取腋芽接種于叢生芽繼代增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽繼代增殖誘導(dǎo)（培養(yǎng)基設(shè)定為MS+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）。激素濃度組合分別為F1：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；F2：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；F3：6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；F4：6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；F5：6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；F6：6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；F7：6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；F8：6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；F9：6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L。接種30 d后統(tǒng)計增殖倍數(shù)，并觀察生長情況，計算如式（6）。

增殖倍數(shù)（倍）=增殖后的叢生芽數(shù)/接種的組織塊數(shù) （6）

1.2.6 生根誘導(dǎo) 待苗長到2 cm左右，將其切割接種到不同生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)（培養(yǎng)基設(shè)定為基本培養(yǎng)基+激素組合+蔗糖30 g/L +瓊脂6.5 g/L，pH 5.8）?；九囵B(yǎng)基+激素組合編號為G1：MS+NAA 0.1 mg/L；G2：MS+NAA 1.0 mg/L；G3：1/2MS+NAA 0.1 mg/L；G4：1/2MS+NAA 1.0 mg/L；G5：1/4MS+NAA 0.1 mg/L；G6：1/4MS+NAA 1.0 mg/L。接種30 d后統(tǒng)計生根誘導(dǎo)率，并觀察種苗生長狀態(tài)，計算如式（7）。

生根誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出根叢生芽個數(shù)/接種叢生芽總數(shù)×100 （7）

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)用Excel及SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片外植體離體培養(yǎng)

2.1.1 滅菌條件篩選 由表1可知，隨著升汞滅菌時間的延長，葉片外植體污染率逐漸降低，但升汞滅菌8 min及以上的外植體褐化率有所升高。與A1～A4相比，在使用升汞滅菌的基礎(chǔ)上添加75%乙醇浸泡30 s后，污染率整體降低。A6的污染率略高于A7和A8（Pgt;0.05），但其褐化率明顯低于A8（Plt;0.05）。綜合來看，最佳的消毒滅菌處理為A6，即75%乙醇30 s+0.1%升汞5 min。

2.1.2 葉片愈傷組織誘導(dǎo) 由表2可知，6-BA濃度對葉片愈傷組織誘導(dǎo)率和褐化率的影響均較小，以6-BA濃度為0.5 mg/L時，葉片褐化率較低。當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織誘導(dǎo)率較低；隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率呈上升趨勢。2，4-D濃度為2.0 mg/L和5.0 mg/L情況下，葉片愈傷組織褐化率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。從愈傷組織狀態(tài)來看，當(dāng)2，4-D濃度為0.5 mg/L時，愈傷組織較小且致密，為黃綠色，褐化率較高；當(dāng)2，4-D濃度為2.0 mg/L時，愈傷組織變大，致密程度降低，褐化率也降低；當(dāng)2，4-D濃度為5.0 mg/L時，愈傷組織為黃白色或白色，狀態(tài)較疏松，褐化率較低。遵循當(dāng)誘導(dǎo)效果無顯著差異時，選取激素濃度低的組合原則，選取C5（MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）為合適的葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合。

2.1.3 愈傷組織增殖及再分化誘導(dǎo) 由表3可知，本試驗原計劃促成愈傷組織的再分化，但在實際誘導(dǎo)時各培養(yǎng)基均未誘導(dǎo)出芽或根等器官，再分化誘導(dǎo)率均為0。對褐化率和愈傷組織生長狀況進(jìn)行綜合評判，發(fā)現(xiàn)NAA濃度為0.20 mg/L時，褐化率均較低，同時6-BA濃度為2.0 mg/L時，愈傷組織生長旺盛。綜合來看，愈傷組織增殖的合適培養(yǎng)基為D6（MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

2.2 莖段外植體離體培養(yǎng)

2.2.1 滅菌條件篩選 由表4可知，不同消毒滅菌處理莖段外植體的污染率和褐化率趨勢與葉片外植體相似。B7、B8的污染率基本相同，但B7的褐化率明顯低于B8，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。綜合來看，莖段外植體的最佳消毒滅菌處理為B7，即75%乙醇30 s+0.1%升汞8 min。

2.2.2 腋芽萌發(fā)誘導(dǎo) 由表5可知，各種激素組合下腋芽萌發(fā)率均較高，可見月季莖段進(jìn)行腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)較容易，以E5的腋芽萌發(fā)率較高，為90.00%，與除E2、E6外的其余組合差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。生長狀況方面，E2和E5腋芽萌發(fā)成苗生長健壯。綜合萌發(fā)率和生長狀況，腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)的合適培養(yǎng)基為E5（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

2.2.3 腋芽繼代增殖 由表6可知，NAA濃度對腋芽增殖倍數(shù)的影響較小，主要取決于6-BA濃度。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L時，增殖倍數(shù)低于其他處理，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L時，增殖倍數(shù)較F1～F3顯著提高（Plt;0.05），但當(dāng)6-BA濃度繼續(xù)提高時增殖倍數(shù)未出現(xiàn)明顯增長。結(jié)合生長狀態(tài)可看出，各組合除芽數(shù)量差異外，均生長健壯，選取合適的腋芽繼代增殖培養(yǎng)基為F4（MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

2.2.4 生根誘導(dǎo)培養(yǎng) 由表7可知，當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS時，生根誘導(dǎo)率優(yōu)于其他組合，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。NAA濃度較低時，種苗生長狀態(tài)較好。當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS、NAA濃度為1.0 mg/L時，生根誘導(dǎo)率較高，但種苗狀態(tài)較差。總體而言，適合生根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為G3（1/2MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L）。

3 結(jié)論與討論

本文研究了滅菌條件對微型月季外植體污染率和褐化率的影響，確定葉片外植體采用75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌5 min、莖段外植體采用75%乙醇消毒30 s+0.1%升汞滅菌8 min滅菌效果較好。相關(guān)研究表明，不同來源的外植體由于污染情況不一，所用的滅菌時間存在差異，如呂金浮[15]研究表明，利用升汞對微型月季莖段外植體滅菌3 min效果較好；謝曉靜等[16]研究發(fā)現(xiàn)，月季莖段消毒以0.1%升汞溶液消毒10 min較為適宜。

‘玲之妖精’葉片愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，愈傷組織增殖最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+TDZ 0.02 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L。在以上培養(yǎng)條件下可進(jìn)行葉片愈傷組織的增殖，但進(jìn)行再分化誘導(dǎo)時，發(fā)現(xiàn)并無芽或根等器官產(chǎn)生，與馮歡等[17]、苗衛(wèi)東等[18]研究結(jié)果不一致，可能與植物基因型、生理狀態(tài)和培養(yǎng)基成分等不同有關(guān)[19]。

胡軍榮[20]研究表明，低溫處理有利于月季腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)；劉洋等[21]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA、NAA和赤霉素（GA3）的組合對于促進(jìn)月季腋芽萌發(fā)有良好的效果。本試驗為常溫狀態(tài)下對腋芽萌發(fā)進(jìn)行研究，確定適合腋芽萌發(fā)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，其中未添加GA3，后續(xù)可利用低溫以及GA3對于微型月季‘玲之妖精’的腋芽萌發(fā)誘導(dǎo)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

腋芽繼代增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，在此條件下叢生芽增殖5倍以上，具有較好的誘導(dǎo)效果。彭奎莉等[22]添加IBA作為生根激素得到的生根率為83.33％；馮歡等[17]研究表明，在1/4MS+NAA 0.1 mg/L激素條件下可獲得100%的生根率，但相同的條件下，本試驗僅得到5.16%的生根率。本試驗生根誘導(dǎo)效果較好的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂6.5 g/L，生根誘導(dǎo)率總體較低，且在莖段基部容易產(chǎn)生愈傷組織，影響生根效果，后續(xù)研究可選擇合適的基本培養(yǎng)基以及激素配比條件等進(jìn)行生根誘導(dǎo)。

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