Wnt信號(hào)通路在壓力調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片成軟骨響應(yīng)中的作用

黃錦梅，程百祥，馬媛媛，劉曉波，張 旻，陳永進(jìn)

(陜西西安:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，710032;2.西安市第九醫(yī)院口腔科， 710054)

Wnt信號(hào)通路在壓力調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片成軟骨響應(yīng)中的作用

黃錦梅1，程百祥2，馬媛媛1，劉曉波1，張 旻1，陳永進(jìn)1

(陜西西安:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，710032;2.西安市第九醫(yī)院口腔科， 710054)

目的:研究經(jīng)典(Wnt/β-catenin，Wnt)信號(hào)通路在壓力調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)膜片成軟骨響應(yīng)中的作用。方法:體外分離、培養(yǎng)兔BMSCs，經(jīng)鑒定后用含有抗壞血酸的培養(yǎng)基構(gòu)建BMSCs細(xì)胞膜片，并將其隨機(jī)分2組;對(duì)照組在常規(guī)條件下培養(yǎng)4d，實(shí)驗(yàn)組施以120 KPa靜態(tài)壓力，1 h/d、連續(xù)4d。然后通過(guò)Western Blot檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平;Real-time PCR檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因和成軟骨基因的表達(dá)水平。結(jié)果:兔BMSCs傳代后生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定，呈梭形;成骨成脂分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性;Western Blot檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組β-catenin和p-GSK3β蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05);Real-time PCR檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-catenin、p-GSK3β mRNA以及成軟骨相關(guān)基因 Col-Ⅱ、Sox-9、Aggrecan mRNA的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。結(jié)論:Wnt/β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)兔BMSCs膜片在一定的壓力刺激下的成軟骨響應(yīng)過(guò)程。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞膜片;壓力;Wnt/β-catenin;軟骨形成

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2014，24(1):1］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2014，24(1):1］

在人類(lèi)和哺乳動(dòng)物中，關(guān)節(jié)的損傷極其常見(jiàn)［1］，其中關(guān)節(jié)軟骨由于缺乏直接血管供應(yīng)及神經(jīng)支配，其損傷后難以自行修復(fù)［2］。因此，尋找一種能有效修復(fù)缺損軟骨的方法極為重要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有很強(qiáng)的增殖能力及多項(xiàng)分化潛能，現(xiàn)已作為種子細(xì)胞廣泛應(yīng)用于組織工程技術(shù)。有研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激能夠增強(qiáng)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的能力［3］，但其具體生物學(xué)機(jī)制尚不清楚。Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路兩種，其中經(jīng)典Wnt通路是指Wnt蛋白與細(xì)胞表面Frizzled受體家族結(jié)合后的一系列反應(yīng)，其不僅在細(xì)胞的生長(zhǎng)，分化，增殖等過(guò)程中扮演著重要的角色，同時(shí)還影響軟骨細(xì)胞的增殖與分化［4］。然而Wnt信號(hào)通路是否也參與BMSCs在力學(xué)刺激下成軟骨的過(guò)程目前尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察壓力誘導(dǎo)BMSCs細(xì)胞膜片向成軟骨方向分化中Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因、成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)情況，探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路在壓力調(diào)控BMSCs成軟骨響應(yīng)中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

新西蘭純種大白兔(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);改良型α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、胎牛血清(杭州四季青公司);Western Blot IP裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天公司);Trizol(Invitrogene，美國(guó));反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR081A，TaKaRa，日本);Epoch酶標(biāo)儀(Biotech，美國(guó));Real-time PCR儀器(BIO-RAD CFX96，美國(guó));靜態(tài)液壓裝置(本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā));β-catenin多克隆抗體、GSK-3β多克隆抗體、p-GSK-3β多克隆抗體(Bioss公司，美國(guó))。

1.2 兔BMSCs分離培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 兔BMSCs原代培養(yǎng)

取4月齡新西蘭雄性大白兔(體質(zhì)量2.0～3.0 kg)用 30 g/L戊 巴 比 妥 鈉 靜 脈 注 射(1.0 mL/kg)麻醉后，將16號(hào)骨髓穿刺針?lè)謩e于雙側(cè)脛骨平臺(tái)處刺入股骨骨髓腔，并用盛有1 mL肝素鈉(4 000 IU)的注射器抽取雙側(cè)骨髓液約2～4 mL。將抽取的骨髓用PBS稀釋后緩慢滴加于含等體積percoll淋巴細(xì)胞分離液(密度1.073 kg/L)的離心管中，2 000 r/min離心20 min后，吸取分離液界面以上富含單個(gè)核細(xì)胞的乳白色層，并將其轉(zhuǎn)移至另一個(gè)含有PBS的無(wú)菌離心管中，充分混勻后，800 r/min離心7 min，棄上清;沉淀部分用含100 mL/L胎牛血清的改良型α-MEM培養(yǎng)基重懸，制成單細(xì)胞懸液后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置37℃，50 mL/L CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后首次換液并去除未貼壁細(xì)胞，此后每隔48～72 h全量換液，并用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.2 傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶壁約85%時(shí)，用2.5g/L胰酶消化3 min，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞胞體回縮、細(xì)胞間隙增大時(shí)立即加入適量胎牛血清終止消化;然后按1∶2接種于新培養(yǎng)瓶作為第1代(記為P1)，此后每48～72 h全量換液，并以上述相同的方法依次傳代。

1.2.3 BMSCs多向分化能力鑒定

1.2.3.1 成骨分化能力鑒定

取第3代兔BMSCs以2×104/mL的密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，更換成骨誘導(dǎo)液(含1×10-8mol/mL地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL抗壞血酸、100 mL/L胎牛血清的改良型α-MEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，每3d換液1次。誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后棄培養(yǎng)液，分別進(jìn)行茜素紅及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色，觀察細(xì)胞成骨分化情況。

1.2.3.2 成脂分化能力鑒定

取第3代兔BMSCs以2×104/mL的密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，更換成脂誘導(dǎo)液(含 1 μmol/L 地塞米松、10 μmol/L 胰島素、200 μmol/L 吲哚美辛、0.5 mmol/L 異丁基 -1-甲基黃嘌呤、100 mL/L胎牛血清的改良型α-MEM培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)，每3d換液1次。誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后棄培養(yǎng)液，油紅O染色，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞質(zhì)中脂滴形成情況。

1.3 兔BMSCs細(xì)胞膜片的制備

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期第3代兔BMSCs，以2×104/孔的密度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，換用膜片誘導(dǎo)液(含100 mL/L胎牛血清，50 μg/mL抗壞血酸的改良型α-MEM)繼續(xù)培養(yǎng)。每3d換液1次，并用倒置顯微鏡觀察其復(fù)層形態(tài)。誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后從培養(yǎng)皿邊緣緩慢揭起B(yǎng)MSCs膜片，置40g/L多聚甲醛液中固定，甲酸-甲酸鈉復(fù)合脫鈣液脫鈣2～3d，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色觀察。

1.4 壓力刺激下BMSCs膜片中各相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)

采用自行設(shè)計(jì)制作的可控液壓細(xì)胞力學(xué)加載裝置［5-7］，并參照本課題組之前報(bào)道的促 BMSCs成軟骨分化的最適壓力條件和作用時(shí)間［8-9］，對(duì)BMSCs細(xì)胞膜片施以靜態(tài)壓力刺激，觀察壓力刺激下BMSCs膜片中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因、成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組和力學(xué)加載

取2個(gè)鋪有兔BMSCs細(xì)胞膜片的6孔板隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，分別置于加載裝置內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組每天以120 KPa靜態(tài)壓力刺激BMSCs膜片1 h，連續(xù)4d;對(duì)照組不施加壓力，常規(guī)條件下培養(yǎng)4d。

1.4.2 Real-time PCR檢測(cè)各相關(guān)基因的表達(dá)

加載處理4d后，取各組BMSCs細(xì)胞膜片，在預(yù)冷的PBS中輕柔清洗3遍;使用Trizol裂解細(xì)胞并提取總RNA，經(jīng)純度和濃度測(cè)定后將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;然后以cDNA為模板，GAPDH作為內(nèi)參，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)，分別檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-catenin、GSK-3β mRNA以及軟骨相關(guān)基因Aggrecan、Col-Ⅱ、Sox-9 mRNA的表達(dá)情況，并根據(jù)所測(cè) Ct值，以2-△△Ct法計(jì)算各組各基因的mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求;所用引物由上海生工設(shè)計(jì)并合成，各引物序列見(jiàn)表1。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

表1 Real-time PCR引物序列

1.4.3 WesternBlot檢測(cè) Wnt通路相關(guān)蛋白

加載處理4d后取各組BMSCs細(xì)胞膜片，在預(yù)冷的PBS中輕柔清洗3遍;按細(xì)胞裂解液試劑盒說(shuō)明分別提取各組細(xì)胞膜片中的總蛋白，BCA法定量后與5倍上樣緩沖液混勻，并沸水煮5 min制成蛋白樣品;然后依據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行蛋白上樣，SDS-PAGE電泳(濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V，溴酚藍(lán)至膠底部后終止電泳);最后將凝膠中的蛋白在轉(zhuǎn)移電泳槽(200 mA，2 h)中轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluorid，PVDF)膜上，用洗滌緩沖液(Tris-buffered saline and Tween，TBST)配制的含50g/L脫脂奶粉的封閉緩沖液對(duì)PVDF膜搖床封閉2 h后，分別滴加抗兔的β-catenin 1 ∶200)、GSK-3β(1∶200)、P-GSK-3β(1∶200)(Bioss公司)、β-actin(Sigma公司，1∶2 000)的一抗，4℃過(guò)夜;TBST洗PVDF膜3次，用1∶2 000稀釋的二抗室溫條件下封閉2 h;TBST洗脫二抗3次，加入電化學(xué)發(fā)光底物發(fā)光顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像系統(tǒng)觀察，并用Image J軟件分析各個(gè)蛋白條帶的灰度值作為蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兔BMSCs及其細(xì)胞膜片的形態(tài)觀察

原代BMSCs培養(yǎng)48 h后顯微鏡下可見(jiàn)少量細(xì)胞貼壁，展開(kāi)呈梭形或三角形的纖維樣細(xì)胞;7d后集落中的細(xì)胞逐漸相互融合并貼壁生長(zhǎng)(圖1a);傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)趨于穩(wěn)定、形態(tài)均一、分布均勻，其形態(tài)呈長(zhǎng)梭形、多角形或短梭形(圖1b)。第3代兔BMSCs細(xì)胞用膜片誘導(dǎo)液培養(yǎng)14d后，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)，內(nèi)含大量細(xì)胞外基質(zhì)(圖2a);肉眼可見(jiàn)乳白色膜樣物質(zhì)，并可用鑷子提起(圖2b);HE染色可見(jiàn)細(xì)胞膜片大量基質(zhì)紅染，胞核藍(lán)染，呈復(fù)層生長(zhǎng)(圖2c)。

2.2 BMSCs誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果

第3代兔BMSCs成骨誘導(dǎo)21d后，茜素紅染色顯示有礦化結(jié)節(jié)形成(圖3a);堿性磷酸酶染色顯示，胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕紅色顆粒，部分細(xì)胞膜呈紫黑色線狀，堿性磷酸酶表達(dá)陽(yáng)性(圖3b);成脂誘導(dǎo)14d后，油紅O染色顯示，胞質(zhì)內(nèi)有紅色脂滴形成，形態(tài)大小不一(圖3c)。

2.3 兩組Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

Western Blot檢測(cè)顯示，壓力刺激組兔BMSCs細(xì)胞膜片中 β-catenin總蛋白水平為0.971±0.028、GSK-3β 蛋 白 的 磷 酸 化 水 平 為0.866 ±0.021，兩者均高于對(duì)照組(分別為0.586 ±0.01 和 0.658 ±0.023)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(圖4～5)。

2.4 兩組Wnt通路、成軟骨相關(guān)基因表達(dá)水平比較

Real-time PCR檢測(cè)顯示，壓力刺激組兔BMSCs細(xì)胞膜片中經(jīng)典 Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-catenin、GSK-3β mRNA以及成軟骨相關(guān)基因Sox-9、Aggrecan、Col-ⅡmRNA 的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖6～7)。

圖1 兔BMSCs形態(tài)學(xué)觀察(×40)

圖2 兔BMSCs膜片形態(tài)觀察

圖3 BMSCs多向分化能力鑒定

圖4 兩組BMSCs細(xì)胞膜片中β-catenin蛋白含量比較

圖5 兩組BMSCs細(xì)胞膜片中GSK-3β蛋白的磷酸化水平比較

圖6 兩組BMSCs細(xì)胞膜片中Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-catenin、GSK-3β mRNA表達(dá)水平的比較(*與對(duì)照組相比 P ＜0.05)

圖7 兩組BMSCs細(xì)胞膜片中成軟骨相關(guān)基因表達(dá)水平的比較(*與對(duì)照組相比P ＜0.05)

3 討論

軟骨組織工程的基本原理是從機(jī)體獲取少量的活體組織，將功能細(xì)胞從組織中分離出來(lái)，并在體外進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增，然后復(fù)合支架材料和生長(zhǎng)因子，最后形成所需的組織和器官［10］。目前組織工程軟骨的構(gòu)建所需的種子細(xì)胞有:自體軟骨細(xì)胞、異體軟骨細(xì)胞、基因修飾的永生化軟骨細(xì)胞以及各種來(lái)源的干細(xì)胞。BMSCs是由 Friedenstein［11］1976年提出的，因其來(lái)源豐富，獲取方法簡(jiǎn)便易行，并能在誘導(dǎo)因子作用下向軟骨細(xì)胞分化，已被公認(rèn)為軟骨組織工程中理想的種子細(xì)胞。

細(xì)胞膜片(cell sheet)是由Okano等［12］1993 年提出的一種新的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，細(xì)胞膜片制備的關(guān)鍵是通過(guò)多種方式改善種子細(xì)胞的基質(zhì)分泌量，以提高細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的有機(jī)結(jié)合。細(xì)胞膜片生物相容性好、機(jī)械強(qiáng)度合適、細(xì)胞接種率高、基質(zhì)豐富，可構(gòu)建所需的大小和厚度，構(gòu)建的組織更接近于正常組織而廣泛應(yīng)用于組織工程。目前已用該技術(shù)構(gòu)建出組織工程皮膚、血管、角膜等［13-16］。

關(guān)節(jié)軟骨是機(jī)體重要的力學(xué)器官，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)［17］，在適當(dāng)?shù)膲毫Υ碳は拢P(guān)節(jié)腔內(nèi)的液體可通過(guò)相互交換而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的正常代謝;并可促進(jìn)BMSCs向成軟骨方向分化。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，120 KPa/h，連續(xù)4d的細(xì)胞力學(xué)加載條件可較好的促進(jìn)兔BMSCs向軟骨方向分化［8-9］。

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路分為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路和非經(jīng)典信號(hào)通路，各種信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡均起著重要作用［18-21］。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)N-鈣粘蛋白來(lái)調(diào)節(jié)早期骨祖干細(xì)胞成軟骨分化的能力［22］。另有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在阻止軟骨的分化，加強(qiáng)軟骨的成骨和推動(dòng)軟骨的成熟中具有重要意義［23］。而非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路則通過(guò)Wnt5a的介導(dǎo)作用而推動(dòng)軟骨的分化，推遲軟骨從成熟到肥大的階段［24］。Wnt信號(hào)通路中不同蛋白的成軟骨作用也不同，其中β-catenin介導(dǎo)經(jīng)典信號(hào)通路在早期的膜內(nèi)和軟骨成骨的發(fā)展中是必須的，是通過(guò)推動(dòng)成骨的分化和抑制軟骨的形成來(lái)實(shí)現(xiàn)的［23］;Wnt7a是一種軟骨抑制劑［25］;Wnt4和Wnt8能阻止軟骨的分化但可以推動(dòng)其肥大［26-27］;Wnt1和Wnt7a阻止軟骨的分化［28］;Wnt9a即可以阻止軟骨的分化又可以阻止其肥大［29］;Wnt3a、Wnt5a和 Wnt5b 推動(dòng)軟骨的分化而推遲其肥大［27］;Wnt11對(duì)軟骨的分化和肥大無(wú)影響［27］。同時(shí)，Wnts蛋白在成軟骨作用中具有劑量依賴性，有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt14高水平表達(dá)時(shí)可以阻止軟骨細(xì)胞的分化及其在軟骨內(nèi)的成骨分化，而當(dāng)Wnt14低水平表達(dá)時(shí)則不阻止軟骨細(xì)胞的分化［25］。不同的信號(hào)通路在不同的動(dòng)物模型中成軟骨作用也不同，在雞動(dòng)物模型中β-catenin可以阻止軟骨細(xì)胞的分化［30］;在鼠動(dòng)物模型中，經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路抑制軟骨的分化，促進(jìn)骨的形成［31］。在人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)其向軟骨的分化［3-4］。而本實(shí)驗(yàn)中以120 KPa 1 h/d，連續(xù)4d的細(xì)胞加載條件作用于BMSCs后，β-catenin和p-GSK-3β的表達(dá)均明顯上調(diào)，并且成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)也明顯上調(diào)，說(shuō)明適當(dāng)?shù)膲毫Υ碳は驴杉せ钔肂MSCs中的Wnt信號(hào)通路，并可促進(jìn)BMSCs向軟骨分化?？傊?，Wnt信號(hào)通路可通過(guò)不同的Wnt蛋白調(diào)節(jié)不同的信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)軟骨的分化、成熟和肥大。

本實(shí)驗(yàn)觀察了Wnt信號(hào)通路在壓力調(diào)控BMSCs細(xì)胞膜片成軟骨響應(yīng)中的作用，結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)膲毫Υ碳た梢约せ頑MSCs細(xì)胞膜片中的Wnt信號(hào)通路，且使成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)明顯上調(diào)。提示，Wnt信號(hào)通路在BMSCs細(xì)胞膜片的力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

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Role of Wnt signal pathway in chondrogenic mechanotransduction in bone marrow mesenchymal stem cell sheets

HUANG Jin-mei*，CHENG Bai-xiang，MA Yuan-yuan，LIU Xiao-bo，ZHANG Min，CHEN Yong-jin
(*School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China)

AIM:To investigate the role of Wnt/β-catenin pathway in the chondrogenic mechanotransduction in bone marrow mesenchymal stem cell(BMSC)sheets under mechanical pressure.METHODS:BMSCs were separated，cultured and identified in vitro.BMSC sheets obtained by culture with standard medium containing Vitamin C were randomlydivided into blank controlgroup and pressuregroup.BMSC sheets in pressuregroup were treated with 120 kPa hydrostatic pressure for 1h/day for 4 consecutivedays.The Wnt/β-catenin(Wnt)signaling pathway proteins weredetermined by Western blot.The expression of cartilage relatedgenes was examined by real-time PCR.RESULTS:The subcultured rabbit BMSCsgrew well.Osteogenic and adipogenicdifferentiation ability of the cultured BMSCs were confirmed by induction asays.Western blot showed that the protein expression of β-catenin and p-GSK3β in pressuregroup was higher than that in the controlgroup(P ＜0.05).Real-time PCR showed that β -catenin，p-GSK3β and chondrogenic markers of Col-Ⅱ，Sox-9 and aggrecan in pressure-stimulated BMSC sheets were higher than those in the controls(P ＜0.05).CONCLUSION:Wnt/β-catenin pathway plays an important role in chondrogenicdifferentiation of BMSCs under mechanical pressure.

bone marrow mesenchymal stem cell(BMSC)sheets;mechanical pressure;Wnt/β-catenin;chon drogenesis

R780.2

A

1005-2593(2014)01-0001-07

2013-09-07

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31170888)

黃錦梅(1987-)，女，漢族，河北人。碩士生(導(dǎo)師:張旻)

張 旻，E-mail:zhangmin@fmmu.edu.cn

陳永進(jìn)，E-mail:cyj1229@fmmu.edu.cn

口腔醫(yī)學(xué)名詞·學(xué)術(shù)觀點(diǎn)探討