福建無花果細菌性葉斑病的癥狀及病原菌鑒定

摘要：為明確2020年以來在福州市郊區(qū)種植無花果上新發(fā)生的細菌性葉斑病的病因，在果園內(nèi)采集病樣進行病原菌分離純化，利用煙草過敏性反應(yīng)測定、噴霧接種無花果葉片以及柯赫氏法則驗證，明確其致病性；通過對病原菌的形態(tài)特征觀察、生理生化測定，結(jié)合16S rDNA、gyrB 和rpoD 基因序列分析，確定病原菌的分類地位。結(jié)果表明，從病樣中分離純化獲得10株細菌菌株；煙草過敏性反應(yīng)陽性；人工接種結(jié)果顯示，供試細菌可侵染健康的無花果葉片，并產(chǎn)生與田間相似的癥狀，且重新分離到與原菌落形態(tài)相同的細菌，柯赫氏法則證明這些菌株為該病害的病原菌。該病菌在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后，菌落為淡黃色、圓形、扁平；菌體形狀為短桿狀，革蘭氏染色陰性；病菌在KB培養(yǎng)基上能產(chǎn)生綠色水溶性熒光色素；供試菌株的16S rDNA、gyrB 和rpoD 基因序列分析結(jié)果顯示，供試菌株與菊苣假單胞菌（Pseudomonas cichorii）聚為一支；其生理生化和Biolog表型測定結(jié)果以及菊苣假單胞菌特異性引物檢測結(jié)果均與菊苣假單胞菌的模式菌株5707一致。因此將該致病菌鑒定為菊苣假單胞菌（P. cichorii）。這是首次發(fā)現(xiàn)菊苣假單胞菌在自然狀態(tài)下侵染無花果并引起葉斑病。

關(guān)鍵詞：無花果細菌性葉斑??；病原菌鑒定；菊苣假單胞菌；管家基因

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0546

中圖分類號：S663.3

文獻標志碼：A

文章編號：1008?0864（2025）01?0147?08

無花果屬于?？疲∕oraceae）榕屬（Ficus L.），全株都具有較高的利用價值，種植歷史悠久，在我國廣東、四川、福建等地區(qū)均有種植[1]。據(jù)報道，無花果病害主要有無花果疫?。≒hytophthorapalmivora）[2]、炭疽?。–olletotrichum gloeosporioides）[3?4]、細菌性葉斑?。≒seudomonas syringae pv. syringae）[5]和病毒?。‵ig mosaic virus，F(xiàn)MV； Fig badnavirus 1，F(xiàn)BV-1； Fig fleck-associated virus，F(xiàn)Fka V）[6?7]等。2020年在福建省福州市郊區(qū)種植的無花果上新發(fā)生了一種葉斑病，目前，該病發(fā)生較嚴重。新發(fā)病害主要發(fā)生在葉片和莖稈上，初期呈水浸狀，隨后病斑褐變，嚴重時連成一片，最后葉片枯死，田間株發(fā)病率達50%以上，個別果園的發(fā)病率高達100%，給當?shù)毓r(nóng)造成嚴重的經(jīng)濟損失。切取病組織鏡檢，在光學(xué)顯微鏡下可觀察到噴菌現(xiàn)象，初步診斷該病是由細菌引起，從該病害的田間癥狀來看，與?arko等[5]報道的由丁香假單胞菌（P. syringae）引起的無花果葉斑病的癥狀相似，因此疑似該病害的病原菌為丁香假單胞菌。但對采集的病害標本進行細菌分離后發(fā)現(xiàn)，分離細菌的菌落形態(tài)、顏色等與丁香假單胞菌略有差異。為明確該病害的病因，本研究進一步對病原菌進行煙草過敏性反應(yīng)、噴霧接種無花果葉片以及柯赫氏法則驗證，明確其致病性；通過對病原菌的形態(tài)特征觀察、生理生化測定，結(jié)合16S rDNA、gyrB 和rpoD 基因的序列分析，確定病原菌的分類地位，為無花果細菌性葉斑病的機理研究及防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

菊苣假單胞（P. cichorii）5707和Pc-GD-1菌株分別由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所趙廷昌研究員和廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所佘小漫研究員惠贈。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrientagar medium，NA）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（nutrientbroth medium，NB）、金氏B 培養(yǎng)基（King’s Bmedium， KB）、蔗糖還原培養(yǎng)基、葡萄糖培養(yǎng)基、碳素化合物基本培養(yǎng)基的配方均參照方中達[8]的方法，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 病樣的采集及病原菌的分離純化

從福州市郊區(qū)無花果果園中采集疑似無花果細菌性病害的樣品，用平板劃線分離法[8]進行分離純化。

1.2.2 細菌的培養(yǎng)

將純化的菌株接種到NA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落接種至NB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r·min?1振蕩培養(yǎng)24 h后獲得細菌懸浮液，將其調(diào)到OD600=0.8，備用。

1.2.3 致病性測定

采用噴霧接種，以每片葉的正反面噴濕為準，每個處理重復(fù)3次，接種后保濕24 h，第2天開始觀察，并記錄發(fā)病情況。以無菌水處理為對照（CK）。對接種后發(fā)病的病斑進行病原菌的再分離。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌的菌落形態(tài)學(xué)鑒定參照方中達[8]的方法。在透射電子顯微鏡（Hitachi HT7700）下觀察細菌的菌體及鞭毛形態(tài)特征并拍照。

1.2.5 生理生化測定

KB培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生熒光、過氧化氫酶活性、氧化酶活性、精氨酸雙水解、硝酸鉀還原反應(yīng)、吲哚和果聚糖產(chǎn)生、淀粉水解、甲基紅和V-P 試驗、溶解果膠活性、碳素化合物（丙二酸納、麥芽糖、纖維二糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖、棉籽糖、山梨醇、酒石酸鈉、甜醇、丙三醇、香葉醇、甘露醇、葡萄糖、檸檬酸鈉）的利用情況等參照方中達[8]的方法。以菊苣假單胞菌5707菌株為對照菌株。

1.2.6 Biolog 測定

采用Gen Ⅲ Microstationbiolog自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。

1.2.7 分子生物學(xué)鑒定

采用菊苣假單胞的特異性引物Hrp1a/Hrp2a（5’-CCGTTCATCGTCATCGACCT-3’/5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAGF-3’）進行PCR，PCR體系及程序參照Cottyn等[9]方法。采用細菌的通用引物27F/1492R（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’/5’-GGTTACC TTGTTACGACTT-3’）擴增16S rDNA基因，PCR體系及程序參照Lane[10]，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。采用引物rpoD-F/rpoD-R（5’-AAGGCGARATCGAAATCGCCAAGCG-3’/5’-GGAACWKGCGCAGGAAGTCGGCACG-3’）擴增rpoD 基因、采用引物gyrB-F/gyrB-R（5’-MGGCGGYAAGTTCGATGACAAYTC-3’/5’ -TRATBKCAGTCARACCTTCRCGSGC-3’）擴增gyrB 基因，PCR體系和程序參照Sara等[11]方法。采用最大似然法，運用Phylosuite軟件進行基因串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害田間癥狀及發(fā)病情況分析

田間調(diào)查結(jié)果（圖1）顯示，該病害在田間蔓延速度快，主要為害葉片。植株的下部葉片最先受害，然后逐漸向上擴展，致使整株發(fā)?。▓D1A）。葉片受害初期為水漬狀圓形或不規(guī)則小斑點（圖1B），后斑點逐漸擴大，中心變成褐色，周圍有黃色暈圈（圖1C）；隨后病斑逐漸擴展并合并成不規(guī)則形的褐色大斑，嚴重時葉片病斑連成一片，最后葉片枯死脫落（圖1D）。福州市郊區(qū)無花果細菌性葉斑病的田間株發(fā)病率達50%以上，個別果園株發(fā)病率高達100%。

2.2 細菌的分離、純化與致病性測定結(jié)果

采用平板劃線分離法從發(fā)病的無花果樣本上分離獲得10株細菌菌株，編號為W1～W10。將分離獲得的細菌菌株注射接種煙草葉片，24 h內(nèi)均可產(chǎn)生過敏性壞死斑。將分離的細菌菌株回接無花果（本地種）葉片，接種后3 d，葉片開始出現(xiàn)水漬狀斑點，隨著病情的發(fā)展，病斑中央變?yōu)楹稚?，周圍有黃色暈圈（圖2A、B），與田間發(fā)病的癥狀相似；接種無菌水的葉片未發(fā)?。▓D2C、D）。隨后，對回接發(fā)病的病葉進行再分離，均可獲得與接種時相同菌落形態(tài)特征的細菌菌株，說明分離獲得的細菌菌株可使無花果致病，為無花果細菌性葉斑病的病原菌。

2.3 細菌鑒定分析

2.3.1 細菌的形態(tài)特征

供試細菌在NA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)24～48 h后，菌落呈淡黃色、圓形、扁平（圖3A、B）；菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為（0.45～1.45） μm×（2.05～4.45） μm，革蘭氏染色陰性（G?），極生1～7根鞭毛（圖3C）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

分別用細菌16SrDNA 基因和管家基因gyrB 和rpoD 的測序結(jié)果在NCBI上比對。以Escherichia coli 為外群，采用鄰接法構(gòu)建16S rDNA 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4A）顯示，供試菌株與菊苣假單胞菌聚為一支；采用最大似然法對管家基因gyrB 和rpoD 進行聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4B），鑒定結(jié)果與16 rDNA 基因一致，即供試菌株與菊苣假單胞菌聚為一支。進一步用菊苣假單胞菌的特異性引物Hrp1a/Hrp2a 對分離獲得的細菌菌株進行PCR擴增，結(jié)果（圖5）表明，均能擴增出大小約897 bp的特異性片段，與對照菊苣假單胞菌株5707和Pc-GD-1的擴增結(jié)果一致，進一步證明分離獲得的細菌菌株為菊苣假單胞。

2.3.3 生理生化測定

以菊苣假單胞菌菌株5707為對照菌株進行生理生化測定，結(jié)果（表1）顯示，供試細菌菌株在KB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)可產(chǎn)生水溶性綠色熒光，過氧化氫、淀粉水解和氧化酶反應(yīng)為陽性；精氨酸雙水解、硝酸鉀還原、吲哚和果聚糖產(chǎn)生、溶解果膠活性、果聚糖、甲基紅和V-P反應(yīng)為陰性；可利用葡萄糖、甘露醇、丙二酸鈉、丙三醇，不能利用檸檬酸鈉、麥芽糖、纖維二糖、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、海藻糖、棉籽糖、山梨醇、酒石酸鈉、甜醇、香葉醇，與對照菌株5707的結(jié)果一致。因此，將供試菌株鑒定為菊苣假單胞菌。

2.3.4 Biolog測定

由于分子生物學(xué)鑒定和生理生化結(jié)果表現(xiàn)一致，因此隨機挑選W1、W2、W3、W5、W10共5株菌株進行Biolog GN 測試板測定，培育48 h 后，結(jié)果（表2）顯示，供試菌株與數(shù)據(jù)庫中P. cichorii 的相似度最高，相似性為0.721～0.801，進一步證明分離獲得的細菌菌株為菊苣假單胞菌。

3 討論

無花果細菌性葉斑病是自2020年以來在福建省新發(fā)生的一種細菌性病害。本研究通過對該病害的病原菌進行分離純化、致病性測定、生理生化和Biolog 測定、特異性引物檢測、16S rDNA 基因、管家基因gyrB 和rpoD 的序列分析，明確了引起福建無花果葉斑病的病原菌為菊苣假單胞菌。菊苣假單胞菌的寄主范圍廣，可引起多種植物如辣椒[12]、番茄[13?14]、煙草[15]、油麥菜和苦苣[16]、黃瓜[17]、絲瓜[18]、波斯菊[19]、非洲菊[20]、紫蘇[21]、半夏[22]和榕樹[23]等產(chǎn)生葉斑或者枯萎癥狀。本研究結(jié)果顯示，菊苣假單胞菌可侵染無花果并引起葉斑病，也進一步證實該細菌的寄主范圍廣泛。

16S rDNA 是編碼原核生物核糖體小亞基rRNA（16S rRNA）的基因，高度保守，該基因可用于所有細菌屬水平上的鑒定[24]，但很難鑒別出細菌的近緣種[25]。研究表明，用編碼蛋白的基因如gyrB、rpoD、acnB、pgi、pfk、cts、gapA、rpoC 等作為系統(tǒng)發(fā)育鑒定的靶標可有效克服非蛋白編碼基因在鑒定中存在的缺陷[11，25]。其中g(shù)yrB 基因是以單拷貝的形式編碼促旋酶B亞單位的基因，普遍存在于細菌中[26]。Yamamoto等[27]應(yīng)用該基因?qū)賳伟壏N進行鑒別，此后大量的研究證明，該基因能夠用于區(qū)分出革蘭氏陰性細菌如假單胞菌（Pseudomonas）[14]、伯克赫氏菌（Burkholderia） [28]、氣單胞菌（Aeromonas）[29]及革蘭氏陽性細菌如芽胞桿菌（Bacillus）[30]等的近緣種。rpoD 基因是編碼RNA聚合酶δ-70因子的基因，它能把混雜在一起的種區(qū)分開。研究證明，該基因與gyrB 基因聯(lián)合可更好地區(qū)分細菌的近緣種[31]。Yamamoto等[31]研究表明，用gyrB 和rpoD 管家基因聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹比其他管家基因能更有效地區(qū)分假單胞菌（Pseudomonas spp.）。Maeda 等[32]報道，用gyrB 和rpoD 基因可以有效地鑒別伯克赫氏菌（Burkholderia）的6 個近緣種（B. andropogonis， B.caryophylli，B. cepacian，B. plantarii，B. glumae 和B.gladioli）。綜上證明，聯(lián)合使用gyrB 和rpoD 基因能夠有效地區(qū)分假單胞菌、伯克赫氏菌等病原細菌的近緣種。本研究用管家基因gyrB 和rpoD 聯(lián)合構(gòu)建無花果細菌性葉斑病病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，供試細菌菌株與菊苣假單胞菌的遺傳距離最近，進一步證明分離獲得的細菌菌株為菊苣假單胞菌。

本課題組對該病害在福州市無花果種植園發(fā)生情況進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病除在福州市郊區(qū)的無花果種植園發(fā)生外，在福州市連江地區(qū)部分無花果種植園的發(fā)生也較嚴重，個別果園的田間株發(fā)病率超過50%，嚴重的可達90%以上。通過與果農(nóng)交流得知，發(fā)病果園種植的無花果苗木與福州市郊區(qū)的病果園種植的苗木來源相同，這些苗木均由福州市郊區(qū)果農(nóng)自己選育。無花果可通過扦插、壓條、播種等方法繁殖育苗，生產(chǎn)上最常用的育苗方法是扦插法[33]。由于該病害是新發(fā)病害，果農(nóng)因缺乏對該病害的有效辨別，誤選用了帶菌的枝條進行扦插，從而導(dǎo)致選育的部分苗木攜帶病菌，同時通過苗木調(diào)運造成病害傳播流行，發(fā)生為害面積擴大。由此推測，帶菌的苗木是該病害擴大的主要侵染源之一。除此之外，該病害還有哪些侵染源，這需要對病菌的越冬場所、寄主范圍等進一步進行系統(tǒng)研究。

由菊苣假單胞菌引起的無花果細菌性葉斑病是福建無花果的一種新發(fā)病害，對該地區(qū)無花果的種植業(yè)造成嚴重威脅，因此應(yīng)加強對該細菌性病害的監(jiān)測，進一步系統(tǒng)開展病菌的生物學(xué)特性、病害的初侵染來源、發(fā)生流行規(guī)律、防控技術(shù)等研究。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0201106-02）；福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（水果）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系病蟲害防控崗位項目（KKE19005A）；福建省科技特派員工作經(jīng)費項目（KTP21267A）。