番茄CCCH類鋅指蛋白家族的鑒定及其表達分析

摘要：CCCH（C3H）型鋅指蛋白是進化上保守的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，主要與DNA和RNA結(jié)合來調(diào)控基因表達，不僅參與植物的生長發(fā)育和激素調(diào)控過程，同時也響應生物和非生物脅迫。運用生物信息學方法，在番茄（Solanum Lycopersicum）中鑒定出47個SlC3H 基因，不均勻地分布在12條染色體上，主要定位于細胞核中。根據(jù)系統(tǒng)進化樹將其分為3個亞族（Ⅰ～Ⅲ）。共線性分析發(fā)現(xiàn)，SlC3H 基因家族存在基因復制現(xiàn)象，表明在進化過程中SlC3H 基因可能通過復制進行家族成員擴增。番茄SlC3H 基因含有1～14個外顯子，其啟動子區(qū)域存在與激素和非生物脅迫響應的元件。Ka/Ks分析表明，SlC3H 基因家族成員和C3H 基因在進化過程中經(jīng)歷了強烈的進化選擇。qRT-PCR 分析發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，SlC3H 基因家族有一半以上的基因表達上調(diào)，其中SlC3H1 在8 h時表達量最高，是0 h的30倍；用0.1 mol·L?1 2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide，EBR）處理后所有SlC3H 基因在綠熟期都表達上調(diào)，表達量是對照組的8～150倍，尤其是SlC3H28 在其他時期表達量幾乎為0，但在綠熟期其表達量是對照組的150倍，推測EBR對果實綠熟期的發(fā)育有促進作用。上述研究結(jié)果為進一步揭示番茄C3H 基因家族在響應非生物脅迫以及果實發(fā)育中的功能提供了參考依據(jù)。

關鍵詞：CCCH；番茄；生物信息學；表達分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0156

中圖分類號：S641.2

文獻標志碼：A

文章編號：1008?0864（2025）01?0080?16

CCCH（C3H）型鋅指蛋白是進化上保守的RNA結(jié)合蛋白質(zhì)，含有5個串聯(lián)的C3H鋅指結(jié)構域。C3H鋅指轉(zhuǎn)錄因子（zinc finger，Znf）是一種新型的Znf 基因，其編碼的蛋白包含1～6個C3H 類型的鋅指基序，基序特征有3個基序半胱氨酸殘基和1個組氨酸殘基[1-4]。C3H型鋅指蛋白主要與DNA和RNA結(jié)合，從而調(diào)控基因表達，但更多表現(xiàn)出與RNA 結(jié)合的特性，在RNA 加工中起作用[5]。C3H鋅指基序已在人類和酵母的生物體蛋白中發(fā)現(xiàn)[6?7]。在植物中，C3H型鋅指蛋白不僅參與植物的生長發(fā)育、激素調(diào)控[8?9]，同時也參與生物和非生物脅迫的響應[10]。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有11 個C3H家族成員，不僅參與植物對干旱、鹽、冷和脫落酸（abscisic acid，ABA）等脅迫的響應，而且參與調(diào)控花發(fā)育[11]。此外，AtC3H14 和AtC3H15 被證實在擬南芥中調(diào)控次生細胞壁的生物合成，這也意味著它們的同源物可能也參與了擬南芥次生細胞壁的形成[12]。CCCH-ZFP 基因提高了西蘭花對鹽和滲透脅迫的耐受性[13]。水稻（Oryza sativa）中C3H 基因OsDOS 主要通過茉莉酸途徑的負調(diào)控進行過度表達，使葉片延緩衰老[14]。棉花GhZFP1 轉(zhuǎn)基因煙草對鹽、干旱、水楊酸（salicylic acid，SA）脅迫和真菌疾病的耐受性顯著增強[15]。

番茄（Solanum lycopersicum）是我國重要的經(jīng)濟作物之一，發(fā)掘其C3H 基因的潛在功能將為提高番茄產(chǎn)量、品質(zhì)及抵抗逆境脅迫提供重要的理論支持[16]。目前，已在擬南芥、水稻[17]、玉米（Zeamays）[18]、玫瑰（Rosa rugosa）[19]、煙草（Nicotianatabacum）[20]、茄子（Solanum melongena）[21]、蕓苔屬（Brassica）[22?23]、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[24]和葡萄（Vitis vinifera）[25]中進行了全基因組C3H 鑒定，但在番茄中鮮有報道。鑒于此，本研究運用生物信息學方法鑒定番茄C3H 基因家族，研究這些基因的結(jié)構、保守結(jié)構域和組織特異性表達，并從系統(tǒng)進化、染色體分布、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)等方面分析番茄C3H類鋅指蛋白家族成員的特性；同時，分析家族成員基因啟動子順式作用元件，并進行熒光定量分析，為分析C3H參與番茄生長發(fā)育的機理提供理論依據(jù)，為進一步探究C3H類鋅指蛋白在番茄應對非生物脅迫中的功能機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以番茄栽培品種‘M82’為研究材料，種子由新疆農(nóng)業(yè)科學院園藝作物研究所提供。將‘M82’種子清洗后放置培養(yǎng)皿中進行萌發(fā)，挑選長勢一致的番茄幼苗，移入1/2改良型霍蘭格營養(yǎng)液中進行培養(yǎng)，待番茄幼苗長至4葉期用200 mol·L?1的NaCl溶液進行脅迫處理，每個處理3次重復，分別在處理0.0、0.5、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0 h 時采集葉片。另采集膨大期（expansion period，EP）、綠熟期（green ripe period，GRP）、轉(zhuǎn)色期（veraiso period，VP）、紅熟期（red ripe period，RRP）4 個時期的番茄果實作為材料，分別采用0.00（E1）、0.05（E2）、0.10（E3）、0.20 mol·L?1（E4）的外源激素2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide， EBR）處理番茄果實，連續(xù)噴施3 d后再自然生長3 d，于第7天進行果實取樣。為避免相互干擾，每3株設為1個分區(qū)，共有7個區(qū)組，各個區(qū)組之間距離設置為1.5 m。收集的材料放入液氮中速凍，并貯存在?80 ℃冰箱。

1.2 番茄SlC3H 基因家族鑒定

為鑒定番茄中潛在的C3H 家族基因，從番茄基因組數(shù)據(jù)庫（http：//solomics.agis.org.cn/tomato/）下載番茄亨氏1705 基因組數(shù)據(jù)，并通過EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/）獲得擬南芥和煙草的基因組數(shù)據(jù)；然后從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載C3H 結(jié)構域隱馬爾可夫模型（ID：PF00642），并利用Hmmer工具對番茄C3H 全基因組蛋白質(zhì)進行搜索和結(jié)構域比較，E-value≤1×10?5[26]。最后，通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中Conserved Domain Database程序和Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）在線軟件中Search程序?qū)λ蝎@得的蛋白進行驗證。通過Expasy在線軟件（https：//web.expasy.org/tools/）預測番茄C3H蛋白的理化性質(zhì)[27]。采用Wolf Psort II（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進行亞細胞定位預測分析[28]。

1.3 番茄SlC3H 家族基因結(jié)構分析

通過MEGA 7.0軟件中的Muscle對番茄、擬南芥和煙草的C3H 蛋白序列進行比對，并采用鄰接法進行分析，采用最大似然法（maximumlikelihood，ML）構建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap 重復值為1 000，使用在線網(wǎng)站EVOLVIEW（https：//www. evolgenius. info/evolview-v2/）美化進化樹[29]。采用DNAMAN 進行結(jié)構域序列多重比對，利用MEME（https：//meme-suite. org/tools/meme/）進行保守基序分析[30]，通過TBtools 軟件繪制基因結(jié)構圖[31]。

1.4 番茄SlC3H 基因的染色體定位、共線性和Ka/Ks 分析

根據(jù)SlC3H 基因的染色體位置信息，使用TBtools 軟件繪制位置分布圖。其中采用MCScanX 進行番茄和擬南芥C3H 基因以及番茄和煙草C3H 基因的共線性分析[32]；Circos工具用于生成染色體共線性圖[33]；通過Ka/ks工具獲得番茄共線基因?qū)Φ腒a/Ks比值[34]。

1.5 番茄SlC3H 基因順式元件分析

利用TBtools軟件提取SlC3H 基因上游2 000 bp的序列，通過Plant Care 在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子區(qū)域的順式作用元件。最后用TBtools軟件中的HeatMap工具制作表達熱圖。

1.6 SlC3H 基因的qRT-PCR

使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（DP432，北京天根生化科技有限公司）提取處理后番茄的總RNA， 通過BiomarkerScirpt-1stStrandcDNA-SynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京百邁客生物科技有限公司）合成cDNA，利用ChamQSYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行qRT-PCR 反應。根據(jù)番茄C3H 基因家族成員保守基序設計熒光定量引物（ 表1）。qRT-PCR 反應體系20 μL：SuperReal Color PreMix（北京天根生化科技有限公司）10 μL、上下游特異性引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O補到20 μL。PCR程序：94 ℃預變性120s；94 ℃變性5 s，（退火）15 s，72 ℃延伸10 s，45個循環(huán)。以番茄Actin 為內(nèi)參基因。采用3個生物重復和2?△△CT法[35]計算，相對表達量為處理組和對照組的相對值。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlC3H 基因家族成員特征分析

通過全基因組鑒定分析，初步鑒定到47個潛在的SlC3H 基因，依據(jù)家族成員在基因組染色體的位置將其命名為SlC3H1～SlC3H47。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果（表2）表明，SlC3H 家族成員的氨基酸殘基數(shù)為93～1 064個，蛋白分子量為10 025.25～121 235.49 Da，其中SlC3H31 最小，SlC3H20 最大；等電點為4.92～9.52，SlC3H24 最低，SlC3H39 最高；SlC3H 基因家族蛋白均表現(xiàn)為親水性。亞細胞定位預測結(jié)果表明，SlC3H2 和SlC3H13 位于細胞質(zhì)，SlC3H7 位于葉綠體上，SlC3H31 處于細胞外基質(zhì)，其余均位于細胞核內(nèi)。

2.2 番茄SlC3H 基因家族染色體定位分析

染色體定位分析結(jié)果如圖1所示。47個番茄SlC3H 基因家族成員分布在12條染色體上，其中，多數(shù)SlC3H 基因主要分布于Chr3（5個）、Chr1（8個）、Chr6（8個）、Chr10（7個）、Chr11（5個），其余7條染色體上C3H基因家族成員數(shù)量為1～3個。番茄SlC3H基因家族成員在同一條染色體上的分布也不均勻，大多分布在各染色體的上端和下端，除了Chr6、Chr7、Chr10、Chr11和Chr12染色體上的C3H 基因家族成員分布較為集中外，其余染色體上的C3H基因家族成員分布較為分散。

2.3 番茄SlC3H 基因的系統(tǒng)進化分析

為明確C3H 基因的系統(tǒng)進化關系，對擬南芥（AtC3H，50個）、煙草（NtC3H，49個）和番茄（SlC3H，47個）的146個C3H保守結(jié)構域的蛋白序列構建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖2所示。將這3個物種的146個C3H基因劃分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個組，同一組內(nèi)的C3H基因家族成員親緣關系較近。其中Ⅰ組有62個C3H，包含16個SlC3H、24個AtC3H 和22個NtC3H；Ⅱ組有19個C3H 基因，包含6個SlC3H、9個AtC3H和4個NtC3H；Ⅲ組有65個C3H 基因，包含25個SlC3H、17個AtC3H 和23個NtC3H。同時，Ⅰ組又可劃分為Ⅰ-a、Ⅰ-b 2個亞組，分別包含6和10個SlC3H家族成員；Ⅲ組又可劃分為Ⅲ-a、Ⅲ-b 2個亞組，分別有11和14個SlC3H。同一組內(nèi)的基因通常具有相似的功能特征，多數(shù)番茄SlC3H 基因處于Ⅰ組與Ⅲ組內(nèi)。

2.4 番茄SlC3H 基因家族成員基序和基因結(jié)構分析

由圖3 可知，C3H 蛋白有不同的基序類型。所有SlC3H 蛋白都含有motif 1，SlC3H36、SlC3H45、SlC3H30、SlC3H28、SlC3H25、SlC3H44、SlC3H20、SlC3H16、SlC3H23、SlC3H15、SlC3H9、SlC3H31、SlC3H2、SlC3H40、SlC3H21 只含編碼區(qū)（coding sequence，CDS），其他基因既有CDS，又有非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）?；蚪Y(jié)構分析發(fā)現(xiàn)，番茄SlC3H 基因的內(nèi)含子數(shù)為0～14個，其中有5個基因（SlC3H37、SlC3H26、SlC3H5、SlC3H25、SlC3H44）僅含1 個內(nèi)含子，有4 個基因（SlC3H36、SlC3H28、SlC3H45、SlC3H30）不含內(nèi)含子。內(nèi)含子是阻斷基因線性表達的序列，增加了基因的長度，提高了基因間的重組頻率，有利于物種進化并具有調(diào)控作用。有內(nèi)含子的5個SlC3H 基因可能具有某項功能，但對番茄進化作用不明顯；其余4個不含有內(nèi)含子的SlC3H 基因推測其可能不具有調(diào)控作用，且不利于番茄物種進化。結(jié)合進化樹分析可知，處于同一組內(nèi)的基因家族成員親緣關系較近，例如，SlC3H36、SlC3H37、SlC3H5 和SlC3H26 在同一組內(nèi)，具有較近的親緣關系，并且由保守基序可知，這4 個SlC3H 基因具有相似的基因結(jié)構，即同組成員的motif 高度相似。由此可知，同一組內(nèi)成員的關系較近且基因結(jié)構相似，可能具有相似的功能。

2.5 番茄SlC3H 基因家族成員共線性和進化壓力分析

構建番茄SlC3H 基因的共線性圖，結(jié)果（圖4）表明，有7對番茄SlC3H 基因具有同源關系，其成員之間存在共線性關系，分別是SlC3H1 與SlC3H41、SlC3H11與SlC3H18、SlC3H14與SlC3H24、SlC3H19 與SlC3H32、SlC3H30 與SlC3H45、SlC3H35與SlC3H38、SlC3H36 與SlC3H37，其余成員間不存在共線性關系。由上可知，SlC3H 基因家族存在基因復制現(xiàn)象，表明在進化過程中C3H 基因可能通過復制進行家族成員擴增。

為進一步探索C3H 基因家族成員間的進化關系，構建了番茄SlC3H 與擬南芥AtC3H 家族以及番茄SlC3H 與煙草NtC3H 家族的比較共線性圖，結(jié)果（圖5）表明，番茄、擬南芥和煙草中存在直系同源C3H 基因?qū)?，其中番茄與擬南芥之間的同源基因?qū)?shù)量多于番茄與煙草的同源基因?qū)?。由此說明，番茄與擬南芥的C3H 基因家族具有更近的同源進化關系。

為探明物種間SlC3H 基因家族和C3H 基因的進化，計算番茄中SlC3H 基因的復制和共線C3H基因之間的Ka/Ks值，結(jié)果（表3）顯示，6個SlC3H基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，表明SlC3H 在進化時受到純化選擇。由此可知，SlC3H 基因家族成員和C3H 基因在進化過程中經(jīng)歷了強烈的選擇作用。

2.6 番茄SlC3H 基因家族啟動子順式作用元件分析

對番茄SlC3H 基因家族成員的順式作用元件進行分析，按照其功能可分為光響應元件、脅迫響應元件、植物激素響應元件和植物生長發(fā)育元件（圖6）。光響應元件（Box 4、G-box、GT1-Box 4的數(shù)量最多（300個），G-box次之（195個）；SlC3H44 基因中的Box 4元件數(shù)量最多，SlC3H43與SlC3H19 次之；SlC3H38 基因中的G-box 元件數(shù)量最多。Box 4 是參與光反應的一部分DNA模塊，G-box 是參與光反應的順式作用元件，由此推斷，這些基因主要調(diào)控特征與光有關。在脅迫響應元件中，ARE 元件決定調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合與厭氧誘導的表達，其響應元件數(shù)量最多，共142 個，且ARE 元件在所有47 個基因中均被檢測到，這說明番茄SlC3H 基因可能與番茄對厭氧響應密切相關。與干旱相關的MBS元件的數(shù)量排在第2位，共62個，其中有37個啟動子檢測到MBS 元件。低溫（low temperature response，LTR）響應元件共39 個，防御和應激（TC-richrepeats）反應元件共40 個。除此之外還發(fā)現(xiàn)了一些與植物生長發(fā)育有關的元件，其中分生組織表達相關的啟動子元件最多，說明其可能促使細胞進行分裂分化，進而對番茄生長發(fā)育起調(diào)控作用；其他還包括玉米醇溶蛋白代謝（O2-site）、胚乳表達（GCN4-motif）和晝夜節(jié)律（circadian）相關的順式作用元件。

與激素響應相關的順式作用元件有3種，包括脫落酸響應元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）以及水楊酸響應元件（TCA-element）。茉莉酸甲酯能夠促使番茄植株產(chǎn)生防御反應，從而表現(xiàn)出較強的抗病能力，其響應元件最多，共246個；脫落酸能夠有效控制番茄生長、提高抗逆性，其響應元件次之，共154 個；水楊酸既可以誘導番茄細胞分化，又可以參與番茄植株對病原體的抗性，其響應元件最少，共54 個。這說明多種激素可參與調(diào)控C3H 基因的表達，共同促進番茄的生長，提高番茄的抗逆性。

2.7 番茄SlC3H 基因響應鹽脅迫和激素的表達模式分析

鹽脅迫是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要環(huán)境因素，鑒定鹽脅迫相關基因以培育耐鹽品種是目前亟需解決的問題。為了解番茄在鹽脅迫及果實生長發(fā)育處理下SlC3H 基因的表達水平，利用qRT-PCR檢測番茄各器官中SlC3H 基因及其下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，挑選了36個SlC3H 基因進行了qRT-PCR分析，結(jié)果（圖7）顯示，在鹽脅迫下，SlC3H14、SlC3H10、SlC3H8、SlC3H3、SlC3H46、SlC3H7、SlC3H41、SlC3H42、SlC3H43、SlC3H45、SlC3H23、SlC3H24、SlC3H30、SlC3H32、SlC3H35、SlC3H1、SlC3H33和SlC3H26 表達上調(diào)，尤其是SlC3H1 在8h 達到最大值，較0 h 的表達量上升了30 倍；SlC3H27、SlC3H40、SlC3H36 和SlC3H37 表達下調(diào)，推測這4個基因在鹽脅迫下起負調(diào)控作用；剩下的SlC3H2和SlC3H12在鹽脅迫下均勻表達。

為了進一步研究激素脅迫下番茄SlC3H 基因在果實中表達，挑選12個SlC3H 基因進行了qRTPCR分析，結(jié)果（圖8）顯示，在0.1 mol·L?1 EBR處理下，12個SlC3H 基因在綠熟期均表達上調(diào)，表達量是對照組的8～150倍，尤其是SlC3H28，該基因在其他時期的表達量幾乎為0，但在綠熟期其表達量是對照組的150倍。因此，推測EBR對果實綠熟期的發(fā)育有促進作用，其他時期基因都均勻表達。

3 討論

C3H蛋白在植物生長發(fā)育的許多方面發(fā)揮著重要作用。前人對C3H 基因家族成員進行了大量研究，在擬南芥和水稻中分別鑒定出68和67個[17]，柑橘中62個[24]，楊樹中91個[37]，香蕉中89個[2]，煙草中86個[20]，然而在番茄中鮮有報道。對番茄C3H基因進行全基因組分析，有助于更好地了解該基因家族。本研究從番茄基因組中鑒定出47個SlC3H 基因，分析基因結(jié)構發(fā)現(xiàn)，SlC3H基因的內(nèi)含子數(shù)量為0～14個，其中有5個基因僅含1個內(nèi)含子，有4個基因不含內(nèi)含子；序列分析表明，SlC3H 基序高度保守，處于同一亞家族的SlC3H 基因結(jié)構域高度相似，表明這些SlC3H 基因可能具有相似的功能；系統(tǒng)發(fā)育樹分析將47個SlC3H 基因劃分為3個亞族，亞族內(nèi)的C3H基因有較高的同源性，同源基因發(fā)生復制時可能來自同一個祖先，推測其具有相似的功能。

基因復制是導致基因家族快速擴張和進化的主要因素[38]。本研究發(fā)現(xiàn)7對同源基因，其成員之間存在共線性關系，這與香蕉中的9對相似[2]。這一結(jié)果進一步表明，C3H 基因具有高度的同源性，家族成員存在基因復制現(xiàn)象，表明在進化過程中C3H 基因可能通過復制進行家族成員擴增。SlC3H 基因家族成員中有6對同源基因的Ka/Ks值小于1，表明這些基因主要受進化選擇的影響。

順式元件在基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[39]。本研究分析了SlC3H 基因上游2 000 bp啟動子區(qū)域的順式作用元件，檢測到多種與植物生長發(fā)育相關的元件，包括參與細胞周期調(diào)控的順式作用元件、激素響應元件以及與分生組織表達相關的順式作用調(diào)控元件；同時還檢測到與非生物脅迫相關的順式元件，如參與防御和脅迫響應的順式作用元件、參與低溫響應的順式作用元件，以及參與干旱誘導的MYB結(jié)合位點。因此，順式作用元件分析為SlC3H 成員的功能研究，特別是相關基因的調(diào)控和植物在不同脅迫下的發(fā)育提供參考。

本研究運用實時熒光定量PCR 首次對番茄SlC3H 基因家族的表達模式進行了全面分析，結(jié)果表明，在NaCl脅迫時，SlC3H基因家族中有一半以上的基因上調(diào)表達，這與芝麻中的SiC3H1和香蕉中的CCCH-ZFP 表達相似[2，40]，而SlC3H27、SlC3H40、SlC3H36 和SlC3H37 下調(diào)表達，這與水稻中的OsC3H30、OsC3H50、OsC3H52 的表達模式一致[41]，說明它們可能起負調(diào)控作用。擬南芥CCCH類鋅指蛋白還參與激素響應[11，42]，本研究中SlC3H基因在激素處理后表達量發(fā)生變化，說明SlC3H 基因參與番茄果實的生長發(fā)育，同時在0.1 mol·L?1的EBR處理后，SlC3H基因在綠熟期表達量顯著升高，SlC3H28在激素處理后表達量提升了150倍，這與煙草NtC3H39基因的表達模式相似，進一步說明番茄SlC3H 基因家族的功能與擬南芥CCCH類鋅指蛋白相似[43]。

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基金項目：國家自然科學基金項目（32260763）；新疆農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新專項孵化項目（xjkcpy-2021001）。