核轉(zhuǎn)錄因子-κB通路在BQ-123與單肺通氣預(yù)處理兔肺損傷中的作用

徐家行 陳寶鈞 劉勇 張亞楠 殷桂林

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院胸外科（武漢430014）；2中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心胸外科（武漢430070）

單肺通氣指利用人工管道置入患者或?qū)嶒瀯游锏臍夤芗爸夤軆?nèi)，主動將左、右主氣管進行隔離，使患側(cè)或?qū)嶒瀭?cè)肺組織不通氣而萎陷，只使健側(cè)或非實驗側(cè)的肺進行通氣的方法。這種通氣方式是胸外科手術(shù)中為獲得更大的手術(shù)操作空間及更好的手術(shù)視野的一種特殊的呼吸模式[1]。但與此同時，大量實驗及臨床相關(guān)資料表明，在進行單肺通氣后，隨著未通氣側(cè)肺泡組織的萎陷，因其組織形態(tài)及血流動力學(xué)的相應(yīng)改變從而導(dǎo)致未通氣側(cè)肺組織發(fā)生損傷，其損傷程度與單肺通氣時間呈正相關(guān)[2-4]。

在減輕單肺通氣所致肺損傷的研究中，對肺組織進行預(yù)處理較為常見，相關(guān)的預(yù)處理包括藥物預(yù)處理和單肺通氣預(yù)處理[5]。藥物預(yù)處理是指在單肺通氣前進行藥物提前干預(yù)，其中BQ-123是目前在缺血-再灌注領(lǐng)域研究中較熱門的一種藥物。BQ-123是一種內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）受體拮抗劑，理論上其可以通過阻斷血管內(nèi)皮素受體而對肺組織起到保護作用[6-8]。預(yù)處理在干預(yù)缺血再灌注損傷中研究較多，多采用5 min阻斷5 min開放的模式進行干預(yù)[9]。劉文雄等[10]觀察到在肺癌患者開始手術(shù)前將患側(cè)肺進行單肺-雙肺通氣各5 min 3次后，患者肺損傷相關(guān)指標有所好轉(zhuǎn)。筆者受到啟發(fā)后決定對兔使用單肺通氣預(yù)處理，在單肺通氣開始前對實驗兔進行單肺通氣-雙肺通氣各5 min 3次循環(huán)提前干預(yù)，其目的是使萎陷側(cè)肺組織對其后的單肺通氣進行預(yù)適應(yīng)，以期于減輕單肺通氣時肺組織損傷的程度。但是目前關(guān)于單肺通氣所致肺損傷的研究中，與BQ-123及單肺通氣預(yù)處理相關(guān)的研究較少，而且針對于兩者產(chǎn)生相關(guān)作用的信號通路研究更是尚無定論。考慮到核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路是典型的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在調(diào)控多種炎癥因子發(fā)揮重要作用[11-12]，本研究擬通過實驗探討B(tài)Q-123聯(lián)合單肺通氣預(yù)處理對單肺通氣肺損傷保護作用及進一步揭示其與NF-κB信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗主要器材及主要試劑多功能實驗動物呼吸機（EMC2002，北京），3.0帶氣囊氣管插管導(dǎo)管（COVIDIEN Ⅱc，美國），Tunel試劑盒（Roche），General ET ELISA Ki（elkbiotech），Rabbit TNF-α ELISA Kit（優(yōu)爾生），Rabbit caspase-3 Elisa kit（elkbiotech），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（ASPEN），BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（ASPEN），ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ASPEN），Protease Inhibitor Cocktail（Roche）。

1.2 動物及分組本實驗所采用實驗動物為日本大耳白兔，由武漢市萬千佳興生物科技有限公司提供，15只健康清潔級日本大耳白兔（實驗動物許可證號：SCXK（鄂）2016-0011），體質(zhì)量（2.5± 0.3）kg，性別不拘。大耳白兔飼養(yǎng)于醫(yī)院實驗動物房，單籠喂養(yǎng)，調(diào)整室內(nèi)溫度為22～25℃，濕度50%～60%，人工12 h/12 h晝夜周期，自由飲食水。隨機對其分為3組進行實驗（n=5）：O組，通氣條件為單肺通氣2 h，雙肺通氣0.5 h。OP組，行單肺通氣前予以靜脈注射 BQ-123 50 μg/kg[1]，通氣條件同O組。BP組，在給予BQ-123前肺通氣預(yù)處理（單肺5 min，雙肺5 min）× 3，通氣總時間同O組[9]。

1.3 實驗動物模型的建立常規(guī)術(shù)前禁食、禁水，從兔左側(cè)耳緣靜脈注射10%水合氯醛注射液（2 mL/kg）進行麻醉，間斷予以推注肌松劑阿曲庫銨0.1 mg/kg及每40 min靜脈推注10%水合氯醛2 mL維持麻醉。常規(guī)術(shù)區(qū)皮膚去毛、消毒，游離右側(cè)頸靜脈并放置24 G留置針建立靜脈通路，同法游離左側(cè)股動脈并置24 G留置針，外接心電監(jiān)護儀動脈壓力模塊用于監(jiān)測實驗兔動脈有創(chuàng)血壓情況。甲狀軟骨下第3個氣管環(huán)處“T”型切開氣管，插入帶氣管插管導(dǎo)管，連接呼吸機。雙肺通氣時小動物呼吸機參數(shù)設(shè)置如下：呼吸頻率設(shè)置為35次/min，潮氣量設(shè)置為10 mL/kg，吸呼比設(shè)置為1∶1，吸入氧濃度設(shè)置為100%。單肺通氣時小動物呼吸機參數(shù)調(diào)整為：呼吸頻率設(shè)置為40次/min，潮氣量設(shè)置為8 mL/kg，其余參數(shù)同前，并實驗中檢測兔動脈血氣分析，根據(jù)其監(jiān)測的動脈血氣分析結(jié)果調(diào)整小動物呼吸機參數(shù)。單肺通氣時在兔左側(cè)胸壁外側(cè)第6肋間切開長約1 cm觀察左肺萎陷情況，直視下見左側(cè)肺組織由膨脹變?yōu)橥耆菘勺鳛樽髠?cè)單肺通氣模型建立成功。實驗過程中室溫維持在（26±2）℃，實驗中監(jiān)測兔肛溫[13]。

1.4 ELISA法檢測兔肺組織中ET-1、腫瘤壞死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3含量 實驗動物在實驗結(jié)束后通過快速放血法處死，留取左下肺組織大小約1 cm×1 cm×0.3 cm，用生理鹽水反復(fù)沖洗去除殘留血液，將肺組織剪碎并進行勻漿，取其上清液，根據(jù)ELISA試劑盒上的說明書步驟進行操作，使用雙抗體夾心ELISA法測肺組織中的ET-1、炎癥相關(guān)因子（TNF-α）、凋亡相關(guān)因子（caspase-3）。

1.5 采用TUNEL法計算細胞凋亡指數(shù)（apoptoticindex，AI） 取另外一塊同等大小兔左下肺組織，生理鹽水沖洗后10%甲醛溶液進行固定，制成切片保存。取2 μm切片脫蠟并進行水化，PBS溶液沖洗后用蛋白酶K室溫下消化，再用PBS溶液沖洗3次，根據(jù)TUNEL試劑盒上面的說明書步驟進行操作。染色后每張玻片在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機選取5個視野進行觀察，分別記錄視野中細胞核上染有棕黃色顆粒物質(zhì)的細胞及細胞總數(shù)，根據(jù)公式：AI=陽性細胞/細胞總數(shù)×100%，對統(tǒng)計值取平均值[14-15]。

1.6 采用Westernblot法測定兔左下肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平 取同等大小兔左下肺組織標本，予以PBS溶液沖洗去除殘血，剪成小碎塊后加入組織裂解液，勻漿提取肺組織中的總蛋白，以BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定實驗樣品蛋白濃度。使用SDS-PAGE法將組織樣品經(jīng)行電泳，蛋白凝膠電泳檢測組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平，以β-Actin為內(nèi)對照，將膠片進行掃描存檔，圖像經(jīng)過AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值，計算NF-κBp65及IκBα蛋白條帶與β-Actin蛋白像素灰度值比值作為蛋白表達相對水平[16]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)中計量資料以均數(shù)±標準差進行表示，組間整體比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ET-1、TNF-α及caspase-3的含量O組、OP組和BP組之間進行比較，左下肺組織中ET-1、炎癥因子TNF-α及促凋亡關(guān)鍵因子caspase-3含量O組最高，OP組較O組下降，但高于BP組，3組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但OP組與BP組間進行比較，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各肺組織中ET-1、TNF-α及caspase-3的水平比較Tab.1 Comparison of level of ET-1，TNF-α and caspase-3 in the lung tissue of each group（n=5） ± s，pg/mL

表1 各肺組織中ET-1、TNF-α及caspase-3的水平比較Tab.1 Comparison of level of ET-1，TNF-α and caspase-3 in the lung tissue of each group（n=5） ± s，pg/mL

注：標有相同字母表示組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；標有不同字母表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

組別O組OP組BP組F值P值ET-1 153.21±14.20a 128.33±19.48b 113.46±16.74b 7.024 0.010 TNF-α 27.30±3.35a 21.78±2.37b 18.12±2.30b 14.500 0.001 caspase-3 43.96±5.76a 34.22±3.95b 31.56±5.87b 7.678 0.007

2.2 肺組織中細胞凋亡率的變化在400倍顯微鏡下觀察，經(jīng)TUNEL染色后凋亡細胞的核呈棕黃色或深褐色。通過公式計算AI指數(shù)，O組最高，OP組較O組下降，但高于BP組。但通過兩兩之間比較，在OB組、BP組兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 Westernblot實驗測定3組兔單肺通氣肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達 OP組和BP組左下肺組織NF-κBp65表達水平顯著下調(diào)，NF-κBp65與內(nèi)參β-actin的灰度比值分別為OB組、BP組，均顯著低于O組，其中BP組最低，3組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但在OB組、BP組兩者之間比較，兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。OP組和BP組左側(cè)肺組織IκBα表達水平顯著上調(diào)，IκBα與內(nèi)參β-actin的灰度比值分別為OB組、BP組，均顯著高于O組，其中BP組最高，3組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣在OB組、BP組兩者之間比較，兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

表2 各組兔肺組織中AI的比較Tab.2 Comparison of AI in the lung tissue of rabbits of each group（n=5） ±± s

表2 各組兔肺組織中AI的比較Tab.2 Comparison of AI in the lung tissue of rabbits of each group（n=5） ±± s

注：標有相同字母表示組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；標有不同字母表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

組別O組OP組BP組F值P值A(chǔ)I 33.52±3.79a 25.13±6.53b 23.22±4.62b 5.752 0.018

圖1 Western blot法肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達Fig.1 Expression of NF-κBp65 and IκBαprotein in lung tissue with Western blot

表3 各組兔肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of NF-κBp65 and IκBα protein in lung tissue of each group（n=5）±s

表3 各組兔肺組織中NF-κBp65及IκBα蛋白表達水平比較Tab.3 Comparison of NF-κBp65 and IκBα protein in lung tissue of each group（n=5）±s

注：標有相同字母表示組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；標有不同字母表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）

組別O組OP組BP組F值P值NF-κBP65 0.60±0.09a 0.43±0.05b 0.39±0.06b 13.166 0.001 IκBα 0.12±0.08a 0.60±0.15b 0.64±0.12b 29.153＜0.001

3 討論

單肺通氣過程中，肺組織萎陷時，由于失去肺泡表面張力，肺組織出現(xiàn)不同程度損傷[17]。單肺通氣所致肺損傷的本質(zhì)是單肺通氣時機械性因素通過相關(guān)信號通路導(dǎo)致肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，其基本表現(xiàn)是炎癥反應(yīng)。其中，ET-1為目前研究較多的一種肺損傷相關(guān)的重要因子[18]，其主要通過與其受體結(jié)合而實現(xiàn)作用，除收縮血管外，其還有致血管內(nèi)皮細胞纖維化，促進活性氧生成并參加氧化應(yīng)激反應(yīng)。肺組織內(nèi)血管豐富，既有肺循環(huán)的肺動靜脈亦有體循環(huán)的支氣管動靜脈，ET-1含量豐富[19]。本實驗中兔進行單肺通氣，因肺泡萎陷造成肺泡表面張力以及肺內(nèi)血管含氧量的改變，從而導(dǎo)致單肺組織內(nèi)血管形態(tài)及血流的改變。因而發(fā)生肺損傷的組織中，與血管損傷相關(guān)的ET-1含量亦會與損傷程度有關(guān)。而本實驗不僅對單肺通氣肺組織中ET-1含量進行測定，而且實驗中使用ET-1受體拮抗劑BQ-123進行干預(yù)，其主要目的是通過抗ET-1收縮血管效應(yīng)，降低毛細血管通透性并減少炎癥細胞聚集從而對組織起到保護作用。反映單肺通氣后肺損傷嚴重程度的炎癥因子中，TNF-α是目前研究較多的一種[20]。其主要為單核-巨噬細胞分泌的早期炎癥遞質(zhì)，可引發(fā)炎性級聯(lián)反應(yīng)，是炎癥反應(yīng)程度的關(guān)鍵一環(huán)其水平的高低可反應(yīng)組織損傷的嚴重程度，是有效衡量應(yīng)激反應(yīng)的指標。通過本實驗相關(guān)數(shù)據(jù)表明OP組和BP兩組肺組織中ET-1及TNF-α含量較O組均明顯減少，且在BP組中下降更為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，從而可以進一步推論得出，3組實驗動物中，肺組織損傷程度依次下降。

肺損傷的過程中會出現(xiàn)肺組織細胞凋亡，細胞凋亡導(dǎo)致的肺組織細胞丟失可導(dǎo)致肺功能受損，發(fā)生細胞凋亡越嚴重的肺組織內(nèi)，其肺損傷越嚴重。細胞凋亡的主要途徑是死亡受體通路和線粒體通路，兩條通路最終都通過激活caspase-3執(zhí)行凋亡[20]，因而，本實驗擬通過測量不同條件下肺組織caspase-3的含量，從而對單肺通氣后肺損傷程度進行評定。結(jié)果顯示，OP組和BP組中促進凋亡的caspase-3蛋白表達較O組中明顯降低，且BP組降低更加明顯，進一步提示肺通氣預(yù)處理和BQ123減輕了兔單肺通氣后肺細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，TUNEL染色顯示肺泡及血管內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，提示細胞凋亡參與了肺損傷。進一步分析凋亡指數(shù)，OP組和BP組中的AI較O組中明顯降低，且BP組降低更加明顯，這與肺組織caspase-3的含量相一致。

NF-κB信號通路是一種細胞核轉(zhuǎn)錄因子，其中以p50和p65二聚體的形式最為常見，并可與抑制因子IκB結(jié)合。NF-κB信號通路是典型的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB調(diào)控一大類基因的表達，其調(diào)控的靶基因包括細胞因子（如TNFα）等，并在調(diào)控細胞凋亡、炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[22-23]。本研究結(jié)果顯示：O 組肺組織中 NF-κB p65蛋白表達明顯升高，IκB蛋白表達降低明顯，與OB組及BP組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NF-κB p65蛋白表達與上文中所提及的ET-1、TNF-α、caspase-3以及 AI呈現(xiàn)出正相關(guān)，IκB蛋白表達與上文中所提及的ET-1、TNF-α、caspase-3以及AI呈現(xiàn)出負相關(guān)。表明在實驗過程中，BQ-123和單肺通氣預(yù)處理上調(diào)了單肺通氣肺組織IκB蛋白表達，通過NF-κB信號通路，抑制了單肺通氣肺損傷過程中相關(guān)的炎癥反應(yīng)與細胞凋亡。

本實驗中，先使用ET-1受體拮抗劑BQ-123進行預(yù)處理干預(yù)，觀察其在單肺通氣肺損傷中的相關(guān)作用，并在此基礎(chǔ)上進一步采用單肺通氣-雙肺通氣各5 min 3個周期循環(huán)進行預(yù)處理，已期于肺組織提前對單肺通氣進行適應(yīng)，從而進一步減輕單肺通氣時對肺組織的損傷程度。但是，在實驗過程中觀察，雖然3組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但OP組及BP組兩組之間進行比較，兩者之間差異并不大，分析其可能存在的原因是單肺通氣預(yù)處理的對肺損傷保護作用相對BQ-123的預(yù)處理較弱，兩者之間相互疊加作用不明顯。

綜上所述，經(jīng)過BQ-123進行干預(yù)處理后，兔單肺通氣肺損傷明顯減輕，在此基礎(chǔ)上予以單肺通氣預(yù)處理，兔單肺通氣肺損傷得以進一步減輕；相關(guān)數(shù)據(jù)表明，NF-κB信號通路可能在兔單肺通氣肺損傷的發(fā)生與發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用。