基于轉(zhuǎn)錄組和代謝組解析川芎對(duì)鎘脅迫的響應(yīng)機(jī)制

關(guān)鍵詞：川芎；鎘脅迫；轉(zhuǎn)錄組；代謝組

川芎是傘形科藁本屬植物川芎（Ligusticumchuanxiong Hort.）的干燥根莖。作為川產(chǎn)道地藥材，早在公元1153年（宋朝），四川都江堰一帶就有川芎的種植和藥用記錄[1]。目前，川芎的核心道地產(chǎn)區(qū)是四川盆地的彭州、什邡、都江堰、眉山等地，國(guó)內(nèi)90% 以上的商品藥材都來源于此[2]。但近年來川芎在出口時(shí)曾多次因重金屬超標(biāo)問題而被銷毀[3]，重金屬超標(biāo)問題是川芎國(guó)際貿(mào)易壁壘的主要成因。川芎重金屬污染中鎘（Cd）污染尤為突出[4]，而栽培土壤生物及理化特性是導(dǎo)致川芎Cd污染的主要原因[5]。在川芎中，Cd主要富集在其根部以及根莖，Cd脅迫能抑制川芎葉片的光合速率，并顯著降低根莖中阿魏酸和川芎嗪含量[6]。因此，需要利用更多技術(shù)手段來控制中藥材的品質(zhì)安全，使中藥材質(zhì)量達(dá)到穩(wěn)定、有效、安全、可控。

代謝組學(xué)利用氣相色譜- 質(zhì)譜（gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜- 質(zhì)譜（liquid chromatographytandem-massspectrometry，LC-MS/MS）等先進(jìn)技術(shù)研究生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化及其隨時(shí)間的演變[7]，能更好地理解植物受重金屬等逆境脅迫下的生物代謝過程。羅慶[8]利用代謝組學(xué)技術(shù)探究Cd、鉛（Pb）污染下東南景天根系抵御和富集重金屬的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)車前可以通過調(diào)節(jié)糖類和氨基酸類等差異代謝物來響應(yīng)土壤Cd 脅迫[9]。此外，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)也被用來探究植物體Cd脅迫的應(yīng)答機(jī)制。汪京超[10]鑒定出油菜體內(nèi)與Cd吸收和代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和功能基因；王書鳳[11]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選出Cd 累積高效油菜品種P78 和低效油菜品種P72，并闡明了Cd累積高、低效品種響應(yīng)Cd脅迫的主要機(jī)制。

目前，對(duì)中藥材川芎Cd脅迫的研究主要集中在Cd對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化的影響方面，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析方面的研究尚處于起步階段，而有關(guān)吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的基因也未發(fā)現(xiàn)，極大限制了耐Cd新品種川芎的選育。因此，本研究以川芎為試驗(yàn)材料，采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（ultraperformance liquid chromatography tandem massspectrometry，UPLC-MS/MS）技術(shù)測(cè)定代謝組數(shù)據(jù)并解析川芎根莖代謝物的差異表達(dá)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)川芎中Cd轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)同源基因進(jìn)行研究，從基因表達(dá)的角度分析川芎受Cd脅迫后的基因變化規(guī)律，揭示川芎響應(yīng)Cd脅迫的防御機(jī)制，以期為川芎Cd污染耕地種植提供理論依據(jù)與科學(xué)支撐，為川芎資源的合理利用提供方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所篩選的川芎，于2021年9月9日栽種于成都市青白江區(qū)光明村溫室大棚內(nèi)。該研究采用盆栽試驗(yàn)，花盆規(guī)格為42 cm×28 cm×28 cm（上徑×下徑×高），盆栽基質(zhì)按農(nóng)田土∶草炭土∶珍珠巖∶河沙=25∶4∶1∶8的體積比混勻，每盆裝基質(zhì)19 kg，每盆栽種6株川芎。以不添加Cd溶液的清潔土壤為對(duì)照（CK），設(shè)置1（Cd1）、3（Cd3）、6（Cd6）、10 mg·kg-1（Cd 10）共4 個(gè)Cd 脅迫處理水平。CdCl2·2.5H2O（析純?cè)噭┮匀芤盒问绞┤胪寥乐谐浞只靹?，平?周后栽入川芎。在2022年6月21日（即川芎收獲期），快速將川芎根莖挖出并沖去表面泥土后分成2份，分別用于轉(zhuǎn)錄組和代謝組紙標(biāo)的測(cè)定。每個(gè)處理取3株長(zhǎng)勢(shì)相同的川芎（分別用-1、-2、-3表示，如Cd 1的3株材料分別為Cd1-1、Cd1-2和Cd1-3），將其根莖切分、裝袋后放入液氮中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 代謝組測(cè)定及分析 ①樣品制備。將川芎根莖置于40 ℃烘箱中烘干，研磨成粉末后過100目篩。稱取50.00 mg的川芎粉末樣品，加入1.00 mL的提取液（提取液的組成為甲醇：乙腈∶水=2∶2∶1，體積比），維持其內(nèi)標(biāo)水平在20 mg·L?1。通過30 s的渦旋，保證樣品與提取液充分混勻。在45 Hz下添加鋼珠進(jìn)行研磨處理，10 min后將樣品放入冰水浴中進(jìn)行10 min的超聲處理。然后，?20 °C靜置1 h，4 °C、12 000 r·min?1離心15 min，取其上清液500 μL。通過真空濃縮器將分離的代謝產(chǎn)物干燥后加入160 μL提取液（乙腈與水的體積比為1∶1），復(fù)溶后再次超聲離心，得到120 μL的上清液。每個(gè)樣取10 μL混勻，制成質(zhì)控（quality control，QC）樣本用于后續(xù)檢測(cè)[12]。

② 色譜條件。使用Waters Acquity I-ClassPLUS UPLC/Xevo G2-XS Q-TOF 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（沃特世，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行3次測(cè)量。色譜柱為Waters ACQUITITY UPLC高速鋼T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；在負(fù)離子模式下進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)相A為0.1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B為0.1 %甲酸乙腈；進(jìn)樣體積設(shè)置為1 μL。

③ 質(zhì)譜條件。采用Waters Xevo G2-XS Q-TOF高分辨率質(zhì)譜儀（沃特世，美國(guó)）以MSe模式采集一次和二次質(zhì)譜數(shù)據(jù)。低碰撞能量：2 V；離子源溫度：150 °C；高碰撞能量范圍：10～40 V；質(zhì)譜掃描頻率：0.2 s；負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓：?1 500 V；反沖洗氣體流量：50 L·h?1；脫溶氣體流量：800 L·h?1。

④ 方法學(xué)考察。通過觀察QC樣品間內(nèi)標(biāo)峰高與空白樣品中內(nèi)標(biāo)峰條件的差異，判斷儀器是否穩(wěn)定，檢測(cè)過程中是否存在殘留，結(jié)果顯示，內(nèi)標(biāo)在QC樣品中的保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度都比較穩(wěn)定，儀器的數(shù)據(jù)采集穩(wěn)定性很好，空白樣品中除內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品外，未檢測(cè)到明顯的峰。證明該方法可用于本次試驗(yàn)。

⑤ 數(shù)據(jù)分析。采用MassLynx V4.2軟件獲取原始數(shù)據(jù)，利用Progenesis QI軟件對(duì)其進(jìn)行峰提取、峰對(duì)等數(shù)據(jù)分析。利用已建立的Biomark自建庫(kù)以及METLIN數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒別，將理論片段鑒定和質(zhì)量偏差控制在100 ppm以內(nèi)。在此基礎(chǔ)上，將原始峰面積信息與總峰面積進(jìn)行歸一化處理后，利用主成分分析和Spearman相關(guān)分析，對(duì)各組內(nèi)樣品及質(zhì)量控制樣品進(jìn)行可重復(fù)性評(píng)價(jià)。在京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)（kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（human metabolome database，HMDB）和脂質(zhì)圖數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索鑒定出的化合物以獲取分類和途徑信息。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，確定不同組分之間的差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），并計(jì)算其差異顯著性P 值。使用正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structuresdiscriminant analysis，OPLS-DA）模型，篩選出具有顯著性的差異累積代謝物（differential accumulatedmetabolite， DAMs），以FCgt;1、Plt;0.05、變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）gt;1作為篩選指標(biāo)[13]。采用超幾何分布分析方法，分析代謝產(chǎn)物在KEGG通路中的富集情況。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)定及分析 ① RNA提取。使用RNA提取試劑盒（酷來博，北京）對(duì)川芎根莖RNA進(jìn)行提??；利用分光光度計(jì)NanoDrop 2000（賽默飛，美國(guó)）檢測(cè)提取的RNA純度（OD260/280）和含量；采用Agient2100/LabChip GX儀器（安捷倫，美國(guó)）進(jìn)行高精度檢測(cè)以確保RNA完整性。

② cDNA文庫(kù)構(gòu)建。樣本檢測(cè)合格后，利用含有Oligo（dT）的磁珠對(duì)真核mRNA進(jìn)行富集，再添加Fragmentation Buffer 將mRNA 片段隨機(jī)打斷。以獲得的mRNA為模板，分別合成2條cDNA鏈，并對(duì)其進(jìn)行純化。在此基礎(chǔ)上，利用AMPureXP beads進(jìn)行片段篩選，得到240 bp左右的片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得cDNA文庫(kù)。

③ 文庫(kù)質(zhì)控。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）定量文庫(kù)有效水平（文庫(kù)有效水平大于2 nmol·L-1），通過質(zhì)量檢測(cè)后，利用IlluminaNovaSeq 6000（因美納，美國(guó)）進(jìn)行高質(zhì)量測(cè)序，獲得Raw data。經(jīng)過篩選最終得到高質(zhì)量的Cleandata[14]。

④ 序列拼接及功能注釋。將所得到的CleanData采用Trinity軟件進(jìn)行序列組裝拼接，利用DeBruijn 圖識(shí)別各個(gè)片段集合中的轉(zhuǎn)錄本序列（transcript）。Unigene序列通過與NR、Swiss-Prot、COG、KOG、eggNOG4.5、KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，整合數(shù)據(jù)庫(kù)分析得到基因的注釋結(jié)果。

⑤ 差異表達(dá)分析。用FPKM 分析基因表達(dá)量，與Unigene庫(kù)進(jìn)行對(duì)比。使用DESeq2軟件進(jìn)行差異分析，對(duì)得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝組學(xué)分析

2.1.1 差異累積代謝物統(tǒng)計(jì) 由圖1A可知，在不同Cd 處理水平的川芎根莖中，共標(biāo)注和定量了1 238種差異累積代謝物（DAMs），根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可分為氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸、酮類、糖類、酰胺類和其他共7大類。與CK相比，Cd1、Cd3、Cd6、Cd10處理的DAMs總數(shù)分別為283、252、172、531個(gè)，其中上調(diào)代謝物數(shù)目均高于下調(diào)代謝物數(shù)目。Cd10處理的DAMs 最多，包括346 個(gè)上調(diào)代謝物和185個(gè)下調(diào)代謝產(chǎn)物； Cd6處理的DAMs最少，包括111個(gè)上調(diào)代謝物和61個(gè)下調(diào)代謝物。

對(duì)DAMs進(jìn)行分析，由圖1B韋恩圖可知，CKvs Cd1 與CK vs Cd10 共有DAMs 數(shù)量最多，為134個(gè)，而4組共有差異代謝物僅為14個(gè)。這14種差異代謝物包括泛酸鹽、1-O-阿魏-D葡萄糖、多邊形內(nèi)酯、多球殼菌素、阿非迪霉素、亞油酸等。

2.1.2 不同處理間差異代謝物分析 利用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）發(fā)現(xiàn)（圖2），CK的根莖樣品可以從Cd處理組中顯著分離出來。其主要貢獻(xiàn)來自 Cd10處理的531種代謝物（其中185種上調(diào)，346種下調(diào)），造成差異的主要原因是其他氨基酸的代謝、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝。與CK相比，Cd10處理中所有氨基酸，包括丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸均上調(diào)，而泛醌和其他萜類醌下調(diào)。

2.1.3 KEGG代謝途徑分析 將鑒別代謝物注釋入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得76條代謝通路。由圖3可知，在Cd10處理組的531種代謝物中，乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、氨基酸代謝、氨酰基-tRNA的生物合成等通路顯著富集（Plt;0.05）。Cd1處理組的283種代謝物中，上調(diào)的主要代謝通路包括檸檬酸循環(huán)、甘油磷脂代謝等。在Cd3處理組的252種代謝物中主要上調(diào)的通路有纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解通路，賴氨酸生物合成通路；主要下調(diào)的通路有纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成通路，脂肪酸生物合成通路等。Cd處理組172種代謝物中上調(diào)的通路有煙酸鹽和煙酰胺代謝通路，丙酮酸代謝通路，丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝通路；主要下調(diào)的通路有丙酸鹽代謝通路，精氨酸生物合成通路等。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組序列分析 對(duì)不同水平鎘脅迫下的川芎樣品進(jìn)行測(cè)序（表1），共得到97.46 Gb Cleanreads，各個(gè)樣品的Clean reads 達(dá)到5.77 Gb，其中CK 處理組共有73 976 690 條； Cd1 處理組共有67 688 858條；Cd3處理組共有61 710 731條；Cd6處理組共有63 874 313 條；Cd10 處理組共有60 114 700條?？倝A基數(shù)為97 461 585 558 nt，各樣品的GC 含量占比均不低于43.61%，其中Q30堿基所占比例不低于93.05%。

2.2.2 文庫(kù)構(gòu)建及Unigene功能注釋 經(jīng)過組裝后，共獲得42 069條Unigenes，其中長(zhǎng)度在2 000 bp以上的Unigene數(shù)量最多，占32.19%。Unigene總長(zhǎng)度為69 203 497 bp，平均長(zhǎng)度為1 645 bp。UnigeneN50長(zhǎng)度一般用于評(píng)估組裝結(jié)果質(zhì)量，當(dāng)UnigeneN50≥800 bp時(shí)，認(rèn)為組裝序列的完整性較好。本研究中Unigene N50長(zhǎng)度為2 876 bp，表明川芎樣品的組裝完整性較好，可用于后續(xù)的試驗(yàn)分析。通過數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共注釋到36 336條Unigenes（表2），其中注釋率最高的是NR 數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋Unigenes 有34 643條，占總注釋Unigenes的95.34%。

2.2.3 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì) 如表3所示，本研究共篩選到8 569 個(gè)差異表達(dá)基因（differentiallyexpressed genes， DEGs），其中上調(diào)基因有6 859個(gè)，下調(diào)基因有1 710 個(gè)。在CK vs Cd3中篩選到的DEGs數(shù)量最多，為5 703個(gè)，包括上調(diào)基因4 205個(gè)和下調(diào)基因1 498 個(gè)；DEGs 數(shù)量最少的是CK vsCd10組，共得到195個(gè)DEGs，包括150個(gè)上調(diào)基因和45個(gè)下調(diào)基因。

2.2.4 不同處理間差異表達(dá)基因分析 對(duì)DEGs進(jìn)行分析，由圖4可知，CK vs Cd1與CK vs Cd3共有DEGs 為875 個(gè)，CK vs Cd1 與CK vs Cd6 共有DEGs 為137 個(gè)，CK vs Cd1 與CK vs Cd10 共有DEGs 為76個(gè)，而3組共有DEGs僅為22個(gè)；CK vsCd3 與CK vs Cd6 共有DEGs 為 42 個(gè)，CK vs Cd3與CK vs Cd10 共有DEGs 為 51 個(gè)，CK vs Cd6 與CK vs Cd10共有DEGs為 49個(gè)，而4組共有DEGs僅有1個(gè)，為CML19。

2.2.5 KEGG通路注釋分析 通過KEGG對(duì)川芎根莖4個(gè)不同處理組DEGs進(jìn)行富集分析（圖5），有4 025個(gè)DEGs被注釋到167條KEGG代謝通路中。顯著性富集分析表明，CK vs Cd3有20 條達(dá)到顯著水平（Plt;0.05），包括碳代謝、磷酸戊糖途徑、糖酵解/糖異生、氨基酸生物合成、丙酮酸代謝、酪氨酸代謝等通路；CK vs Cd1中基因數(shù)目相對(duì)較多的代謝通路是核糖體代謝；CK vs Cd6 中相關(guān)基因數(shù)目相對(duì)較多的代謝通路有甘油脂代謝、亞麻酸代謝、植物?病原體互作等；CK vsCd10中相關(guān)基因數(shù)目相對(duì)較多的代謝通路有戊糖和葡萄糖醛酸互轉(zhuǎn)化、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、植物?病原體互作等。

2.3 轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析

為更好地探究川芎抵抗Cd脅迫時(shí)的作用機(jī)制，將差異代謝物與差異基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，4個(gè)不同處理組共注釋得到24條通路。CK vsCd1 中共有10 條通路，其中碳代謝通路共連接73個(gè)DEGs和DAMs，數(shù)目最多；CK vs Cd3有10條通路，碳代謝連接的最多，為144個(gè)，其次是氨基酸生物合成，有116個(gè)；CK vs Cd6中連接最多的是酪氨酸代謝，共5個(gè)；CK vs Cd10中苯丙烷類生物合成與ABC 通道轉(zhuǎn)運(yùn)均連接7 個(gè)DEGs 和DAMs。碳代謝與ABC通道轉(zhuǎn)運(yùn)通路僅在Cd6處理組未見。4組處理共有通路有1條，為氨基酸生物合成，主要積累丙氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸等氨基酸。

3 討 論

3.1 氨基酸是川芎在Cd 脅迫下的標(biāo)志性物質(zhì)

代謝調(diào)節(jié)是植物應(yīng)對(duì)各種脅迫的重要機(jī)制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸類在川芎根系抗Cd脅迫中發(fā)揮重要作用，它們所占的比例較大，并參與了不飽和脂肪酸、異喹啉生物堿、氨?；?tRNA和酪氨酸的生物合成，這與在Cd脅迫時(shí)水稻幼苗中的研究結(jié)果一致[15]。紫花苜蓿葉片在響應(yīng)漬水脅迫時(shí)顯著上調(diào)丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等[16]，而川芎在受到Cd脅迫時(shí)主要上調(diào)丙氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、酪氨酸和色氨酸等生物合成，說明植物受到非生物脅迫時(shí)，可能產(chǎn)生部分相同氨基酸來應(yīng)答逆境脅迫。特定氨基酸及其代謝可提高植物受到逆境脅迫時(shí)的耐受性[17]，通過轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，其共有通路為氨基酸生物合成，主要積累丙氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸等氨基酸。組氨酸可以調(diào)節(jié)其他氨基酸的生物合成以及金屬離子的螯合和轉(zhuǎn)運(yùn)[18]；馬洪娜等[19]認(rèn)為，苯丙氨酸不僅提供了抗氧化劑還為朱砂根葉片適應(yīng)鈣脅迫提供能量；絲氨酸是合成蛋白質(zhì)和其他生物分子所必需的，包括核苷酸和絲氨酸衍生的脂類（如磷脂酰絲氨酸和鞘脂），并參與抵抗各種外界刺激[20-22]。其中，絲氨酸在輕度Cd 脅迫（1、3 mg·kg-1）中上調(diào)更大；丙氨酸在中（6 mg·kg-1）、重度（10 mg·kg-1）Cd脅迫時(shí)的上調(diào)貢獻(xiàn)較大，說明在不同的Cd脅迫水平下，川芎根莖中氨基酸的抗Cd脅迫模式不同。因此，氨基酸類物質(zhì)可能是用于鑒別川芎根莖是否受到不同程度Cd脅迫的標(biāo)志性物質(zhì)。

3.2 Cd 脅迫對(duì)川芎糖類代謝和脂質(zhì)代謝的影響

本研究顯示，川芎在受到Cd脅迫后的差異基因主要參與了糖類、氨基酸、脂類生物合成等代謝途徑，這與玉米、菜心等植物受到Cd脅迫后的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相似[23-24]。在植物受到非生物脅迫時(shí)，將累積糖類物質(zhì)以適應(yīng)環(huán)境的變化[25]。糖類的積累可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，以維持細(xì)胞的滲透平衡[26]。在受到干旱脅迫時(shí)，植物通過運(yùn)輸蔗糖至根尖部位來抵御脅迫，維持正常生長(zhǎng)[27]；Cd脅迫下，冬小麥根中水蘇糖、蔗糖和甘露糖含量增加[28]；Cd脅迫下的水稻中糖類含量也表現(xiàn)出相上升趨勢(shì)[29]。而本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)川芎受到3 mg·kg-1 Cd脅迫時(shí)，根莖中的蔗糖含量呈現(xiàn)出顯著增加的趨勢(shì)，說明川芎通過積累糖類來調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，維持細(xì)胞的滲透平衡并減少Cd對(duì)自身的危害。

脂質(zhì)代謝作為植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中的基本代謝之一，是重要的儲(chǔ)能物質(zhì)和信號(hào)分子[30]。在受到低溫脅迫時(shí)，小麥根尖中的不飽和脂肪酸含量增加，有利于提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性，以適應(yīng)外界的低溫環(huán)境[31]。本研究中，Cd脅迫下川芎可能通過增加脂肪酸、亞麻酸、甘油酯等代謝物的含量來增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，以適應(yīng)外界的Cd 脅迫環(huán)境。

3.3 川芎抗Cd 脅迫的關(guān)鍵基因CML19

對(duì)差異基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CML19 在每個(gè)Cd處理組中表達(dá)都上調(diào)，推測(cè)CML19 可能為川芎抗Cd 的關(guān)鍵基因。研究表明，類鈣調(diào)蛋白（calmodulin-like protein，CML）是植物細(xì)胞中的鈣離子結(jié)合蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要功能[32]。CML9 突變體能提高擬南芥對(duì)干旱和鹽害的耐受性，并產(chǎn)生支鏈氨基酸的積累[33-34]；CML13 對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)非常靈敏，其在無(wú)苞芥響應(yīng)逆境生理生態(tài)環(huán)境中可能起著重要作用[35]；在受到鹽脅迫時(shí)，AtCML37、AtCML38 和AtCML39 基因均上調(diào)表達(dá)[36]。

綜上所述，川芎通過調(diào)節(jié)糖類代謝、脂質(zhì)代謝來響應(yīng)Cd脅迫，以減少對(duì)自身的傷害。通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸類可作為川芎受Cd脅迫時(shí)的標(biāo)志性物質(zhì)，而丙氨酸、絲氨酸等氨基酸則可用于判斷川芎受Cd脅迫程度大小。川芎受Cd脅迫時(shí)的差異基因CML19 與已有研究中有關(guān)作物調(diào)節(jié)Cd脅迫的關(guān)鍵基因相似，可能是川芎響應(yīng)Cd脅迫的關(guān)鍵基因。在未來，可以對(duì)CML19進(jìn)行進(jìn)一步的克隆與功能鑒定，將有助于進(jìn)一步闡明川芎對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)以及產(chǎn)生差異的分子機(jī)制。