谷子苗期氮高效轉(zhuǎn)錄組分析與基因挖掘

關(guān)鍵詞：谷子；氮高效；轉(zhuǎn)錄組學；氮高效基因

谷子（Setaria italica Beauv.）是由狗尾草長期馴化而來的一年生禾本科栽培作物，距今已有1萬多年的栽培歷史[1]。由于其具有較強的適應性及良好的礦質(zhì)營養(yǎng)吸收特性，常被作為土壤貧瘠地區(qū)的栽培作物，并逐漸發(fā)展成為我國重要的雜糧作物。氮是作物生長發(fā)育所必需的重要元素，也是土壤最為缺乏的營養(yǎng)元素[2]，施用氮肥是提高作物產(chǎn)量的重要途徑之一[34]。然而，近年來人們?yōu)榱藢崿F(xiàn)高產(chǎn)，盲目過量施用氮肥，造成了嚴重的資源浪費和土壤污染問題，其主要原因是氮肥的利用率太低[5]。因此，如何提高作物的氮吸收利用效率成為解決這一系列問題的關(guān)鍵[67]。

目前，因谷子種植面積相對小麥等大作物較小，又多種植在旱薄地，對谷子氮高效利用的研究大都集中在耐低氮品種篩選及低氮脅迫對谷子生長及產(chǎn)量的影響方面[8-17]。梁興萍等[9]以來自山西干旱、半干旱地區(qū)的70個谷子品種為試材，以葉綠素含量和株高為評價指標，篩選出谷子耐低氮品種8份。黃興東[10]采用大田和苗期盆栽相結(jié)合的方法進行研究，發(fā)現(xiàn)低氮脅迫對谷子苗期苗高、根長、氮累積量和成株期的相對穗重、相對草重和相對粒重有不同程度影響。時麗冉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下，不同谷子品種的苗高、生物量、氮累積量均有不同程度的降低，氮利用效率升高。

轉(zhuǎn)錄組研究通過測序技術(shù)揭示同一細胞在不同生長時期及生長環(huán)境下基因表達情況的差異，目前應用廣泛[18]。在逆境處理下，植物可通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來提高植物對逆境的耐受力，通過轉(zhuǎn)錄因子表達差異分析可獲得更全面的生物學信息[19-21]，對揭示植物相關(guān)逆境適應機理具有重要的意義[22]。丁慶倩等[23]通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出1個在低氮脅迫條件下明顯上調(diào)的MYB類轉(zhuǎn)錄因子基因SiMYB42，其主要在谷子的根與葉表達，定位于細胞膜與細胞核內(nèi)，可能通過調(diào)控下游硝酸鹽轉(zhuǎn)運體基因NRT2.1、NRT2.4 和NRT2.5 的表達來提高谷子對低氮的耐受性。楊瑞[24]通過轉(zhuǎn)錄組測序鑒定出1個LIM型基因SiWLIM2b，在低氮脅迫處理下上調(diào)表達，在干旱脅迫下下調(diào)表達，該基因在低氮脅迫過程中通過促進氨的同化而發(fā)揮作用。

作物基因功能調(diào)控網(wǎng)絡復雜，解析多個協(xié)同基因和信號通路之間的相互作用是谷子氮高效利用研究所面臨的挑戰(zhàn)。本研究以氮高效和低效品種為試驗材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）技術(shù)篩選與氮高效相關(guān)的重要候選基因和信號通路，揭示谷子氮高效調(diào)控分子機制，為氮高效品種選育和遺傳改良提供理論基礎(chǔ)及基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在河北省農(nóng)林科學院谷子研究所試驗基地進行。供試材料為前期篩選得到的谷子氮高效品種濟谷22（HNI）、豫谷28（HNII）和氮低效品種濟谷15（LNI）、冀谷31（LNII），由河北省農(nóng)林科學院谷子研究所提供。

1.2 試驗設計

試驗在溫室內(nèi)采用蛭石澆灌營養(yǎng)液養(yǎng)苗法進行。選取飽滿一致的種子，采用10%（體積分數(shù)）的H2O2消毒，30 min后相繼用蒸餾水、去離子水洗凈，在裝有蛭石的塑料花盆中播種。采用改良Hoagland營養(yǎng)液進行苗期培養(yǎng)，每3 d更換1次營養(yǎng)液，每次澆灌前用去離子水進行完全沖洗。設置3個處理的營養(yǎng)液：0、3、6 mmol·L-1，分別用N0（對照）、N3、N6 表示。采用改良Hoagland 營養(yǎng)液（表1）培養(yǎng)幼苗，溫室培養(yǎng)環(huán)境光照為14/10 h（光/暗），溫度為28/22 ℃（晝/夜），相對濕度40%～60%。培養(yǎng)至兩葉一心期，幼苗分成兩部分，一部分用于分析谷子幼苗對氮吸收速率的差異，另一部分用于轉(zhuǎn)錄組分析與基因挖掘。

1.3 氮吸收速率的測定

將兩葉一心期谷苗轉(zhuǎn)入低氮水平下（LN：0.75 mmol N·L-1）培養(yǎng)8 d，將谷子根系用蒸餾水沖洗后，再放入1 mmol·L-1 的CaSO4 溶液中浸洗1 min。浸洗好的谷子根系轉(zhuǎn)移到含有200 mmol·L-1（15NH4）2SO4（豐度99.03 atom%，化學純度≥98.5%，上?；ぱ芯吭河邢薰荆┗?00 mmol·L-1K15NO3（豐度99.03 atom%，化學純度≥98.5%，上?；ぱ芯吭河邢薰荆┑奈杖芤褐?0 min。在經(jīng)過60 min的同位素培養(yǎng)后將植株取出，收獲前再次用1 mmol·L-1 CaSO4 溶液沖洗根系1 min，并在70 ℃下干燥48 h。用同位素比值質(zhì)譜法[25]（DELTA plus XP，hermo Finnigan）檢測根系中的15N積累。每個處理設置3個重復。

1.4 總RNA 提取與轉(zhuǎn)錄組測序

試驗設置3個氮素處理：0、3、6 mmol·L-1，每個處理設置3個重復。在谷苗兩葉一心期進行處理，7 d后采集不同谷子品種地上部混合樣品2 g，液氮速凍后保存于-80 °C，用于轉(zhuǎn)錄組測序。利用TaKaRa 全RNA 提取試劑盒提取RNA，采用poly-A 尾富集的方式進入Illumina HiSeq 2000平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。所得原始數(shù)據(jù)（raw data）經(jīng)過過濾得到純凈數(shù)據(jù)（clean data），純凈數(shù)據(jù)再與指定參考基因比較得到比對數(shù)據(jù)（mapped data），將樣品處理兩兩比較得到差異基因。差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）表示兩（組）樣品間表達量的比值。采用公認的Benjamini-Hochberg校正方法對原有假設檢驗得到的顯著性進行校正，并最終采用錯誤發(fā)現(xiàn)率（1 discoveryrate，F(xiàn)DR）作為差異表達基因篩選的關(guān)鍵指標。在差異表達基因檢測過程中，將FC≥2且FDRlt;0.001作為篩選標準。對差異表達基因進行GO功能富集及KEGG通路富集分析，從而獲得與差異基因?qū)牡鞍坠δ茏⑨尲肮δ芊诸惤y(tǒng)計。轉(zhuǎn)錄組測序及分析委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 差異表達基因?qū)崟r熒光定量PCR（RTqPCR）驗證

為了驗證谷子氮高效轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準確性，從差異基因數(shù)據(jù)庫中篩選出3 個基因，利用Primer 6.0設計引物（表2），以SiActin 為內(nèi)參進行RT-qPCR，驗證與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的一致性。RTqPCR設置3 次生物重復，每個生物重復設置3次技術(shù)重復，基因表達量使用2-ΔΔCT方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮水平處理下不同谷子品種的表型差異

對不同氮水平下4個谷子品種苗期表型差異進行分析（圖1）發(fā)現(xiàn)，無論低氮還是正常氮處理，氮高效品種豫谷28的株高值最大。在低氮處理下所有品種的株高均出現(xiàn)降低，與正常氮處理相比，低氮處理下4個品種株高分別降低39.0%（冀谷31）、25.2%（濟谷15）、1.6%（濟谷22）、7.3%（豫谷28），株高降幅排序為冀谷31gt;濟谷15gt;豫谷28gt;濟谷22。氮低效品種的株高在2個氮水平間存在極顯著差異，而氮高效品種的株高無顯著差異。

通過比較不同谷子低氮和正常氮處理下地上部干重發(fā)現(xiàn)，在低氮處理下所有品種的地上部干重均出現(xiàn)降低，豫谷28地上部干重最大。與正常氮處理相比，低氮處理下4個品種地上部干重分別降低67.0%（冀谷31）、43.1%（濟谷15）、7.3%（濟谷22）、6.4%（豫谷28），降幅為冀谷31gt;濟谷15gt;濟谷22gt;豫谷28。氮低效品種的地上部干重在2個氮水平間存在極顯著差異，而氮高效品種的地上部干重無顯著差異。

通過比較不同谷子低氮和正常氮處理下地下部干重發(fā)現(xiàn)，在低氮處理下所有品種的地下干物重均出現(xiàn)降低，豫谷28的地下部干重最大。與正常氮處理相比，低氮處理下4個品種地下部干重降低幅度分別為51.3%（冀谷31）、30.6%（濟谷15）、6.1%（濟谷22）、5.3%（豫谷22），地下部干重降幅排序為冀谷31gt;濟谷15gt;濟谷22gt;豫谷22。氮低效品種的地下部干重在2個氮水平間差異極顯著，而氮高效品種的地下部干重無顯著差異。在低氮處理下，各谷子品種地下部干重的降幅均小于地上部干重，說明谷子在低氮處理下，為了滿足營養(yǎng)供應，提高了根部物質(zhì)分配比例。

對不同谷子品種氮吸收速率進行差異分析發(fā)現(xiàn)，谷子氮高效品種濟谷22和豫谷28對15N-NO-3和15N-NO+4 吸收速率均顯著高于氮低效品種冀谷31 和濟谷15。氮高效品種對15N-NO+4 吸收速率比氮低效品種高24.5%～33.3%，氮高效品種對15N-NO-3 吸收速率比氮低效品種高25.5%～33.2%。這說明與氮低效品種相比，氮高效品種具有較高的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收能力。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

對氮高效品種和氮低效品種在不同氮處理下共36個cDNA 文庫進行高通量RNA-seq，得到總讀取數(shù)為43 227 792～56 430 696條，每個樣本有40 975 120～53 282 997 條clean reads，各樣品GC含量達到53.88%，Q30（堿基準確識別率為99.9%）的測序數(shù)據(jù)為94.71%～96.09%。去除低質(zhì)量的reads后，對得到的clean reads與參考基因組進行比對，其中，91.48%～95.91%的clean reads比對到參考基因組上，89.27%～93.68%的clean reads被比對到單一的轉(zhuǎn)錄本上，2.13%～2.48%的cleanreads 被比對到多個轉(zhuǎn)錄本上。另外，為了對差異基因進行更好的注釋，將組裝獲得的所有基因和轉(zhuǎn)錄本與各數(shù)據(jù)庫（NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO 和KEGG）進行比對，在所有轉(zhuǎn)錄本中共預測到3 348個轉(zhuǎn)錄因子，分屬46個家族，其中預測轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量最多的是MYB-related家族（189 個），其次為bHLH 家族（182 個）、WRKY 家族（158 個）、MYB 家族（156 個）和HB-other 家族（153個），表明這些轉(zhuǎn)錄因子積極參加了谷子響應氮高效的反應過程。

2.3 差異表達基因分析

基于所有樣本中的FPKM分布情況進行皮爾森相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，氮高效品種和氮低效品種不同氮水平處理下葉片3個生物學重復的R2均高于0.9，表明谷子葉片各處理間3個生物學重復樣本之間具有很強的相關(guān)性，測序數(shù)據(jù)較為可靠。以Padjlt;0.05和FC≥1為標準篩選差異表達基因，結(jié)果如圖2 所示。測序共獲得16 000 個差異表達基因，其中，相比N0處理，氮高效品種濟谷22在N3和N6氮處理時分別篩選到115和15 335個差異表達基因；氮高效品種豫谷28在N3和N6氮處理時分別篩選到1 783和525個差異表達基因；氮低效品種濟谷15在N3和N6氮處理時分別篩選到60和203個差異表達基因；氮低效品種冀谷31在N3和N6氮處理時分別篩選到45和601個差異表達基因。整體來看，相比N3氮處理，N6氮處理獲得更多的差異表達基因，對氮處理的響應表現(xiàn)的更為活躍；從上、下調(diào)差異表達基因數(shù)來看，無論是氮高效品種還是氮低效品種，在低氮處理和高氮處理時都呈現(xiàn)出上調(diào)基因多于下調(diào)基因，表明上調(diào)表達基因在氮脅迫中扮演著十分重要的角色。氮高效與氮低效品種氮處理后獲得的總差異表達基因進行維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，氮低效品種濟谷22 和豫谷28 分別共有94 和174 個差異表達基因；氮低效品種濟谷15和冀谷31分別共有14和24個差異表達基因。

2.4 差異表達基因的GO 功能注釋分析

為揭示谷子對氮吸收利用的調(diào)控機制，進行了GO富集分析，結(jié)果（表3）表明，氨基酸代謝相關(guān)的GO條目在比較組中顯著富集，如亮氨酸代謝過程（leucine metabolic process）、α-氨基酸代謝過程（alpha-amino acid metabolic process）、亮氨酸分解代謝過程（leucine catabolic process）、谷氨酰胺代謝過程（glutamine metabolic process）、支鏈氨基酸代謝過程（branched-chain amino acidmetabolic process）、有機酸代謝過程（organic acidmetabolic process）、氧代酸代謝過程（oxoacidmetabolic process）、羧酸代謝過程（carboxylic acidmetabolic process）。除此之外，還有很多防御相關(guān)的條目，如對滲透脅迫的反應（response toosmotic stress）、對細胞外刺激的反應（response toextracellular stimulus）、細胞對化學刺激的反應（cellular response to chemical stimulus）、對輻射的反應（response to radiation）、對鹽脅迫的反應（response to salt stress）、對非生物刺激的反應（response to abiotic stimulus）、對刺激的反應（response to stimulus）、對化學物質(zhì)的反應（response to chemical）。酶活性相關(guān)的GO條目包括去精胺：氧氧化還原酶活性（norspermine：oxygen oxidoreductase activity）、纖維素合成酶活性（cellulose synthase activity）、纖維素合成酶（UDP形成）活性（cellulose synthase （UDP-forming）activity）、轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移?；?，轉(zhuǎn)移時?；D(zhuǎn)化為烷基（transferase activity， transferring acylgroups， acyl groups converted into alkyl ontransfer）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性（phosphoenolpyruvate carboxylase activity）、多胺氧化酶活性（polyamine oxidase activity）。還有與轉(zhuǎn)運蛋白活性相關(guān)的GO條目，如跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（transmembrane transporter activity）、無機分子實體跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（inorganic molecular entitytransmembrane transporter activity）、離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（ion transmembrane transporter activity）、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（anion transmembranetransporter activity ATP）、酶偶聯(lián)離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（ATPase-coupled ion transmembrane transporteractivity ATP）、酶偶聯(lián)陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性（ATPase-coupled cation transmembrane transporteractivity）、離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性及其磷酸化機制（ion transmembrane transporter activity， phosphorylativemechanism）。另外還富集到晝夜節(jié)律（circadianrhythm）、離子跨膜轉(zhuǎn)運（ion transmembranetransport）、葉綠體基質(zhì)（chloroplast stroma）和細胞醛代謝過程（cellular aldehyde metabolic process）等條目。

2.5 差異表達基因KEGG 分析

為分析差異表達基因所影響的代謝通路，對前20 個KEGG 途徑進行了富集分析（表4）。KEGG分析表明，乙醛酸和二羧酸代謝（glyoxylateand dicarboxylate metabolism）、光合生物的碳固定（carbon fixation in photosynthetic organisms）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）、卟啉與葉綠素代謝（porphyrin and chlorophyll metabolism）、MAPK 信號通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（alanine， aspartateand glutamate metabolism）纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解（valine， leucine and isoleucinedegradation）半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteine andmethionine metabolism）、酮體的合成與降解（synthesis and degradation of ketone bodies）、丁酸代謝（butanoate metabolism）、過氧化物酶體（peroxisome）、氨基糖和核苷酸糖代謝（aminosugar and nucleotide sugar metabolism）、谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）顯著富集。另外，許多氨基酸合成和代謝相關(guān)的條目，如β-丙氨酸代謝（β-alanine metabolism）、精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism）、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成（valine， leucine andisoleucine biosynthesis）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（glycine， serine and threonine metabolism）、丙酸代謝（propanoate metabolism）也被富集到。除此之外，戊糖磷酸途徑（pentose phosphate pathway）、植物與病原體的相互作用（plant-pathogeninteraction）和氮代謝（nitrogen metabolism）也顯著富集。

2.6 WGCNA 分析

為了全面了解氮高效和氮低效基因型表達的基因，并確定響應氮肥相關(guān)的特定基因，對差異基因進行WGCNA分析。WGCNA分析是根據(jù)基因在不同樣品中的表達，將基因分成不同的模塊。模塊被定義為高度關(guān)聯(lián)的基因簇，同一簇內(nèi)基因具有高度的相關(guān)性。WGCNA也可用于共建基因網(wǎng)絡，其中每個節(jié)點代表1個基因，基因之間的連接線代表共表達相關(guān)性。基因之間的連接性可通過KME值體現(xiàn)，KME值越高，基因在網(wǎng)絡中與其他基因聯(lián)系越緊密。設置處理參數(shù)FPKMgt;2、FCgt;2、Padjlt;0.05，篩選出8 841個基因，被鑒定為18個模塊。這18個模塊中brown模塊在氮高效基因型品種中高度表達。對KME值排名前30的基因分析發(fā)現(xiàn)， Seita.9G488700、Seita.3G171400、Seita.2G368800、Seita. 3G406500、Seita. 8G056500、Seita. 2G239600、Seita.5G063300 共7個基因被注釋到信息（圖5）。

2.7 不同氮效率谷子品種高表達差異基因RT-qPCR 分析

從高度表達的模塊中篩選KME值較高的3個基因進行RT-qPCR，將0 mmol·L-1 氮處理的該基因相對表達量設為1，獲得它們在氮高效品種濟谷22、豫谷28和氮低效谷子品種濟谷15、冀谷31中的相對表達量。在豫谷28 中，Seita.2G368800在3 mmol·L-1 氮處理下相對表達量上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)變化為5.3倍；在濟谷22中，Seita.5G063300 在3mmol·L-1氮處理下相對表達量上調(diào)。在氮低效品種冀谷31 中，Seita. 9G488700、Seita. 2G368800 和Seita.5G063300 在3 mmol·L-1 氮處理下相對表達量上調(diào)，其中，Seita.2G368800 上調(diào)量最高，為4.3倍。在氮低效品種濟谷15中，Seita.9G488700 在3 mmol·L-1氮處理下相對表達量上調(diào)。以上結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，從而證實了RNA-seq測序數(shù)據(jù)較為準確，氮高效相關(guān)基因表達量分析結(jié)果可靠。

3 討論

3.1 不同氮效率谷子品種響應低氮脅迫的生理特性差異

氮素供應不足會對植物生長發(fā)育造成嚴重影響，谷子對缺氮十分敏感 [26-28]。本研究結(jié)果表明，低氮條件下氮高效和低效谷子品種苗期的株高、地上干物質(zhì)重、地下干物質(zhì)重均顯著下降，但不同氮利用效率品種的變化幅度存在差異，氮高效品種豫谷28和濟谷22株高、地上干物質(zhì)重、地下干物質(zhì)重的降幅小于氮低效品種冀谷31和濟谷15，這與前人的研究結(jié)果一致。張立媛等[29]對8個谷子品種在低氮脅迫下的表型進行研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫下各品種株高顯著降低。陳凌等[30]對不同糜子品種的株高、葉面積在低氮處理下的研究發(fā)現(xiàn)，其株高、葉面積在低氮處理下均顯著降低。說明低氮條件對谷子高效品種生長發(fā)育及干物質(zhì)積累的影響小于氮低效品種，氮高效品種能夠維持較穩(wěn)定的生長狀態(tài)。

氮素是植物正常生長必需的大量元素之一，自然界中植物的氮源分為無機氮源和有機氮源，其中以硝態(tài)氮為主的無機氮是最先被認知的植物氮源，并且廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[31]。植物通過根系吸收土壤中的銨態(tài)氮或硝態(tài)氮，需經(jīng)過還原同化作用才能合成氨基酸或蛋白質(zhì)，進而滿足植物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)。氮供應不足，植物氨基酸或蛋白質(zhì)合成受阻，氮代謝途徑發(fā)生改變，最終影響植物的生長發(fā)育[32]。本研究通過同位素比值質(zhì)譜法檢測根系中的15N積累，結(jié)果表明在低氮條件下谷子氮高效品種濟谷22和豫谷28比氮低效品種冀谷31和濟谷15具有較高的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮吸收能力?？梢姽茸拥咝贩N在低氮脅迫條件下具有更強的氮素吸收能力，可積累更多的有機物質(zhì)。

3.2 不同氮效率谷子品種響應低氮脅迫的轉(zhuǎn)錄組水平差異

轉(zhuǎn)錄組是指某個物種或特定細胞類型所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，具有覆蓋率高、檢測范圍廣、速度快等優(yōu)點[33]。目前轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)被廣泛用于植物在生物和非生物脅迫下的轉(zhuǎn)錄譜分析[34-42]。本研究通過對4個不同氮效率品種進行轉(zhuǎn)錄組測序分析表明，氮高效品種濟谷22和豫谷28分別共有94和174個差異表達基因；氮低效品種濟谷15和冀谷31分別共有14和24個差異表達基因。這說明氮高效谷子品種在低氮條件下更有助于吸收土壤中的氮，這一結(jié)果在張婷婷等[43]研究中也得到驗證。谷子在低氮脅迫下差異表達基因的代謝通路主要集中在氨基酸合成與降解、光合器官中的碳固定、乙醛酸和二羧酸代謝方面。

有報道認為氨基酸代謝屬于氮代謝的范疇[44]，本研究鑒定出的氨基酸合成與代謝途徑（如亮氨酸代謝過程β-丙氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、丙酸代謝等）顯著富集。張婷婷等[43]對馬鈴薯氮代謝響應的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸代謝通路在馬鈴薯冀張薯12號中顯著富集。張新城等[45]研究表明，氮素對水稻葉片中多數(shù)氨基酸具有顯著上調(diào)的作用，水稻葉片中氨基酸含量隨施氮量的增加而增加，說明氨基酸合成與代謝途徑在氮代謝過程中起重要作用。

乙醛酸和二羧酸代謝途徑在氮高效品種濟谷22在3和6 mmol·L-1氮處理、豫谷28在3 mmol·L-1氮處理、氮低效品種冀谷31在6 mmol·L-1氮處理中均鑒定到。本研究共篩選到66個相關(guān)基因，其中19個相關(guān)基因在這些品種中同時作用。有研究發(fā)現(xiàn)，乙醛酸和二羧酸代謝通路途徑基因參與OsHsf18 調(diào)控水稻抗生物脅迫和非生物脅迫反應[46]。因此推測，在受到氮脅迫時，谷子通過乙醛酸和二羧酸代謝途徑來抵抗低氮脅迫。

光合生物的碳固定途徑只在氮高效品種濟谷22中鑒定出來。本研究鑒定出相關(guān)基因68個，包括10個基因家族，分別為ALDO（果糖二磷酸）醛縮酶、maeB（NADP依賴的蘋果酸酶）、FBP（果糖-1，6-二磷酸酶）、GAPA（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、GPT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶2）、MDH2（蘋果酸脫氫酶）、PPC（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）、PRK（磷酸核酮糖激酶）、rbcS（核酮糖二磷酸羧化酶小鏈）、RPE（核酸核酮糖）。有研究表明，光合生物的碳固定與干旱脅迫下紫花苜蓿的抗旱性有關(guān)[47]，并未發(fā)現(xiàn)與響應低氮脅迫相關(guān)的報道，表明低氮脅迫各基因表達模式存在差異。

3.3 轉(zhuǎn)錄因子家族對谷子葉片氮脅迫的調(diào)控

本研究中共獲得46類差異表達的轉(zhuǎn)錄因子，其中MYB-related 家族和bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子差異表達基因最多，其次是WRKY家族、MYB家族和HB-other家族，這與張文云等[48]在小麥轉(zhuǎn)錄組鑒定出轉(zhuǎn)錄因子類型有WRKY、MYB、乙烯反應轉(zhuǎn)錄因子和NAC等相似[48]。因此推測，除了MYB轉(zhuǎn)錄因子、WRKY轉(zhuǎn)錄因子外，bHLH在谷子響應低氮脅迫中可能發(fā)揮重要作用。

轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達的調(diào)控元件，對外界環(huán)境中氮水平感知和氮信號轉(zhuǎn)導及氮代謝途徑的調(diào)控有重要作用。bHLH轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育和脅迫響應過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[49]。Heim等[50]在擬南芥中鑒定出133個bHLH，并預測該家族在植物細胞和組織發(fā)育以及植物代謝中具有一系列不同的作用。Nawaz等[51]對西瓜葉片和根進行研究發(fā)現(xiàn)，有82個bHLH TFs受到低氮脅迫的影響，通過上調(diào)bHLH TFs增加葉片中花青素的形成來減輕光氧化損傷，以提高氮吸收和利用效率。

MYB是調(diào)控植物發(fā)育、代謝、分化以及對生物和非生物脅迫反應的關(guān)鍵因子，它廣泛分布于植物中，直接參與調(diào)控生物過程，并與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用[52]。Zhang等[53]對小麥進行研究發(fā)現(xiàn)，在氮脅迫下MYB 與細胞發(fā)育和細胞周期相關(guān)。Yang 等[54]對甘蔗低耐氮品種和低氮敏感品種為試驗材料研究發(fā)現(xiàn)，MYB是2個品種中差異表達最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，可以提高甘蔗適應低氮處理。Curci等[55]對小麥在灌漿期對N 素饑餓響應的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生低氮脅迫時，小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子基因表達上調(diào)。

3.4 轉(zhuǎn)錄因子家族對谷子葉片氮脅迫的調(diào)控

本研究根據(jù)對差異表達基因的功能注釋，篩選了3個與氮代謝有關(guān)的差異基因進行基因功能驗證，并通過對3個基因進行RT-qPCR驗證，發(fā)現(xiàn)驗證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，并通過對谷子數(shù)據(jù)庫進行比對發(fā)現(xiàn)這些基因可能參與了谷子對低氮脅迫的響應，表明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有較高的可靠性，可以基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行后續(xù)相關(guān)分析。其中，Seita.2G368800 調(diào)控碳水化合物的運輸和代謝，有研究表明，施用氮肥通過調(diào)控花生次生產(chǎn)物代謝、碳水化合物代謝等途徑，提高干旱脅迫下花生植株的抗氧化能力，從而提高花生的抗旱性[56]。故該基因可能通過提升抗氧化能力和抗旱性響應低氮脅迫。