柑橘不同倍性種質(zhì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)及無(wú)病毒植株再生

摘要：【目的】通過(guò)離體培養(yǎng)敗育胚珠誘導(dǎo)柑橘二倍體和四倍體種質(zhì)的胚性愈傷組織，為柑橘多倍體研究提供成對(duì)離體材料；繼續(xù)誘導(dǎo)胚性愈傷組織再生無(wú)毒種苗實(shí)現(xiàn)柑橘無(wú)核品種提純復(fù)壯?！痉椒ā繌母涕俪墒旃麑?shí)中挑取敗育胚珠，接種于3種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在離體培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)并馴化胚性愈傷組織；再誘導(dǎo)愈傷組織分化為胚狀體和不定芽，將不定芽嫁接到枳橙砧木形成完整植株；通過(guò)InDel標(biāo)記和病毒檢測(cè)鑒定再生植株的遺傳來(lái)源和脫毒效果?！窘Y(jié)果】離體培養(yǎng)誘導(dǎo)出13個(gè)柑橘種質(zhì)的胚性愈傷組織，其中8個(gè)愈傷組織完成馴化，分別為紅橘二倍體/四倍體（2x/4x）、W.默科特橘橙2x/4x、鄂柑1號(hào)椪柑2x/4x、日輝橘2x和早紅臍橙?；蛐陀绊懜涕倥咝杂鷤M織誘導(dǎo)效率，早紅臍橙誘導(dǎo)率高達(dá)74.73%，而紅橘誘導(dǎo)率僅6.85%；柑橘四倍體愈傷組織誘導(dǎo)率（0.56%～22.61%）低于對(duì)應(yīng)二倍體（6.85%～37.75%）。3種不同培養(yǎng)基的胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率不同，其中MGS培養(yǎng)基對(duì)溫州蜜柑在內(nèi)的5個(gè)品種的誘導(dǎo)率較高（14.13%～63.01%），MK培養(yǎng)基對(duì)溫州蜜柑在內(nèi)的4個(gè)品種的誘導(dǎo)率較低（21.62%～69.51%），但MK培養(yǎng)基對(duì)椪柑2x和紅橘2x的誘導(dǎo)率分別為70.21%和17.31%。分別獲得早紅臍橙、倫晚臍橙、國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、大分4號(hào)溫州蜜柑和興津溫州蜜柑5個(gè)無(wú)核品種的愈傷組織再生苗23、22、20、10和15株；嫁接嵌合體早紅臍橙的愈傷組織再生苗經(jīng)InDel標(biāo)記鑒定實(shí)為羅伯遜臍橙；國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、倫晚臍橙和早紅臍橙再生苗經(jīng)PCR檢測(cè)證明未感染黃脈病和衰退病病毒?！窘Y(jié)論】柑橘胚性愈傷組織誘導(dǎo)率受品種基因型和培養(yǎng)基影響；同一品種的不同倍性種質(zhì)，二倍體愈傷組織誘導(dǎo)率和胚狀體發(fā)生率均較高；胚性愈傷組織再生植株實(shí)現(xiàn)了病毒完全脫除，是柑橘無(wú)核品種提純復(fù)壯的有效手段。

關(guān)鍵詞：柑橘；胚性愈傷組織；倍性種質(zhì)；無(wú)核品種；離體再生

中圖分類號(hào)：S666文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1009-9980（2024）07-1332-10

Embryogenic callus induction and virus-free plantlet regeneration from seedless cultivars in citruses of different ploidy

REN Jiaqin1，HUANG Xuebing1，YANG Wenhui1，CHEN Hao1，DENG Jiarui2，AO Yijun2，XIE Kaidong1，GUO Wenwu1，WU Xiaomeng1*

（1National Key Laboratory for Germplasm Innovationamp;Utilization of Horticultural Crops，Wuhan 430070，Hubei，China;2Chenggu Fruit Technology Guidance Station，Chenggu 723200，Shaanxi，China）

Abstract：【Objective】Citrus is the biggest fruit industry in China and in the world.China is the origin center of citrus，owning abundant and diverse citrus germplasm resources，and it is important to proper-ly conserve and utilize the elite citrus germplasm.The embryogenic callus induced from the aborted ovules is genetically identical to the original explant and capable of regeneration，making it feasible for in vitro conservation of citrus germplasm.The embryogenic callus also provides in vitro materials for studies of important traits，such as somatic embryogenesis，fruit quality control and stress resistance. We have induced and preserved embryogenic callus germplasm of over 100 different genotypes.How-ever，the embryogenic calluses are all induced from the diploid germplasm，while induction of embryo-genic callus from polyploid germplasm has been rarely reported.The polyploid is characterized by giant organ，dwarf plant and stronger adaptability.The polyploid embryogenic callus would accelerate basic research and applications of citrus polyploidy，by providing in vitro materials with short growth cycle，stable status，and easily accessibility.In addition，the whole new plantlets regenerated from embryogen-ic callus are always virus-free，which are promising in resolving the problem of fruit yield and quality delineation in seedless cultivars caused by virus infection after many years propagation by grafting.In this study，the aborted ovules of diploid and tetraploid citrus germplasm were cultured to induce em-bryogenic callus，to provide in vitro materials for citrus ploidy research.Regeneration of virus-free plantlets from embryogenic callus achieves purification and rejuvenation of seedless cultivars like navel orange and Satsuma mandarin.【Methods】The aborted ovules from mature fruits were inoculated on three types of callus induction mediums（MES：MT+ME 0.5 g·L-1+SAD 40 mg·L-1;MGS：MT+ME 0.5 g·L-1+SAD 40 mg·L-1+GA3 1 mg·L-1;MK：MT+KT 0.5 mg·L-1）under sterile conditions to in-duce and train embryogenic callus，and the ploidy of embryogenic callus was determined by flow cy-tometry.Embryogenic callus was induced to differentiate into embryoids and adventitious buds.When the regenerated buds grew to the size of 2-3 cm，they were grafted to the yellowing rootstock in test tube to form a plantlet.SSR（Simple Sequence Repeats）analysis was used to identify the genetic origin of the regenerated plantlets，and PCR was used to detect Citrus tristeza virus（CTV）and Citrus yellow vein clearing virus（CYVCV）in the plantlets.【Results】The embryogenic calluses were induced from 13 citrus accessions，and eight of them have been trained for subculture，including red tangerine diploid and tetraploid（2x，4x），Nadorcott tangor（2x，4x），Egan No.1 Ponkan mandarin（2x，4x），Sunburst man-darin（2x）and Zaohong navel orange.The ploidy of the embryogenic calluses was consistent with the source materials from which they were induced，as detected by flow cytometry.The embryogenic callus induction efficiencies were different among accessions.The induction rate of Zaohong navel orange was the highest（74.73%），followed by Guoqing No.1 Satsuma mandarin，Okitsu Satsuma mandarin，Oita 4 Satsuma mandarin and Egan No.1 Ponkan mandarin，each with an induction rate over 37%.The induction rates of red tangerine 2x，Sunburst mandarin 2x，Lane Late navel orange and Nadorcott tangor 2x were lower than those of the other genotypes，with induction rates between 6.85%and 12.61%.Em-bryogenic calluses were induced from four pairs of ploidy materials，and the induction rate of diploid germplasm was 6.85%-37.75%.Among them，the callus induction rate of Egan No.1 Ponkan mandarin 2x was the highest，while that of red tangerine 2x was the lowest.The callus induction rates of the tetra-ploids（0.56%-22.61%）were lower than those of the diploids.Among them，the callus induction rate of Egan No.1 Ponkan mandarin 4x was also the highest，while that of Nadorcott tangor 4x was the lowest.As for the incidence of embryoids，they were 16.15%-58.28%for diploids and 1.13%-30.65%for tetra-ploids.In summary，the callus induction and embryoid incidence rates of Egan No.1 Ponkan mandarin 2x and 4x were the highest among the four pairs of 2x and 4x materials，while those of Nadorcott tangor 4x were the lowest among the tetraploid germplasm.Notably，the callus induction and embryoid inci-dence rates of the tetraploids were lower than those of the corresponding diploids.Besides，the induc-tion rate of embryogenic callus on different mediums was different.The embryogenic callus induction rates of Guoqing No.1 Satsuma mandarin，Okitsu Satsuma mandarin，Oita 4 Satsuma mandarin，Nador-cott tangor 2x and Sunburst mandarin 2x on MGS medium were higher than on MK and MES.The cal-lus induction rates of Egan No.1 Ponkan mandarin 2x and red tangerine 2x on MK medium were the highest，and significantly higher than on MES and MGS.A total of 23，22，20，10 and 15 plantlets were regenerated from five seedless cultivars，including Zaohong navel orange，Lane Late navel orange，Guo-qing No.1 Satsuma mandarin，Oita 4 Satsuma mandarin and Okitsu Satsuma mandarin，respectively.SSR analysis showed that the regenerated plantlets of the chimeric Zaohong navel orange were indeed Robertson navel orange.According to PCR，CTV and CYVCV were undetectable in the regenerated plantlets of Guoqing No.1 Satsuma mandarin，Lane Late navel orange and Zaohong navel orange，prov-ing them to be virus-free.【Conclusion】In this study，the aborted ovules of mature citrus fruits were cul-tured in vitro，and the diploid and tetraploid embryogenic callus of three varieties were obtained by in-duction and training，which provides stable and easily accessible in vitro materials for the research of citrus polyploidy.The embryogenic callus induction rates differed among different citrus germplasms and induction mediums.The embryogenic callus induction rate and somatic embryogenesis rate of the diploids were higher than the corresponding tetraploid for each cultivar.The regenerated virus-free plantlets provide materials for purification and rejuvenation of five polyembryonic and seedless citrus cultivars.The molecular marker analysis proved that the regenerated plantlets of the grafting chimera Zaohong navel orange were indeed Robertson navel orange.

Keywords：Citrus;Embryogenic callus;Ploidy germplasm;Seedless cultivars;In vitro regeneration

柑橘是世界和中國(guó)南方第一大水果。中國(guó)是柑橘起源中心[1]，擁有豐富多樣的柑橘種質(zhì)資源，合理保存和利用中國(guó)優(yōu)異的柑橘種質(zhì)具有重要意義。柑橘胚性愈傷組織由敗育胚珠誘導(dǎo)而來(lái)，其遺傳上與親本保持一致；且胚性愈傷組織具有細(xì)胞全能性，能通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生植株，是柑橘種質(zhì)資源離體保存的主要方式。筆者課題組多年來(lái)誘導(dǎo)保存了100多個(gè)柑橘品種的胚性愈傷組織[2]，為利用原生質(zhì)體融合、基因編輯等生物技術(shù)改良柑橘提供了豐富的起始材料[3]，為柑橘體細(xì)胞胚發(fā)生[4]、品質(zhì)調(diào)控[5]和抗性研究[6]提供了離體體系。然而，柑橘胚性愈傷組織均從二倍體種質(zhì)誘導(dǎo)獲得，柑橘多倍體種質(zhì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)未見(jiàn)報(bào)道。

多倍體普遍具有器官巨大型、植株矮化和適應(yīng)性強(qiáng)等特征。柑橘同源四倍體相比二倍體對(duì)鹽脅迫、干旱、營(yíng)養(yǎng)缺乏等非生物逆境抗性更強(qiáng)[7-9]，柑橘四倍體相比二倍體果實(shí)品質(zhì)也發(fā)生顯著變異[10-11]，為柑橘倍性育種提供了優(yōu)良親本。誘導(dǎo)柑橘多倍體的胚性愈傷組織，將為柑橘多倍體倍性和代謝等研究提供周期短、狀態(tài)穩(wěn)定、易獲得的離體材料，加速柑橘多倍體基礎(chǔ)研究和利用。

無(wú)核是柑橘鮮食品種選育的重要目標(biāo)性狀[12]。但無(wú)核品種常年通過(guò)嫁接繁殖，累積多種病毒，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量下降。中國(guó)較常見(jiàn)且對(duì)柑橘生產(chǎn)危害較大的病毒和細(xì)菌性類病害主要有柑橘黃龍病、潰瘍病、裂皮病、衰退病和黃脈病等。柑橘無(wú)核品種沒(méi)有種子，無(wú)法通過(guò)珠心苗實(shí)生繁殖脫毒；柑橘莖尖培養(yǎng)難以生根，微芽嫁接操作要求高且成活率低，脫毒效率有待提高。胚性愈傷組織可通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生植株，在穩(wěn)定遺傳親本性狀的同時(shí)，能培育無(wú)病毒植株，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，再生苗數(shù)量多，結(jié)構(gòu)完整，尤其適合多胚無(wú)核柑橘品種提純復(fù)壯[13]。

筆者課題組利用柑橘多胚品種存在珠心細(xì)胞自然加倍的現(xiàn)象，從柑橘60多個(gè)接穗和砧木類型中發(fā)掘獲得了一大批同源四倍體植株[14-16]，豐富了中國(guó)柑橘多倍體種質(zhì)資源，為通過(guò)倍性雜交培育柑橘三倍體無(wú)核新種質(zhì)提供了優(yōu)良親本[17]。筆者在本研究中通過(guò)離體培養(yǎng)二倍體和四倍體柑橘的敗育胚珠，誘導(dǎo)胚性愈傷組織，將為多倍體抗性和代謝相關(guān)研究提供倍性成對(duì)的離體材料；無(wú)核品種誘導(dǎo)胚性愈傷組織并通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生不攜帶病毒的植株，將為中國(guó)主栽的臍橙和溫州蜜柑等無(wú)核品種提純復(fù)壯提供種苗。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

用于誘導(dǎo)胚性愈傷組織的柑橘二倍體及其同源四倍體（2x/4x）成對(duì)倍性材料，包括紅橘（Citrus retic-ulata Blanco）2x/4x、W.默科特橘橙（C.reticulata Blanco×C.sinensis L.Osbeck）2x/4x、鄂柑1號(hào)椪柑（C.reticulata Blanco）2x/4x、日輝橘（C.reticulata Blanco）2x/4x；無(wú)核柑橘品種，包括早紅臍橙（C.si- nensis L.Osbeck）、倫晚臍橙（C.sinensis L.Osbeck）、國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑（C.unshiu Blanco）、大分4號(hào)溫州蜜柑（C.unshiu Blanco）和興津溫州蜜柑（C.unshiu Blanco）。

1.2柑橘胚性愈傷組織離體誘導(dǎo)

將成熟果實(shí)浸泡于75%乙醇20min后，超凈工作臺(tái)內(nèi)用酒精燈灼燒果實(shí)表面消毒。在無(wú)菌濾紙上，將果實(shí)切開(kāi)后，用鑷子將敗育胚珠挑出，接種于3種愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基[18]（MES：MT[19]+0.5 g·L-1 ME+40 mg·L-1 SAD；MGS：MT+0.5 g·L-1 ME+40 mg·L-1 SAD+1 mg·L-1 GA3；MK：MT+0.5 mg·L-1 KT）進(jìn)行暗培養(yǎng)。離體培養(yǎng)約1個(gè)月后，待敗育胚珠萌發(fā)產(chǎn)生胚狀體或胚性愈傷組織后，將胚性愈傷組織挑出并繼代于MT培養(yǎng)基，光下培養(yǎng)至愈傷組織狀態(tài)穩(wěn)定并持續(xù)增殖，即完成愈傷組織馴化。將馴化完成的愈傷組織保存在MT培養(yǎng)基中光照培養(yǎng)，每月繼代1次長(zhǎng)期保存。胚性愈傷組織誘導(dǎo)率/%=形成胚性愈傷組織的敗育胚珠數(shù)/離體培養(yǎng)的敗育胚珠總數(shù)×100，胚狀體發(fā)生率/%=形成胚狀體的敗育胚珠數(shù)/離體培養(yǎng)敗育胚珠總數(shù)×100。

1.3胚性愈傷組織胚狀體增殖、生芽和試管嫁接

新誘導(dǎo)獲得的柑橘胚性愈傷組織在MT培養(yǎng)基上馴化和繼代培養(yǎng)過(guò)程中，會(huì)再生胚狀體，將胚狀體轉(zhuǎn)移至增殖培養(yǎng)基（MT+1.5 g·L-1 ME+50 g·L-1蔗糖），待胚狀體膨大后轉(zhuǎn)移至生芽培養(yǎng)基（MT+0.5 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 KT+0.1 mg·L-1 NAA）誘導(dǎo)生芽。待叢生芽長(zhǎng)至2～3 cm高時(shí)，采用試管嫁接技術(shù)將其嫁接至枳橙黃化砧木上；待嫁接苗成活并新長(zhǎng)出3～4枚真葉后，將其轉(zhuǎn)移到生長(zhǎng)室煉苗；待幼苗長(zhǎng)至6～7枚葉片時(shí)轉(zhuǎn)移至溫室。

1.4倍性測(cè)定和InDel標(biāo)記鑒定

利用流式細(xì)胞儀（Cyflowspace，Sysmex，Japan）檢測(cè)胚性愈傷組織及再生植株的染色體倍性，詳情參考解凱東等[17]的方法。制備待測(cè)愈傷組織或植株葉片混合液，比較待測(cè)樣品與二倍體，參照峰值橫坐標(biāo)位置關(guān)系，確定待測(cè)樣品倍性。分子鑒定參考謝善鵬等[14]的方法，InDel標(biāo)記引物[20]（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用ProFlex PCR儀（ABI，USA）進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增體系為10μL：2×Rapid Taq Master Mix 5μL，ddH2O 3.5μL，DNA 1μL，Primer F、R各0.25μL（10μmol·L-1）。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃保存。

1.5病毒PCR檢測(cè)

取嫁接苗植株葉片，使用液氮冷凍后磨樣。葉片RNA提取方法參照HiPure HP Plant RNA Mini Kit（Magen）說(shuō)明書(shū)；反轉(zhuǎn)錄方法參照HiScripteⅡQ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（Vazyme）說(shuō)明書(shū)。PCR反應(yīng)體系和程序同InDel標(biāo)記鑒定，設(shè)置陰性（ddH2O模板）和陽(yáng)性對(duì)照（感染黃脈病和衰退病的夏橙葉片DNA）。衰退病[21]和黃脈病檢測(cè)引物[22]（表2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2結(jié)果與分析

2.1柑橘胚性愈傷組織誘導(dǎo)和馴化

從柑橘成熟果實(shí)中挑出敗育胚離體培養(yǎng)，暗培養(yǎng)0.7～3.0個(gè)月后在敗育胚珠附近形成胚性愈傷組織。將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至MT培養(yǎng)基多次繼代培養(yǎng)進(jìn)行馴化，耗時(shí)5～9個(gè)月。13個(gè)材料均誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，經(jīng)過(guò)多次繼代培養(yǎng)，其中8個(gè)材料的胚性愈傷組織狀態(tài)穩(wěn)定并能持續(xù)增殖，包括紅橘2x/4x、W.默科特橘橙2x/4x、鄂柑1號(hào)椪柑2x/4x、日輝橘2x和早紅臍橙，說(shuō)明這些胚性愈傷組織已完成馴化，可常規(guī)繼代培養(yǎng)；其余5個(gè)材料包括日輝橘4x、倫晚臍橙、國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、大分4號(hào)溫州蜜柑和興津溫州蜜柑誘導(dǎo)出的愈傷組織胚性較強(qiáng)，經(jīng)多次繼代逐漸分化形成胚狀體，雖未能獲得穩(wěn)定增殖的胚性愈傷組織，但通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑可能再生植株。采用流式細(xì)胞儀對(duì)8份2x/4x胚性愈傷組織進(jìn)行檢測(cè)，其倍性均與其敗育胚珠外植體來(lái)源母本植株一致（圖1）。

不同于其2x能直接從敗育胚珠中長(zhǎng)出胚性愈傷組織，W.默科特橘橙4x接種的敗育胚珠均未長(zhǎng)出愈傷組織或胚狀體；而是從較大的癟種子中長(zhǎng)出胚狀體，再?gòu)呐郀铙w下胚軸長(zhǎng)出胚性愈傷組織（圖1-H）。相比W.默科特橘橙2x胚性愈傷組織誘導(dǎo)和馴化分別耗時(shí)0.7和5.5個(gè)月，W.默科特橘橙4x的愈傷組織誘導(dǎo)和馴化耗時(shí)較長(zhǎng)，分別為3和5.5個(gè)月。紅橘4x愈傷組織誘導(dǎo)和馴化均相比對(duì)應(yīng)的2x耗時(shí)也較長(zhǎng)，但鄂柑1號(hào)椪柑4x愈傷組織誘導(dǎo)耗時(shí)較2x更短。

2.2基因型和培養(yǎng)基影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率

柑橘不同基因型的胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率不同（表3）。早紅臍橙誘導(dǎo)率最高，達(dá)74.73%；其次為國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、興津溫州蜜柑、大分4號(hào)溫州蜜柑和鄂柑1號(hào)椪柑2x，誘導(dǎo)率均＞37%；紅橘2x、日輝橘2x、倫晚臍橙和W.默科特橘橙2x的誘導(dǎo)率較低，在6.85%～12.61%之間。4對(duì)倍性材料均誘導(dǎo)出胚性愈傷組織（其中日輝橘4x愈傷組織未能完成馴化獲得穩(wěn)定增殖的胚性愈傷組織），二倍體愈傷組織誘導(dǎo)率為6.85%～37.75%，其中鄂柑1號(hào)椪柑2x愈傷組織誘導(dǎo)率最高（37.75%），紅橘2x的愈傷組織誘導(dǎo)率最低（6.85%）。四倍體愈傷組織誘導(dǎo)率相比二倍體較低，僅為0.56%～22.61%，其中鄂柑1號(hào)椪柑4x愈傷組織誘導(dǎo)率仍最高，達(dá)22.61%，而W.默科特橘橙4x的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，僅為0.56%。2x/4x成對(duì)倍性材料中，二倍體的胚狀體發(fā)生率為16.15%～58.28%，椪柑的胚狀體發(fā)生率最高，為58.28%。四倍體的胚狀體發(fā)生率為1.13%～30.65%，椪柑仍為最高，為30.65%，W.默科特橘橙最低，僅為1.13%?？偨Y(jié)可知，椪柑2x和4x的愈傷組織誘導(dǎo)率和胚狀體發(fā)生率均為4個(gè)品種2x和4x材料中最高，W.默科特橘橙4x的愈傷組織誘導(dǎo)率和胚狀體發(fā)生率均為4個(gè)四倍體品種中最低；同品種二倍體的愈傷組織誘導(dǎo)率和胚狀體發(fā)生率均比對(duì)應(yīng)的四倍體更高。

不同培養(yǎng)基的胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率不同（表3）。國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、興津溫州蜜柑、大分4號(hào)溫州蜜柑、W.默科特橘橙2x和日輝橘2x共5個(gè)品種在MGS培養(yǎng)基的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均高于MK和MES培養(yǎng)基。早紅臍橙、國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、大分4號(hào)溫州蜜柑和興津溫州蜜柑這4個(gè)品種在MK培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最低；但MK培養(yǎng)基對(duì)鄂柑1號(hào)椪柑2x和紅橘2x的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，且明顯高于MES和MGS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率。椪柑2x在MK培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)70.21%，約為MES、MGS培養(yǎng)基的3倍；紅橘2x在MK培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)17.31%，約為MGS培養(yǎng)基的15倍。

2.3柑橘無(wú)核品種胚性愈傷組織再生植株及其來(lái)源和病毒檢測(cè)

早紅臍橙、倫晚臍橙、國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、大分4號(hào)溫州蜜柑、興津溫州蜜柑5個(gè)無(wú)核品種誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織胚性較強(qiáng)，誘導(dǎo)過(guò)程產(chǎn)生大量胚狀體；挑選胚狀體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，胚狀體膨大后轉(zhuǎn)移至生芽培養(yǎng)基誘導(dǎo)生芽。約2個(gè)月后再生大量叢生芽，將再生芽切下進(jìn)行試管嫁接，待嫁接苗長(zhǎng)出3～4枚真葉移栽至基質(zhì)煉苗，1～2個(gè)月后移栽至溫室（圖2）。早紅臍橙愈傷組織再生苗經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定均為二倍體。分別獲得無(wú)核品種早紅臍橙、倫晚臍橙、國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、大分4號(hào)溫州蜜柑和興津溫州蜜柑的離體再生苗23、22、20、10、15株。

早紅臍橙是羅伯遜臍橙（Robertson navel or-ange）高接于溫州蜜柑產(chǎn)生的嫁接嵌合體[23]。利用前人篩選的4對(duì)InDel標(biāo)記引物[20]鑒定早紅臍橙胚性愈傷組織再生苗的遺傳組成。結(jié)果（圖3）表明，早紅臍橙23株嫁接苗與其親本羅伯遜臍橙帶型相同，認(rèn)為嵌合突變體早紅臍橙胚性愈傷組織再生苗實(shí)為羅伯遜臍橙。

柑橘衰退?。–itrus tristeza virus，CTV）和黃脈?。–itrus yellow vein clearing virus，CYVCV）是柑橘果園最常見(jiàn)的兩種病毒。對(duì)國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、倫晚臍橙和早紅臍橙再生苗進(jìn)行PCR病毒檢測(cè)，結(jié)果（圖4）顯示陽(yáng)性樣本（帶有衰退病和黃脈病的夏橙葉片）泳道有明顯條帶，3個(gè)品種的再生苗與陰性對(duì)照（水模板）均未擴(kuò)增出目的條帶，證明國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、倫晚臍橙和早紅臍橙再生苗均不含可檢出量的衰退病和黃脈病病毒，無(wú)毒率達(dá)100%。

3討論

柑橘胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率受基因型影響，9個(gè)二倍體品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為6.85%～74.73%。由柑橘基本種雜交而來(lái)的橙類（臍橙）和柑類（溫州蜜柑）的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較古老的橘類（椪柑、紅橘）更高；其中紅橘的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最低，且誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，敗育胚珠離體接種3個(gè)月后才長(zhǎng)出少量愈傷組織。這可能是由于較古老的橘類次生代謝更豐富，影響了胚性愈傷組織誘導(dǎo)。桃野生近緣種光核桃大量積累次生代謝物，其子葉外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率相比一般品種也較低[24]，與本研究結(jié)果相似。

筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)二倍體品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和胚狀體發(fā)生率均高于其對(duì)應(yīng)的同源四倍體，如W.默科特橘橙2x的愈傷組織誘導(dǎo)率是其4x的25倍。以敗育胚珠為外植體誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織由胚性珠心組織增殖而來(lái)，而柑橘二倍體加倍成四倍體后果實(shí)種子數(shù)減少[10]，且種子的珠心胚數(shù)減少（數(shù)據(jù)未發(fā)表），可能是四倍體胚性愈傷組織誘導(dǎo)率及體細(xì)胞胚發(fā)生率均低于二倍體的原因。

筆者在本研究中采用3種不同培養(yǎng)基對(duì)柑橘敗育胚珠進(jìn)行離體培養(yǎng)，培養(yǎng)基類型影響不同品種的愈傷組織誘導(dǎo)率。前人研究中表明柑橘M(fèi)GS培養(yǎng)基廣泛適用于柑橘品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)[18，25]，本研究中同樣發(fā)現(xiàn)MGS培養(yǎng)基誘導(dǎo)7個(gè)柑橘品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均為最高。除溫州蜜柑外，利用MK培養(yǎng)基不經(jīng)過(guò)胚狀體發(fā)生途徑直接誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率高于其他兩種培養(yǎng)基，并且愈傷組織狀態(tài)更為松軟，顏色偏白，可能0.5 mg·L-1 KT更有利于誘導(dǎo)柑橘形成疏松的胚性愈傷組織。對(duì)于3個(gè)溫州蜜柑品種，MK培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織結(jié)構(gòu)較為致密、顏色偏黃，而MGS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地疏松、顏色偏白、增殖旺盛。前人研究發(fā)現(xiàn)溫州蜜柑愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有密切關(guān)系，添加GA3和麥芽提取物（ME）有利于溫州蜜柑愈傷組織生長(zhǎng)[26]，本研究在添加了GA3和ME的MGS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出的溫州蜜柑的愈傷組織的狀態(tài)良好，與前人報(bào)道結(jié)果相似。

柑橘無(wú)核品種由于長(zhǎng)期嫁接繁殖累積多種病害。無(wú)核品種沒(méi)有種子，不能利用珠心胚實(shí)生苗脫毒，而莖尖微芽嫁接操作要求高，脫毒可能不完全[27]。筆者在本研究中通過(guò)誘導(dǎo)胚性愈傷組織并再生國(guó)慶1號(hào)溫州蜜柑、倫晚臍橙和早紅臍橙植株均未檢測(cè)出果園最常見(jiàn)的衰退病和黃脈病病毒，說(shuō)明胚性愈傷組織通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生植株能達(dá)到無(wú)毒的效果，為無(wú)核品種提純復(fù)壯的無(wú)毒種苗。早紅臍橙是由羅伯遜臍橙和溫州蜜柑構(gòu)成的周緣嵌合體，其L1層來(lái)源于溫州蜜柑（果肉），L2/L3層來(lái)源于羅伯遜臍橙（果皮和生殖細(xì)胞）[23]。根據(jù)“原套-原體”學(xué)說(shuō)，果實(shí)的生殖細(xì)胞由L2層細(xì)胞衍生而來(lái)，可遺傳給后代；早紅臍橙愈傷組織再生苗由多胚的珠心組織發(fā)育而來(lái)，屬于L2層，因此其再生植株應(yīng)為羅伯遜臍橙。InDel標(biāo)記檢測(cè)證明早紅臍橙胚性愈傷組織再生植株確為羅伯遜臍橙。

4結(jié)論

筆者在本研究中通過(guò)離體培養(yǎng)柑橘成熟果實(shí)的敗育胚珠，經(jīng)誘導(dǎo)和馴化獲得3個(gè)品種的二倍體/四倍體的胚性愈傷組織，為柑橘多倍體研究提供了穩(wěn)定易獲得的離體材料；二倍體的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和胚狀體發(fā)生率均高于對(duì)應(yīng)品種的四倍體。利用體細(xì)胞胚發(fā)生誘導(dǎo)獲得5個(gè)多胚無(wú)核品種的愈傷組織再生苗，經(jīng)鑒定不攜帶果園常見(jiàn)的黃脈病和衰退病，為品種提純復(fù)壯提供種苗。嫁接嵌合體早紅臍橙的愈傷組織再生苗經(jīng)過(guò)InDel標(biāo)記鑒定為羅伯遜臍橙。

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