胡柚新品種01-7的AS-PCR和dCAPS標(biāo)記開發(fā)與應(yīng)用

摘要：【目的】挖掘胡柚新品種01-7和普通胡柚間的差異單核苷酸多態(tài)性（SNP），據(jù)此開發(fā)可區(qū)分01-7與其他胡柚的分子標(biāo)記?！痉椒ā繉?duì)01-7a和普通胡柚ZZ（祖宗樹）進(jìn)行全基因組重測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析方法挖掘兩份材料間的純合SNP。采用PCR、克隆結(jié)合Sanger測(cè)序?qū)NP的正確性進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)而開發(fā)等位基因特異PCR（AS-PCR）和衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性（dCAPS）分子標(biāo)記體系，最后應(yīng)用12份胡柚材料就AS-PCR和dCAPS分子標(biāo)記的普適性進(jìn)行評(píng)估?！窘Y(jié)果】對(duì)01-7a和普通胡柚ZZ重測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，共獲得高質(zhì)量堿基數(shù)36.06 Gb。利用生物信息學(xué)手段挖掘出一個(gè)純合SNP：Chr1_7111834_G/A。01-7a和普通胡柚ZZ在該SNP位點(diǎn)的基因型分別是A/A和G/G，這一結(jié)果得到了經(jīng)典的基因克隆-Sanger測(cè)序確認(rèn)?；诖薙NP開發(fā)了AS-PCR和dCAPS分子標(biāo)記，經(jīng)對(duì)12份胡柚材料測(cè)試，表現(xiàn)符合預(yù)期：AS-PCR-F1在所有4份01-7中擴(kuò)增出特異條帶，而在其他胡柚材料中無(wú)擴(kuò)增；AS-PCR-F2在01-7中無(wú)擴(kuò)增，在其他胡柚材料（脆紅除外）中擴(kuò)增出特異條帶；所有4份01-7材料在dCAPS分析中出現(xiàn)酶切條帶，而在其他胡柚材料（脆紅除外）中不被酶切。脆紅因突變產(chǎn)生天然的酶切識(shí)別位點(diǎn)而被酶切。經(jīng)典的基因克隆-Sanger測(cè)序結(jié)果確認(rèn)兩種標(biāo)記正確區(qū)分了基因型，并發(fā)現(xiàn)脆紅有著不同于其他胡柚的分子標(biāo)記條帶是由于它在該SNP位點(diǎn)側(cè)翼還有額外的序列變異?！窘Y(jié)論】基于全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)挖掘出01-7a胡柚和普通胡柚ZZ間的一個(gè)純合SNP，據(jù)此開發(fā)了AS-PCR和dCAPS分子標(biāo)記，該兩標(biāo)記可區(qū)分01-7、脆紅、夏紅和其他胡柚。

關(guān)鍵詞：胡柚；全基因組重測(cè)序；SNP；AS-PCR；dCAPS

中圖分類號(hào)：S666.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1009-9980（2024）07-1310-12

Development and application of AS-PCR and dCAPS markers for dis-criminating new cultivar 01-7 Huyou（Citrus changshanensis）

WU Yijing1，ZHANG Huiyi1，MIAO Changjiu2，WANG Lixia3，YANG Xingliang3，CHEN Wenbo2，XU Changjie1，2*，CHEN Kunsong1，2

（1Department of Horticulture，College of Agriculture and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，Zhejiang，China;2Zhe-jiang Key Laboratory of Horticultural Crop Quality Improvement，Hangzhou 310058，Zhejiang，China;3Changshan Agricultural Charac-teristic Industry Development Center，Changshan 324200，Zhejiang，China）

Abstract：【Objective】Huyou（Citrus changshanensis K.S.Chen et C.X.Fu）is a local characteristic citrus species in China with a history of over a hundred years，and its main production area is in Chang-shan county，Quzhou City，Zhejiang province.After a long process of propagation by seeds and selec-tion by seedlings，new cultivars/lines such as Cuihong，Hongrou huyou，Xiahong，Huyou elite plant a，Huyou elite plant band 01-7 were obtained from the ordinary huyou population.Among them，01-7 has become the main huyou cultivar to be extended because of its strong cold resistance，as well as long storage longevity and slight-but-special bitter flavor in the fruit.However，there is a high degree of simi-larity between different accessions of huyou，and it is difficult to distinguish among them with naked eyes in terms of sapling morphology.With the progresses in techniques on genome sequencing and asso-ciated single nucleotide polymorphism（SNP）analysis，SNP mining and marker development are be-coming an efficient and accurate way to discriminate close cultivars.However，to date，there has been no study on SNP based molecular markers for discriminating huyou accessions.The aim of this study was to mine homozygous SNP（s）present between 01-7 and ordinary huyou，and to develop efficient and accurate molecular markers for identifying 01-7.【Methods】Whole genome resequencing was per-formed on 01-7a and ordinary huyou ZZ（ancestral tree），and after obtaining high quality sequencing da-ta，bioinformatics analysis tools were utilized to identify homozygous SNPs between these two acces-sions.The authenticity of SNPs predicted in silico was verified by PCR，cloning combined with Sanger sequencing.Then allele-specific polymerase chain reaction（AS-PCR）and derived cleaved amplified polymorphic sequences（dCAPS）molecular markers were developed based on the obtained SNP infor-mation，and finally，the applicability of molecular markers was evaluated by the performance of AS-PCR and dCAPS molecular markers in 12 huyou accessions covering main production bases and main cultivars/lines/plants.【Results】After removal of adaptor sequences，contamination and low-quality reads from raw reads，a total of 120.21 M of high-quality reads were obtained，and 36.06 Gb of high-quality bases were obtained.The average scores of Q20 and Q30 were 96.55%and 89.97%，respective-ly，indicating a high quality of data.After mapping reads to the pummelo reference genome，the average mapping rate was 98.54%，and the 1′genome coverage was above 95%，which was close to the whole genome coverage.A homozygous SNP，i.e.，Chr1_7111834_G/A，was identified through bioinformatics analysis.The genotype of 01-7a at this SNP site was A/A，while that of the ordinary huyou ZZ was G/G，which was consistent with the results obtained by traditional gene cloning and Sanger sequencing.Based on this SNP，AS-PCR and dCAPS molecular markers were designed，and the performance of these two markers in 12 huyou accessions was evaluated.As expected，for AS-PCR marker，with AS-PCR-F1 primer，a specific band of 205 bp in size was amplified in all four 01-7 accessions，while no band was amplified in the other huyou accessions;with AS-PCR-F2 primer，no band was amplified in neither of four 01-7 accessions，while the amplification of the specific band of 205 bp was successfully seen in other huyou accessions except for Cuihong.The result indicated that both pairs of allele-specific primers could identify 01-7.However，an exception occurred where Cuihong did not show amplifica-tion bands with both pairs of allele-specific primers，and the Sanger sequencing results of SNP flanking sequence showed that the above phenomenon was due to the presence of three nucleotide mutations in the forward primer region of Cuihong，which resulted in tremendous loss of complementarity for the primers to pair with the DNA template.For dCAPS marker，PCR product of 176 bp can be amplified from all four 01-7 accessions and can be cleaved by restriction endonuclease FspBI into 24 bp and 152 bp bands，while that from the other huyou accessions，except for Cuihong，can be amplified but cannot be cleaved by the enzyme.For Cuihong dCAPS，the PCR product was cleaved into 62 bp and 117 bp bands due to a mutation that created a natural cleavage recognition site as revealed by the Sanger sequenc-ing.The results of Sanger sequencing of 12 huyou accessions further demonstrated that the genotype pre-diction by the two markers was correct.【Conclusion】In this study，using the whole-genome resequenc-ing data obtained from 01-7a huyou and ordinary huyou ZZ，we identified a homozygous SNP，i.e.，Chr1_7111834_G/A，with the genotype A/A for 01-7 and G/G for the ordinary huyou.Subsequently，based on this SNP，AS-PCR and dCAPS markers were developed.These markers can not only distin-guish 01-7 from ordinary huyou but also differentiate it from Huyou elite plant a，Huyou elite plant b，Cuihong and Xiahong，demonstrating stable performance.The application of these molecular markers enables the authentication of 01-7 saplings，ensures sapling purity and thereby supports the extension of 01-7.

Keywords：Huyou;Whole genome resequencing;SNP;AS-PCR;dCAPS

胡柚（Citrus changshanensis K.S.Chen et C.X.Fu）又名金柚，是一種主產(chǎn)于浙江省衢州市的地方特色柑橘[1-3]。胡柚花型較大、果皮較厚、囊衣稍厚、果肉微苦、部分種子具單胚性，具有柚的特征；同時(shí)，與柚相比，胡柚翼葉小、果型小、果肉軟而多汁、部分種子具有多胚性，又不同于柚[1-3]。早在1987年，吳耕民[3]通過形態(tài)特征比較，提出胡柚可能是由柚與甜橙自然雜交而來(lái)。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，學(xué)者們先后應(yīng)用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）和簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）等分子標(biāo)記進(jìn)行分析，認(rèn)為胡柚起源與柚和甜橙密切相關(guān)[4-5]。在柑橘類中，起源于柚和甜橙的雜種只有葡萄柚。但胡柚抗寒性明顯強(qiáng)于葡萄柚，這表明胡柚可能并不起源于柚和甜橙的雜交。先前筆者基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析，發(fā)現(xiàn)柚和酸橙最有可能是胡柚的親本[6]，這與新近基于基因組分析提出的胡柚具有酸橙和柚的遺傳背景[7]這一結(jié)論一致。柑橘易發(fā)生種間雜交[8]，但目前為止，源于柚與酸橙雜交的就只有胡柚一種，使得胡柚成為一種獨(dú)特的雜柑。胡柚耐寒、耐貯、具獨(dú)特微苦風(fēng)味，鮮食、加工（如用于雙柚汁）和入藥（作為衢枳殼[9]）兼用，深受消費(fèi)者歡迎，給當(dāng)?shù)貛?lái)了可觀的經(jīng)濟(jì)收益，成為中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品和浙江省重點(diǎn)開發(fā)與推廣應(yīng)用的名特優(yōu)產(chǎn)品。

胡柚栽培歷史悠久，位于常山縣青石鎮(zhèn)澄潭村的祖宗樹是現(xiàn)存最古老的實(shí)生胡柚樹，樹齡接近120 a（年）。胡柚在良種選育過程中經(jīng)歷了較長(zhǎng)的零星種植和實(shí)生繁殖時(shí)期[10]，從普通胡柚中實(shí)生選育了脆紅、紅肉胡柚、夏紅橘柚（也稱紅皮胡柚）、胡柚優(yōu)株a、胡柚優(yōu)株b和01-7等品種/優(yōu)系/優(yōu)株，其中01-7因風(fēng)味濃、耐貯藏、抗性強(qiáng)等特點(diǎn)成為目前胡柚產(chǎn)業(yè)的主導(dǎo)推廣品種。然而，不同胡柚間在苗木形態(tài)上具有高度相似性，肉眼難以區(qū)分。

相較于形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和同工酶等鑒別技術(shù)，分子標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、不受環(huán)境因素的影響等優(yōu)點(diǎn)，因而被廣泛用于果樹品種鑒別，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）、單核苷酸多態(tài)性（SNP）等在內(nèi)的各種分子標(biāo)記得到發(fā)展和應(yīng)用[10-13]。近十余年來(lái)隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SNP因具有高通量、分布廣、二等位性等特點(diǎn)，成為最具應(yīng)用潛力的第三代分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于果樹分子標(biāo)記輔助育種[14-18]。在品種鑒定方面，SNP已同SSR一起作為國(guó)內(nèi)《植物品種鑒定DNA指紋方法總則》（NY/T 2594—2016）推薦的分子標(biāo)記方法。迄今，出現(xiàn)了基于各種原理的SNP分型方法，如等位基因特異PCR（AS-PCR）、酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（CAPS）、衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性（dCAPS）、高分辨熔解曲線分析（HRMA）、競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異PCR（KASP）等[19]。在這些SNP分型方法中，最便利和普適的當(dāng)屬AS-PCR和dCAPS。

AS-PCR是根據(jù)SNPs位點(diǎn)的野生型和突變型等位基因序列設(shè)計(jì)引物，通過等位基因特異引物和模板DNA的結(jié)合情況對(duì)SNP進(jìn)行基因分型。相較于其他分型方法，AS-PCR具有對(duì)設(shè)備要求不高、成本低、操作易等優(yōu)點(diǎn)。dCAPS標(biāo)記是一種CAPS標(biāo)記變型，通過人為引入錯(cuò)配堿基制造酶切位點(diǎn)，從而突破SNP需出現(xiàn)在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)這一限制，且具有共顯性、操作簡(jiǎn)單、適用性強(qiáng)等特點(diǎn)。因此，開始應(yīng)用AS-PCR和dCAPS標(biāo)記鑒別果樹品種。如Heo等[20]以宮川溫州蜜柑及其新突變體Ara-unshiu為試材，將存在于兩者間的純合SNP開發(fā)成AS-PCR標(biāo)記，成功地將突變體、宮川溫州蜜柑和其他柑橘進(jìn)行區(qū)分。又如Peng等[21]基于桃液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因（PpTST1）第三外顯子的一個(gè)SNP開發(fā)了dCAPS標(biāo)記，成功地對(duì)18份桃材料進(jìn)行了分型。雖然基于SNP的分子標(biāo)記在果樹品種鑒別中的應(yīng)用已經(jīng)開始普及，但在胡柚上仍是空白。因此，急需開發(fā)基于DNA水平的分子標(biāo)記，建立品種/優(yōu)系/優(yōu)株鑒定體系，以保障苗木的準(zhǔn)確性和純度，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

筆者在本研究中旨在利用全基因組重測(cè)序技術(shù)對(duì)01-7a胡柚和普通胡柚ZZ（祖宗樹）進(jìn)行重測(cè)序，挖掘出兩個(gè)材料之間的差異SNP，通過將SNP轉(zhuǎn)化成AS-PCR和dCAPS標(biāo)記，以期區(qū)分01-7與其他胡柚，填補(bǔ)胡柚分子鑒別研究上的空白，解決胡柚苗木混雜問題，為產(chǎn)業(yè)上實(shí)施新品種種苗鑒別提供技術(shù)保障。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

用于重測(cè)序的普通胡柚ZZ（祖宗樹）幼嫩葉片采摘于浙江省衢州市常山縣青石鎮(zhèn)澄潭村，用于重測(cè)序的01-7a幼嫩葉片采摘于浙江大學(xué)（常山）現(xiàn)代發(fā)展研究中心試驗(yàn)示范基地。用于標(biāo)記應(yīng)用檢驗(yàn)的12份胡柚材料覆蓋主產(chǎn)區(qū)主要基地和主要類型，具體包括取自4個(gè)基地的01-7（01-7a、01-7b、01-7c、01-7d）、3個(gè)基地的普通胡柚（HYa、HYb、HYc）、2個(gè)胡柚優(yōu)株（HYYa、HYYb）、脆紅（CH）、紅肉胡柚（HR）和夏紅橘柚（又名紅皮胡柚，XH）（表1）。

表1用于標(biāo)記應(yīng)用檢驗(yàn)的12份胡柚資源信息表

1.2 DNA提取

用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[22]提取胡柚基因組DNA，將DNA稀釋至100 ng·μL-1備用。

1.3全基因組重測(cè)序分析

采集01-7a和普通胡柚ZZ幼嫩葉片，委托深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序。使用DNBSEQ-T7測(cè)序儀，采用PCR-free文庫(kù)構(gòu)建方法，測(cè)序讀長(zhǎng)為PE150。利用fastqc對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，用trimmomatics v0.39去除接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)。以晚白柚基因組（http：//citrus.hzau.edu.cn/data/Ge-nome_info/HWB.v 1.0/HWB.v1.0.genome.fa）為參考基因組建立索引，利用BWA-MEM v0.7.17[23]將測(cè)序片段比對(duì)到參考基因組上，利用shell腳本去掉map-ping質(zhì)量值小于30的片段。使用PICARD（http：//broadinstitute.github.io/picard/）去除重復(fù)和冗余片段。使用BCFtools v1.9[24]和GATK v3.6[25]進(jìn)行SNP-calling，取交集位點(diǎn)做后續(xù)分析。

1.4純合SNP挖掘

從檢測(cè)到的全基因組變異中挖掘純合SNP，方法和參數(shù)如下：（1）使用vcftools軟件初次過濾，去除堿基質(zhì)量值小于30、測(cè)序深度大于60或小于10的位點(diǎn)，篩選出二等位位點(diǎn)；（2）使用GATK軟件的VariantFiltration模塊進(jìn)行二次過濾，過濾條件為“QUAL＜30.0||QD＜2.0||MQ＜40.0||FS＞60.0||SOR＞3.0”。在以上過濾條件下得到高質(zhì)量的SNP集合，篩出集合中01-7a和普通胡柚ZZ之間的純合差異SNP，最后結(jié)合IGV基因組瀏覽器檢查這些位點(diǎn)在bam文件中的信息，篩選等位基因頻率大于90%的SNP，選擇其中一個(gè)SNP用于序列驗(yàn)證及后續(xù)分子標(biāo)記開發(fā)。

1.5含SNP片段的克隆與測(cè)序驗(yàn)證

采用基因克隆和Sanger測(cè)序進(jìn)行SNP驗(yàn)證。根據(jù)vcf文件中的定位信息從參考基因組提取SNP上下游各600 bp序列，使用Primer3web version 4.1.0（https：//primer3.ut.ee/）在SNP兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，上游引物Chr1_7111834_G/A-F序列為：5'-TGTCT-GGGTTCGTTTGTAATCA-3'，下游引物Chr1_7111834_G/A-R序列為：5'-CTCCAAAAGTCCAG-CACAGG-3'。以01-7a和普通胡柚ZZ基因組DNA為模板，使用諾唯贊高保真DNA聚合酶產(chǎn)品Phan-ta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（P505）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：1μL Phanta Max Su-per-Fidelity DNA Polymerase，25μL 2×Phanta Max Buffer，1μL dNTP Mix，2μL 10μmol·L-1引物（上游引物和下游引物各2μL），0.1μg模板DNA，補(bǔ)足ddH2O至50μL。PCR循環(huán)程序?yàn)椋?5℃10 min；95℃10 s，57℃15 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。部分PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行Sanger測(cè)序，另外部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)基因克隆操作，選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行Sanger測(cè)序。采用相同的方法對(duì)用于標(biāo)記應(yīng)用的12份胡柚材料的SNP基因型進(jìn)行驗(yàn)證。

1.6 AS-PCR反應(yīng)

應(yīng)用BatchPrimer3 v 1.0（https：//wheat.pw.usda.gov/demos/BatchPrimer3/）網(wǎng)站上的工具設(shè)計(jì)AS-PCR共用引物（下游引物）和2條等位基因特異引物（上游引物），2條等位基因特異引物的差異在于3'末端最后一位堿基，它們分別與SNP的兩個(gè)等位堿基互補(bǔ)配對(duì)。上游等位基因特異引物AS-PCR-F1和AS-PCR-F2的序列分別為：5'-GCAGAGAAATC-GCCTTTGTCA-3'和5'-GCAGAGAAATCGCCTTT-GTCG-3'，下游共用引物AS-PCR-R的序列為：5'-CGTGTGGTCTCCAAAAGTCC-3'。試驗(yàn)確定的最佳反應(yīng)體系為：3μL 2×Taq Master Mix，0.8μL10μmol·L-1引物（上游引物和下游引物各0.8μL），30 ng模板DNA，補(bǔ)足ddH2O至10μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃10 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃5 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠，在110 V穩(wěn)壓電泳25 min后對(duì)凝膠進(jìn)行GelRed染色，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像。

1.7 dCAPS擴(kuò)增與酶切

利用dCAPS Finder 2.0（http：//helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）進(jìn)行dCAPS內(nèi)切酶選擇和上游引物設(shè)計(jì)，引物dCAPS-F的序列為：5'-GAGTCG-CAGAGAAATCGCCTTTGCT-3'。應(yīng)用Primer3 4.1.0設(shè)計(jì)下游引物dCAPS-R，序列為：5'-CTGT-GAAGTTTCAATTGGCCCATTA-3'。PCR反應(yīng)體系為：25μL 2×Taq Master Mix，2μL 10μmol·L-1引物（上游引物和下游引物各2μL），160 ng模板DNA，補(bǔ)足ddH2O至50μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min；95℃10 s，58℃15 s，72℃20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后用于酶切，DNA純化使用杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司的凝膠DNA回收試劑盒＆DNA純化試劑盒。酶切反應(yīng)體系為：2μL 10′FastDigest Green Buffer，2.6μLFspBⅠ，0.5μg PCR純化產(chǎn)物，補(bǔ)足ddH2O至20μL。酶切反應(yīng)條件為：37℃，4 h。采用3%瓊脂糖凝膠，在110 V穩(wěn)壓電泳30 min，之后凝膠經(jīng)Gel-Red染色后成像。

2結(jié)果與分析

2.1全基因組重測(cè)序分析

通過對(duì)01-7a胡柚和普通胡柚ZZ原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去污染、去接頭及去低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，共獲得高質(zhì)量片段數(shù)120.21 M，高質(zhì)量堿基數(shù)36.06 Gb。Q20和Q30的平均得分分別為96.55%和89.97%，可知數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。將測(cè)序片段與晚白柚參考基因組進(jìn)行比對(duì)，平均堿基比對(duì)率達(dá)98.54%，1×基因組覆蓋率達(dá)95%，表明可以以晚白柚作為參考基因組進(jìn)行胡柚分析。平均測(cè)序深度達(dá)到46.75×，可以用于親緣關(guān)系相近樣本的重測(cè)序分析。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表2所示。

2.2 SNP檢測(cè)和驗(yàn)證

比較01-7a和普通胡柚ZZ的基因型，得到530 286個(gè)候選SNP。篩選質(zhì)量值大于30、測(cè)序深度在10到60之間等的高置信度SNP，得到96 114個(gè)，在此基礎(chǔ)上篩選01-7a和普通胡柚ZZ之間的純合SNP，得到23個(gè)。利用IGV基因組瀏覽器檢查bam文件中23個(gè)SNP位點(diǎn)測(cè)序片段的堿基分布情況，篩選出9個(gè)等位基因頻率大于90%的純合SNP，選擇其中一個(gè)位于1號(hào)染色體上第7 111 834個(gè)堿基位上的SNP（命名為Chr1_7111834_G/A）用于序列驗(yàn)證。檢查該SNP所在位點(diǎn)的注釋信息，發(fā)現(xiàn)其位于基因間區(qū)域。

在該SNP兩側(cè)設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物用于測(cè)序驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增得到預(yù)期長(zhǎng)度為498bp的條帶，且無(wú)論是PCR產(chǎn)物直接Sanger測(cè)序還是經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒Sanger測(cè)序，都表明01-7a在這個(gè)位點(diǎn)的基因型是A/A，而普通胡柚ZZ是G/G（圖1），與生信挖掘出的基因型一致，表明該純合SNP真實(shí)存在。

2.3 AS-PCR和dCAPS引物設(shè)計(jì)

鑒于01-7a和普通胡柚ZZ在Chr1_7111834_G/A位點(diǎn)處具有一個(gè)純合SNP，筆者在本研究中旨在基于此SNP開發(fā)能夠鑒別兩個(gè)胡柚材料的AS-PCR和dCAPS引物。

由于AS-PCR引物3'末端堿基的不配對(duì)并不能完全抑制引物和模板的結(jié)合延伸，因此在等位基因特異引物的3'末端倒數(shù)第二位引入1個(gè)堿基的額外錯(cuò)配（圖2）。研究設(shè)計(jì)了兩對(duì)AS-PCR引物，其中下游引物共用，而上游引物具有等位基因特異性：AS-PCR-F1和AS-PCR-F2引物的3'末端堿基分別與01-7a和普通胡柚ZZ相同（圖2）。預(yù)期使用AS-PCR-F1只能從01-7a擴(kuò)增出的條帶，同理AS-PCR-F2只能從普通胡柚ZZ中擴(kuò)增出條帶，條帶長(zhǎng)度為205bp。

因SNP位點(diǎn)不是限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，不能直接開發(fā)酶切擴(kuò)增多態(tài)性（CAPS）標(biāo)記?；赟NP側(cè)翼序列，通過人為引入如圖2所示的錯(cuò)配堿基C，其中一個(gè)等位基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物就擁有FspBⅠ酶切位點(diǎn)，因而開發(fā)了一對(duì)dCAPS標(biāo)記引物（圖2）。該標(biāo)記的預(yù)期結(jié)果是：以兩個(gè)胡柚材料DNA為模板時(shí)均可擴(kuò)增出長(zhǎng)為176bp的條帶，但只有當(dāng)以01-7a胡柚DNA為模板時(shí)，所擴(kuò)增的條帶可以被FspBⅠ酶切成長(zhǎng)度分別為152bp和24bp的條帶（圖2）。

2.4 AS-PCR和dCAPS標(biāo)記開發(fā)

應(yīng)用所設(shè)計(jì)的兩對(duì)AS-PCR引物，以01-7a和普通胡柚ZZ的DNA為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3-A所示。對(duì)01-7a使用AS-PCR-F1為上游引物時(shí)可擴(kuò)增出與預(yù)期長(zhǎng)度205bp相符的條帶，而以AS-PCR-F2為上游引物時(shí)則沒有擴(kuò)增，由此判斷01-7a在Chr1_7111834_G/A位點(diǎn)的基因型為A/A；以普通胡柚ZZ DNA為模板時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果則和01-7a正好相反，即以AS-PCR-F2為上游引物時(shí)可擴(kuò)增得到與預(yù)期長(zhǎng)度205bp相符的條帶而以AS-PCR-F1為上游引物時(shí)則沒有擴(kuò)增，判斷普通胡柚ZZ的基因型是G/G。AS-PCR擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，表明該AS-PCR標(biāo)記正確有效。

應(yīng)用所設(shè)計(jì)的一對(duì)dCAPS引物，以01-7a胡柚和普通胡柚ZZ DNA為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3-B所示，均獲得與預(yù)期長(zhǎng)度176bp相符的條帶。但只有以01-7a胡柚DNA為模板時(shí)，PCR產(chǎn)物可被酶切成兩條長(zhǎng)度分別為152bp和24bp的條帶，由此判斷01-7a在Chr1_7111834_G/A位點(diǎn)的基因型為A/A；以普通胡柚ZZ DNA為模板時(shí)，PCR產(chǎn)物不會(huì)被酶切，表明普通胡柚ZZ的基因型不是A/A。dCAPS分析結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，表明該dCAPS標(biāo)記正確有效。

2.5 AS-PCR和dCAPS標(biāo)記在12份胡柚材料鑒別中的應(yīng)用

為進(jìn)一步驗(yàn)證AS-PCR標(biāo)記和dCAPS標(biāo)記的有效性，將標(biāo)記應(yīng)用于12份胡柚材料的鑒別。這12份胡柚材料覆蓋主產(chǎn)區(qū)的主要基地和主要品種，包括01-7胡柚4份、其他胡柚8份（表1）。結(jié)果表明，AS-PCR-F1特異引物在所有4份01-7胡柚材料中均擴(kuò)增出預(yù)期長(zhǎng)度的條帶，而在其他胡柚材料中均未得到擴(kuò)增（圖4-A）；AS-PCR-F2則在所有4份01-7材料和脆紅中不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，而在其余胡柚中均出現(xiàn)條帶（圖4-B）。dCAPS標(biāo)記分析表明，所有胡柚材料均擴(kuò)增出176bp的條帶（圖5-A）沒有差異，但在使用限制性內(nèi)切酶酶切后，4份01-7胡柚材料均出現(xiàn)152bp的酶切產(chǎn)物，而3份普通胡柚、胡柚優(yōu)株a、胡柚優(yōu)株b、紅肉胡柚、夏紅中條帶未被酶切（圖5-B）。除脆紅外，以上結(jié)果均符合預(yù)期。脆紅在兩種標(biāo)記分析時(shí)均表現(xiàn)出非預(yù)期的情況，表現(xiàn)為在兩個(gè)AS-PCR反應(yīng)中均未能擴(kuò)增出條帶，在dCAPS分析時(shí)經(jīng)酶切產(chǎn)生長(zhǎng)度既非152bp也非176bp的片段。筆者在后文中通過分析Sanger測(cè)序結(jié)果對(duì)此現(xiàn)象作出了解釋。

為確認(rèn)兩種標(biāo)記在這些胡柚材料中對(duì)Chr1_7111834_G/A位點(diǎn)基因分型表現(xiàn)的可靠性，對(duì)12份材料的這一SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、克隆和Sanger測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明，所有4份01-7材料在這個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型都是A/A，而其他胡柚基因型都是G/G（圖6豎框所示），與AS-PCR和dCAPS分析結(jié)果一致。同時(shí)，測(cè)序結(jié)果解釋了為何脆紅在兩個(gè)AS-PCR反應(yīng)中均不能擴(kuò)增出條帶，是因?yàn)榇嗉t在等位基因特異引物處有額外的3個(gè)堿基突變（圖6左橫框所示），導(dǎo)致引物結(jié)合模板DNA的能力被大大削弱。而在dCAPS分析時(shí)脆紅出現(xiàn)非預(yù)期酶切片段則是因?yàn)樵谶@段序列中脆紅存在天然的FspBⅠ識(shí)別位點(diǎn)CTAG（圖6右橫框所示）。值得一提的是，脆紅中存在的天然FspBⅠ識(shí)別位點(diǎn)與人為設(shè)計(jì)dCAPS標(biāo)記時(shí)針對(duì)01-7引入的FspBⅠ識(shí)別位點(diǎn)并不重合，而是相距38bp，因而，脆紅PCR產(chǎn)物被FspBⅠ酶切成62bp和117bp這兩條片段，與01-7不同。因此，綜合運(yùn)用這兩種標(biāo)記不僅可以鑒別出01-7胡柚，還可以鑒別出脆紅。

3討論

品種分子鑒別通常更傾向于使用基于PCR的分子標(biāo)記，但這些方法中有些復(fù)雜耗時(shí)，有些則可靠度不高，如RAPD標(biāo)記鑒定的特異性不強(qiáng)且重復(fù)性較差[26]，SSR標(biāo)記很難區(qū)分遺傳十分相似的品種[27]。隨著下一代測(cè)序技術(shù)的興起，SNPs因數(shù)量豐富、可遺傳、突變頻率較低、二等位性等特點(diǎn)已成為應(yīng)用最廣泛的基因分型標(biāo)記[28]。全基因組重測(cè)序作為一種高通量測(cè)序技術(shù)，擁有成熟的測(cè)序平臺(tái)、多樣的測(cè)序策略、豐富的生信分析工具和數(shù)據(jù)處理流程，并且因其具有較高的全基因組分辨率，使其非常適合用于基因分型[29]。隨著測(cè)序成本日益降低，全基因組重測(cè)序技術(shù)越來(lái)越成為挖掘SNP的重要手段。Pei等[30]對(duì)巨峰、乍娜及其早熟芽變豐早和90-1分別進(jìn)行了全基因組重測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)早熟芽變品種中存在豐富的遺傳變異，通過Sanger測(cè)序驗(yàn)證了巨峰和豐早中的5個(gè)SNP；Guan等[31]利用360份桃種質(zhì)的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)篩選并構(gòu)建了由775個(gè)SNP組成的微陣列芯片。Serra等[32]對(duì)Rocha梨的8個(gè)無(wú)性系進(jìn)行了基因組重測(cè)序，經(jīng)過變異檢測(cè)和注釋，挖掘了位于編碼序列上的216個(gè)SNP。筆者在本研究中對(duì)01-7a和代表普通胡柚的祖宗樹開展了全基因組重測(cè)序，對(duì)SNP進(jìn)行了挖掘。為便于后續(xù)分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用，試驗(yàn)出挖掘純合SNP的生物信息學(xué)分析參數(shù)，并成功獲得一個(gè)純合SNP，開發(fā)了相應(yīng)的AS-PCR和dCAPS標(biāo)記，填補(bǔ)了胡柚上的研究空白，也可為其他果樹開展類似工作提供參考。

AS-PCR標(biāo)記和dCAPS標(biāo)記都是基于PCR的SNP分型方法，有著操作簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，兩者也存在各自缺點(diǎn)。AS-PCR標(biāo)記相較于dCAPS標(biāo)記而言更加經(jīng)濟(jì)，但其對(duì)PCR反應(yīng)體系和程序更加敏感，并且較容易出現(xiàn)假陽(yáng)性[33]，因而對(duì)PCR體系中各組分比例、Tm值、PCR循環(huán)數(shù)等都有更加嚴(yán)格的要求，需要通過設(shè)置梯度試驗(yàn)解決[34]。dCAPS標(biāo)記相較于AS-PCR標(biāo)記更穩(wěn)定，但由于有些內(nèi)切酶較昂貴，在一定程度上增加了dCAPS分析的成本。同時(shí)，dCAPS需要試驗(yàn)適宜的酶切時(shí)間，既要保障充分酶切又要避免“星活性”[35]，以免影響基因型判斷。此外，也并非每個(gè)SNP位點(diǎn)都能通過改變一個(gè)堿基序列引入酶切識(shí)別位點(diǎn)，即有些SNP無(wú)法用于dCAPS標(biāo)記開發(fā)。因此，兩種標(biāo)記方法各有所長(zhǎng)，可結(jié)合使用。

筆者在本研究中開發(fā)的AS-PCR和dCAPS標(biāo)記單獨(dú)應(yīng)用即可區(qū)分01-7胡柚、脆紅與其他胡柚。分子標(biāo)記分析以及對(duì)SNP側(cè)翼序列測(cè)序結(jié)果均表明脆紅與其他胡柚存在較大差異，推測(cè)其在起源上略有不同，這值得后續(xù)進(jìn)一步研究。夏紅橘柚一直存在同物異名現(xiàn)象，它又被稱為紅皮胡柚。根據(jù)SNP側(cè)翼序列，夏紅橘柚與01-7胡柚、普通胡柚、胡柚優(yōu)株a、胡柚優(yōu)株b、紅肉胡柚基本一致（同源率高達(dá)99.6%），因此，宜稱其為紅皮胡柚。筆者在本研究中開發(fā)的標(biāo)記尚不能區(qū)分除01-7胡柚和脆紅之外的其他胡柚材料，后續(xù)可驗(yàn)證更多的純合SNP位點(diǎn)并開發(fā)相應(yīng)的標(biāo)記。

4結(jié)論

利用01-7a和普通胡柚ZZ（祖宗樹）的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，找到了一個(gè)純合SNP（Chr1_7111834_G/A），01-7a和普通胡柚ZZ的基因型分別為A/A和G/G。進(jìn)一步將該SNP開發(fā)成AS-PCR和dCAPS標(biāo)記，在12份胡柚材料中的應(yīng)用表明，兩個(gè)標(biāo)記單獨(dú)應(yīng)用即可將01-7和其他胡柚區(qū)分。由于脆紅在SNP側(cè)翼序列中存在額外變異，導(dǎo)致這兩種分子標(biāo)記還可以將脆紅從其他胡柚中鑒別出來(lái)。筆者在本研究中開發(fā)了能鑒別胡柚品種的分子標(biāo)記，所開發(fā)的分子標(biāo)記可應(yīng)用于01-7胡柚、脆紅的苗木真?zhèn)舞b別，利于苗木純度保障，從而助力新優(yōu)品種的推廣種植?；赟NP側(cè)翼序列，發(fā)現(xiàn)脆紅與其他胡柚的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，夏紅橘柚與除脆紅外的10份胡柚材料的序列同源率高達(dá)99.6%，表明屬于胡柚而非橘柚，應(yīng)稱為紅皮胡柚。

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