蜂糖李種質鑒定中孢粉學與InDel標記的應用

摘要：【目的】尋找能夠特異性地區(qū)分蜂糖李種質和其他李種質，以及蜂糖李中的不同品系（黃皮、青皮和一點紅）的鑒定方法?！痉椒ā窟x擇蜂糖李中的3個品系（黃皮、青皮和一點紅）及其他9個李種質作為研究對象，利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察花粉形態(tài)并進行聚類分析，同時結合重測序數(shù)據(jù)進行分子標記開發(fā)，并利用21份其他李種質對分子標記的準確性進行驗證?！窘Y果】掃描電鏡結果表明，蜂糖李與四月李、三月李在花粉形態(tài)上存在顯著差異，而一點紅蜂糖李與其他蜂糖李相比在花粉外壁紋飾上也存在一定差異。在分子標記開發(fā)方面，篩選出2對表現(xiàn)穩(wěn)定的InDel分子標記，聯(lián)合使用能夠將蜂糖李與其他21份李種質有效區(qū)分，同時還篩選出一對InDel分子標記，可用于區(qū)分蜂糖李中的3個品系?！窘Y論】研究結果為蜂糖李的種質鑒定提供了重要的孢粉學和分子標記依據(jù)，有望對蜂糖李產(chǎn)業(yè)的標準化與品質提升提供幫助。

關鍵詞：蜂糖李；孢粉學；InDel；分子標記；種質鑒定

中圖分類號：S662.3文獻標志碼：A文章編號：1009-9980（2024）07-1297-13

Application of palynology and InDel markers in germplasm identifica-tion in Fengtangli plum

XIE Weiwei1，XU Dantong1，CHEN Fangce1，SONG Zhenfu2，ZHONG Siling2，AO Yanfei2，AN Xing2，WANG Honglin3，HE Yehua1，ZHENG Qianming3*，LIU Chaoyang1*

（1State Key Laboratory of Subtropical Agricultural Biological Resource Conservation and Utilization/College of Horticulture，South Chi-na Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China;2Anshun Academy of Agricultural Sciences，Anshun 561000，Gui-zhou，China;3Institute of Pomology Science，Guizhou Academy of Agricultural Science/Ministry of Agriculture and Rural Affairs Key Laboratory of Crop Genetic Resources and Germplasm Innovation in Karst Region，Guiyang 550006，Guizhou，China）

Abstract：【Objective】Fengtangli，a superior Chinese plum variety that was bred from the local landra-ces in Zhenning county of Anshun City，is renowned for its crisp and tender texture.In recent years，the increasing market demand for Fengtangli seedlings has resulted in a proliferation of inferior and coun-terfeit seedlings being marketed as high-quality products.On the market，the visually similar Siyueli has been seen 1ly sold as Fengtangli，consequently disrupting the market equilibrium.Additionally，distinct lines within the Fengtangli variety have been identified，exhibiting many variations such as yel-low-skinned，green-skinned，and partially red-skinned fruits upon maturation.These phenotypic varia-tions not only affect the fruit quality but also the required cultivation and management practices.The presence of mixed lines complicates standardized orchard management，harvest scheduling and fruit grading processes，negatively impacting the overall economic yield of the orchards.Hence，it isimpera-tive to accurately identify and differentiate the intrinsic variations within Fengtangli as well as between Fengtangli and other plum germplasms to advance standardization and augment the quality control in the Fengtangli industry.【Methods】Flower buds were collected from 5-year-old fruit trees in the or-chard at the stage of flower bud swelling to white bell，and pollen was collected after air-drying under natural conditions.Gold-spray treatment was performed using an ion sputtering instrument under vacu-um，followed by observation of pollen micro-morphology under a scanning electron microscope.Young leaves from the plum germplasms were sampled for DNA extraction via an optimized CTAB method.Targeted InDel loci were identified from resequencing data using bioinformatics tools，and primers for these loci were designed.Amplification via PCR and validation of the InDel markers were performed，with the confirmation conducted through the agarose gel electrophoresis.【Results】This study conduct-ed a systematic analysis of the pollen micro-morphology of Fengtangli and other Chinese plum germ-plasms.The analysis revealed that the pollen of the materials tested exhibited isopolar and radially sym-metric forms with three colporate apertures，conforming to the classification of N3P4C5 type pollen.In view of the polar point，the pollen presented a trifid circula shape，and in view of the equatorial point，it showed an elongate ellipse，reflecting a degree of morphological uniformity.However，significant differ-ences were observed in the polar axis length and equatorial axis length among the germplasms，especial-ly between the Siyueli and Sanyueli compared to the Fengtangli.Within the three Fengtangli lines，the partially red-skinned line had a slightly longer equatorial axis length than the yellow-skinned and green-skinned lines.Moreover，the pollen exine ornamentation of all tested germplasms displayed a“striate-perforate”type，but there were significant differences in the direction of the striations，density and po-rosity.Among the three Fengtangli lines，differences in pollen were primarily reflected in the character-istics of the exine ornamentation.The ridge width was relatively larger in the yellow-skinned line，while the green-skinned and partially red-skinned line had similar ridge numbers，with minor differences in the distance between ridges，particularly in the partially red-skinned line，which had significantly small-er aperture and porosity than the other two lines.Cluster analysis，based on multiple morphological in-dexes of pollen，revealed the similarities and relatedness among the tested plum germplasms.The clus-tering results indicated that the plum germplasms were effectively grouped according to pollen charac-teristics at a certain Euclidean distance criterion，with the Siyueli forming a unique group due to its dis-tinctive pollen morphology.Further analysis showed that the three lines of Fengtangli and several other plum germplasms exhibited high similarity in pollen morphology.These findings provided significant palynological evidence for understanding the classification and relatedness of Fengtangli and related plum germplasms.In the aspect of InDel molecular markers，based on predicted InDel sites from rese-quencing data，two pairs of primers successfully amplified the strips of target DNA in 12 plum germ-plasms.These results showed consistency across multiple PCR assays，demonstrating the effectiveness of these primer combinations and providing a molecular basis for distinguishing Fengtangli from other 21 representative plum germplasms.Concurrently，the primer P3-38 produced specific bands through PCR amplification in the three main lines of Fengtangli，effectively distinguishing them.【Conclusion】Palynological analysis revealed that the distinctions among different species within the prunus and three main lines of Fengtangli were primarily concentrated on exine ornamentation.Based on pollen appear-ance and exine ornamentation data，the cluster analysis indicated significant differences between Feng-tangli and both Sanyueli and Siyueli，suggesting that their relatedness may be relatively distant.Thus，palynology can serve as an auxiliary method for distinguishing them.Although palynological results can express a broader range of genetic information，but as a method for variety identification，they pos-sess certain limitations.Meanwhile，the InDel molecular markers developed by resequencing were high-ly effective for identifying three main lines of Fengtangli as well as its differentiation from other Chi-nese plum germplasms，compensating the limitation inherent in palynology.

Keywords：Fengtangli;Palynology;InDel;Molecular marker;Germplasm identification

蜂糖李是由貴州省安順市農業(yè)科學院等單位從安順市鎮(zhèn)寧縣地方李品種中選育出的優(yōu)質中國李品種，口感脆嫩，入口化渣，風味獨特，無酸澀苦味，是李中珍品[1]。近年來，由于蜂糖李市場行情持續(xù)向好，其栽培生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，對優(yōu)質純正種苗的需求也急劇增加，導致蜂糖李苗木市場出現(xiàn)了一些以次充好、以假亂真的問題；在果實成熟季節(jié)，還存在著外觀與蜂糖李相似，但口感相差甚遠的四月李等地方李品種，冒充蜂糖李出售的現(xiàn)象，擾亂了蜂糖李的生產(chǎn)和銷售秩序。此外，蜂糖李中還存在著一定程度的品系混雜問題，在果實品質、果皮顏色、葉片形態(tài)、樹體產(chǎn)量等方面出現(xiàn)了不同類型的變異。根據(jù)成熟時果皮顏色的差異，發(fā)現(xiàn)有黃皮蜂糖李（成熟時果皮為黃色）、青皮蜂糖李（成熟時果皮為綠色）、一點紅蜂糖李（成熟時靠近果柄的部位出現(xiàn)不規(guī)則片狀紅色）等品系，他們在果實品質、配套栽培管理技術方面也存在一定程度的差異；品系的混雜會給生產(chǎn)中果園標準化管理、果實采摘和果品分級等方面帶來一定的不便，影響果園的綜合經(jīng)濟效益。因此，鑒定和區(qū)分蜂糖李以及蜂糖李品種內的品系類型，對蜂糖李產(chǎn)業(yè)的標準化和品質提升至關重要。為了蜂糖李產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，尋找有效方法進行蜂糖李種質鑒定，區(qū)分蜂糖李內自然變異的群體以及與其他李種質之間的差異具有重要意義。

在種質分類與鑒定中，常用的方法包括形態(tài)學標記、孢粉等方面的微形態(tài)標記、同工酶與分子標記等[2]。植物花粉的形態(tài)特征通常相對穩(wěn)定，攜帶豐富的遺傳信息，因此對花粉外觀的研究已經(jīng)成為常見的種質鑒定和植物分類方法，在果樹、蔬菜、花卉等各類園藝作物中有廣泛的應用[3-5]。分子標記在基因水平上標記遺傳差異，不受組織、器官或環(huán)境的影響，在果樹種質鑒定中也得到廣泛應用。隨著測序技術的發(fā)展，分子標記已發(fā)展至第三代，其中SSR等第二代分子標記在李的種質鑒定中應用較為廣泛[6-7]。InDel分子標記作為第三代分子標記，通過檢測基因組中核苷酸片段的插入和缺失而開發(fā)，具有條帶清晰、穩(wěn)定性強以及經(jīng)濟便捷等特點。在柚[8]、烏菜[9]、辣椒[10]等園藝作物的種質鑒定中已有成功應用，然而在中國李種質鑒定與分類中還未見報道。開發(fā)更多類型的分子標記對完善蜂糖李的鑒別體系具有非常重要的作用。

筆者選擇了黃皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一點紅蜂糖李這3種成熟時果實表皮顏色不同的蜂糖李品系、6個蜂糖李原產(chǎn)地貴州安順市的本地李種質（蜜李1號、安順本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打幫李、冰脆李），以及3個其他地區(qū)的李種質（臺灣蜜李、三月李、三華李）作為試驗材料，結合孢粉學和InDel分子標記技術，分析蜂糖李與其他李種質在花粉形態(tài)和基因層面上的差異，并利用另外來自不同區(qū)域的12個代表性的李品種對篩選到的分子標記進行進一步驗證，同時尋找蜂糖李3個品系之間的差異，以期為蜂糖李的種質鑒定和未來的育種工作提供孢粉學與分子層面的依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

筆者選取的試驗材料主要來源于貴州省安順市農業(yè)科學院與廣東省廣州市華南農業(yè)大學所屬的李種質資源圃。12份李種質涵蓋了黃皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一點紅蜂糖李、蜜李1號、安順本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打幫李、冰脆李、臺灣蜜李、三月李及三華李，這些被用于進行孢粉學分析和分子標記試驗，具體信息詳見表1。上述種質的果實成熟期表型詳見圖1。此外，為了驗證分子標記的準確性，收集了包括粉黛脆李、鳳凰李、脆紅李、國峰7號、大紅袍、黃干核李、嶺溪李、檇李、黃金奈李、恐龍蛋、味帝及紫葉李等在內的另外12份李種質材料。

1.2花粉的收集與微觀形態(tài)觀察

選擇果園內5年生果樹，待其花蕾膨大為鈴鐺狀、雌雄蕊未顯露、花朵即將開放時，即大蕾期，采摘花蕾。用干凈的鑷子小心去掉花瓣和花萼，收集花藥，將花藥平鋪在硫酸紙上自然陰干48h，待花粉散出后，收集花粉存放于1.5 mL離心管中，在離心管中加入少數(shù)硅膠粒使花粉保持干燥，常溫存放。

將花粉均勻散布在貼有雙面膠的樣品臺上，在真空狀態(tài)下使用離子濺射儀（HITACHI，MC1000，日本）進行噴金處理，并置于掃描電子顯微鏡（HIT-ACHI，SU8100，日本）下進行觀測，選擇具有代表性的極面和赤道面視野拍照，并觀察局部的形態(tài)與紋飾特征。

1.3 DNA提取與重測序

采集供試李種質的幼嫩葉片，采用改良版的CTAB法提取黃皮蜂糖李、青皮蜂糖李、一點紅蜂糖李、蜜李1號、安順本地晚熟李、晚熟青脆李、四月李、打幫李的DNA[11]。使用超聲波法將DNA片段化，并對處理后的片段DNA進行純化、末端修復、3'端加A、連接測序接頭，構建文庫，再利用Illumina平臺進行測序，將原始數(shù)據(jù)過濾后得到Clean reads，將數(shù)據(jù)對比到已發(fā)表的三月李參考基因組（https：//www.rosaceae.org/Analysis/9450778）上，并使用BWA軟件將Clean reads與參考基因組序列對比，上述的重測序工作由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 InDel位點篩選與引物設計

使用Genome Analysis Toolkit（GATK）v3.8軟件對InDel位點進行初步預測，后使用基因組可視化工具Integrative Genomics Viewer（IGV）v2.12.3軟件進行精細篩選，篩選蜂糖李中特異的InDel位點（圖2），記錄差異區(qū)域的具體位置信息。使用TBtools-Ⅱv2.0軟件中的Fasta Extract功能，提取差異區(qū)域上下游大約1 kb的序列。利用Primer Premier 5.0軟件，在差異區(qū)域上下游位置設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 InDel標記檢測

使用江蘇康為世紀生物科技股份有限公司的2×Flash PCR MasterMix（Dye）作為PCR反應試劑。PCR擴增體系（20μL）：10μL 2×Flash PCR MasterMix（Dye），0.8μL Forward Primer（10μmol·L-1），0.8μL Reverse Primer（10μmol·L-1），1μL模板DNA（質量濃度20～60 ng·μL-1），7.4μL ddH2O。擴增程序為：98℃預變性2 min；94℃變性10 s；55℃退火15 s；72℃延伸7 s，34次循環(huán)，72℃延伸1 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6數(shù)據(jù)分析

使用Image J v2.9.0軟件分析花粉的極軸長、赤道軸長、花粉粒形狀、花粉大小、條脊寬、溝脊寬和網(wǎng)孔密度等形態(tài)指標數(shù)據(jù)（n=10）。花粉形態(tài)描述主要參考《孢粉學手冊》[12]，花粉粒形狀按極赤比（P/E）劃分，P/E＞2為超長球形，2≥P/E＞1.14為長球形。使用SPSS 22.0進行單因素方差分析和聚類分析。在單因素方差分析中，采用Duncan’s法進行差異比較，對花粉數(shù)據(jù)應用平均連鎖法，并基于歐氏距離進行聚類分析。使用Photoshop 2021軟件對圖像進行標注和組圖處理。

2結果與分析

2.1花粉微觀形態(tài)特征

2.1.1極性、對稱類型及萌發(fā)器官如圖3所示，所有供試材料的花粉粒均為單?；ǚ郏ǚ鄣某嗟烂婢蓪⑵浞指顬閷ΨQ的兩部分，即花粉為等極?；ǚ劬哂?個對稱面，呈輻射對稱，并且具有3個環(huán)狀孔溝，三溝均勻垂直于赤道分布。根據(jù)NPC分類系統(tǒng)[12]，所有供試材料的花粉均屬于N3P4C5型。

2.1.2形狀及大小所有供試材料花粉的極面觀均為三裂圓形，赤面觀均為長橢圓形，但種質間的極軸與赤道軸長度存在一定差距。由表2可知，所有花粉的極軸長度為36.64～44.83μm，均值40.91μm，根據(jù)Erdtman[12]的花粉大小分類標準，本研究中的所有供試材料的花粉均屬于中等大?。?5～50μm）。但四月李的花粉極軸長度為36.64μm，顯著小于其他李種質；三月李的花粉極軸長度為44.83μm，在供試材料中最長；兩者與蜂糖李花粉在極軸長度上差距較大。黃皮、青皮和一點紅蜂糖李的花粉極軸長度相似，三者的極軸長平均值約為40.51μm。

所有供試材料花粉的赤道軸長度平均值為22.04μm，不同李種質的花粉在赤道軸上差距較大，蜜李1號、晚熟青脆李、四月李、三月李的赤道軸長度小于蜂糖李與其他李種質。在蜂糖李中，一點紅蜂糖李的花粉赤道軸稍長于黃皮與青皮蜂糖李。根據(jù)極赤比劃分花粉形狀，除蜜李1號、晚熟青脆李、三月李為超長球形外（P/E＞2），蜂糖李與其他李種質皆為長球形（2≥P/E＞1.14）。

2.1.3外壁紋飾供試李種質的外壁紋飾均為“條紋-穿孔”，即由條紋與穿孔組成，條脊大部分接近縱向平行排列，但不同種質在條紋與穿孔細節(jié)上存在較大差異，例如條紋走向、條紋疏密程度、孔頻等（表3）。

在蜂糖李的3個品系中，花粉差異主要體現(xiàn)在外壁紋飾特征上。黃皮蜂糖李的脊寬相對較大，而青皮蜂糖李與一點紅蜂糖李的脊寬數(shù)值相近，三者在脊間距方面差異相對較小。此外，在蜂糖李的3個品系中，一點紅蜂糖李的孔頻顯著小于其他兩個品系，孔徑顯著小于青皮蜂糖李，與黃皮蜂糖李差異不顯著。蜂糖李與其他供試種質在外壁紋飾特征上也存在較大差異。蜜李1號、冰脆李和三華李的脊寬相對較小，而安順本地晚熟李、臺灣蜜李和三月李的脊寬較大，上述6個種質在脊寬上與蜂糖李存在顯著差異。此外，安順本地晚熟李在脊間距上顯著大于其他供試李種質，而四月李則小于其他李種質。

2.1.4聚類分析結果根據(jù)極軸長、赤道軸長、極赤比、花粉形狀、脊寬、脊間距、孔徑、孔頻等8項指標，對供試李種質的孢粉數(shù)據(jù)進行聚類分析。其中，花粉形狀作為描述性特征，因而在聚類分析中將其數(shù)字化，長球形與超長球形分別編號為0與1。聚類分析結果如圖4所示，顯示了花粉的相似度，同時有助于確定不同種質之間的親緣關系。

在歐氏平方距離為20時，供試的李種質被劃分為兩大組，其中四月李獨立成一組。而在歐氏平方距離為15時，供試的李種質被劃分為三大組，四月李和三月李被分開，表明他們的花粉形態(tài)與蜂糖李存在較大差異，親緣關系可能較遠。與此同時，3個蜂糖李品系與打幫李、安順本地晚熟李、臺灣蜜李被聚為最小的一支，這說明他們的花粉形態(tài)相似。

2.2蜂糖李分子標記開發(fā)與篩選

筆者在本研究中設計并使用了多對引物用于蜂糖李分子標記的開發(fā)與篩選，最終篩選到2對引物用于鑒別蜂糖李，他們在本研究的12個李種質中均成功擴增出目標條帶，引物序列如表4所示。

為進一步驗證本研究篩選的引物的特異性和準確性，筆者額外收集了來自中國不同地理區(qū)域的12個李種質的DNA樣本，進行InDel分子標記的驗證分析。這些樣本主要包括西南地區(qū)的粉黛脆李、鳳凰李、脆紅李；北方地區(qū)的國峰、大紅袍、黃干核；華南地區(qū)的嶺溪李；華東地區(qū)的檇李、奈李；以及杏李中的恐龍蛋、味帝和用于觀賞的種質紫葉李。

使用引物P1-21檢測時，蜂糖李與臺灣蜜李、黃干核李、嶺溪李帶型一致，為雙條帶，而其他李種質表現(xiàn)為單帶型。當使用引物P4-46進行檢測時，蜂糖李與三華李的帶型相同，與其他李種質的帶型均存在差異，盡管粉黛脆李、鳳凰李等種質也表現(xiàn)為雙條帶，但其中一條帶的位置在500bp以下，與蜂糖李和三華李明顯不同。經(jīng)多次PCR檢測，結果穩(wěn)定一致，因此使用引物P1-21與P4-46結合，可以區(qū)分出蜂糖李與本研究中所用的其他李種質（圖5）。

同時，筆者還利用重測序數(shù)據(jù)中預測到的InDel位點，對蜂糖李的3個品系，即黃皮、青皮和一點紅，進行了分子標記引物的設計。經(jīng)過一系列的引物篩選，筆者發(fā)現(xiàn)標記P3-38可在3個蜂糖李品系中經(jīng)PCR擴增產(chǎn)生不同的條帶，黃皮蜂糖李在100bp位置產(chǎn)生一個特異的條帶，青皮蜂糖李在100～250 bp之間產(chǎn)生一個特異的條帶，而一點紅蜂糖李均未發(fā)現(xiàn)有上述兩個特異條帶。因此，利用該引物可有效區(qū)分蜂糖李的3個主要品系（圖5）。

3討論

3.1中國李的花粉形態(tài)特征及外壁紋飾差異

本研究中12個供試李種質的花粉均為單?；ǚ?，按照極性、對稱類型以及萌發(fā)器官的特征，他們被劃分為NPC分類系統(tǒng)中的N3P4C5類型。供試李種質花粉的形狀為長球形或超長球形，極面觀呈三裂圓形，赤面觀則呈長橢圓形，外壁紋飾由條紋與穿孔構成。在前人研究中，李屬植物花粉的赤道軸與極軸長度接近，形狀為近球形，例如部分杏品種[13]以及喜馬拉雅臭櫻[14]，但更多的研究表明李花粉通常為長球形或超長球形，如?李[15]、多數(shù)歐洲李[16-17]，這些觀察結果與本研究一致，同時在NPC分類上也與本研究的結果相符。

在親緣關系較近的植物花粉中，花粉外觀的差異更多體現(xiàn)于外壁紋飾上，外壁紋飾對種質鑒定與分類的研究具有重要意義[18]。在獼猴桃屬植物中，花粉外壁紋飾可分為條紋、規(guī)則瘤狀、不規(guī)則瘤狀、小溝狀或穿孔等4種類型，判別花粉外壁紋飾對其分類與分組有著較大價值[19]。同時，在龍膽科[20]、鳳仙花[4]等植物中也發(fā)現(xiàn)了同科、同屬的外壁紋飾上存在差異的現(xiàn)象。在李屬植物中，花粉的外壁紋飾被發(fā)現(xiàn)有條紋-穿孔、腦紋-穿孔、疣狀-穿孔、穿孔但表面較光滑、條紋無穿孔等[15，17]。全球主要的李栽培與商業(yè)品種為歐洲李或中國李，他們在國際上均被劃分在真李組內[21]。本研究供試種質，包括貴州本地李種質、廣東李種質與引進種質，均為二倍體的中國李，在外壁紋飾上的表現(xiàn)均為條紋-穿孔，與前人對福建產(chǎn)李種質?李的發(fā)現(xiàn)一致[15]，這可能說明了原產(chǎn)自南方的李種質之間的親緣關系較為密切，這與魏瀟等[22]的觀點相符。

因此，筆者認為李屬花粉的大小、形狀、極面與赤面觀上的差距較小，李屬植物中不同種間的差異主要集中于外壁紋飾上。在親緣關系較近的同一組間，外壁紋飾的類型差距也相對較小，主要的差異表現(xiàn)在外壁紋飾的孔頻、孔徑、脊寬和脊間距上。在本研究的3個蜂糖李品系中，一點紅蜂糖李的外壁紋飾的孔頻、孔徑與其余品系存在一定的差距，蜂糖李與其他種質間的差異也主要集中于上述特征，孢粉學中的外壁紋飾特征能為鑒別蜂糖李及其品系提供一定的參考信息。

3.2蜂糖李與四月李的孢粉學差異及進化程度

通過對花粉外觀和外壁紋飾數(shù)據(jù)的聚類分析，筆者發(fā)現(xiàn)蜂糖李與三月李、四月李之間存在較大的差距，這暗示他們的親緣關系較遠。在實際生產(chǎn)中，從種苗到果實銷售過程中，四月李常與蜂糖李發(fā)生混淆，但他們無論從管理到果實品質上都存在較大的差異。孢粉學上的較大差異對蜂糖李與四月李的區(qū)分具有一定的參考價值，孢粉學可以作為區(qū)分蜂糖李與四月李的輔助方法。

植物花粉大小的進化趨勢在不同的研究中存在不同的觀點。在一些植物中，如玉蘭亞屬[23]和枇杷[24]，認為花粉由大到小進化。然而，也有研究認為花粉由小型演化為大型[18，25]。在外層紋飾的進化趨勢上，普遍認為植物花粉的復雜性隨著進化程度的增加而增加。外壁紋飾通常呈現(xiàn)從簡單到復雜、從條紋到穿孔、從顆粒與棒刺狀到條紋網(wǎng)狀的演化規(guī)律[26-27]。在前人對中國李的孢粉學研究中，中國李花粉通常表現(xiàn)出較為規(guī)則的條紋結構且穿孔較少，因此認為中國李的進化程度相對較低[28]。在本研究的供試李種質中，多數(shù)為大型花粉，條紋較為規(guī)則，條脊主要呈波浪形或條形，存在少量的分支與交叉。與其他供試種質相比，四月李的花粉條紋較密，孔徑相對較小。四月李在貴州的種植歷史相對較久，屬于較為原始的種質，其花粉外壁紋飾特征在供試種質中進化程度也相對更低。

3.3分子標記與孢粉學結合在種質鑒別中的準確性

花粉作為植物的繁殖器官，其結構主要由基因型決定，受環(huán)境等外部因素的影響較小[12]。然而，由于在不同的研究中對花粉的處理和保存方法存在差異，以及花粉外壁紋飾特點的判定標準不夠一致，存在主觀性，因此不能單純依賴孢粉學來進行種質區(qū)分和鑒別[18]。在實際應用中，應結合基因分析和形態(tài)學等多方面的數(shù)據(jù)進行綜合判定才更為準確。

在DNA分子標記的實際應用中，種質鑒別是最廣泛的應用之一，主要使用共顯性標記，如SSR標記和InDel標記。桃[29]、山杏[30]等物種的研究已表明了SSR標記在構建指紋圖譜或分子身份證方面的重要性。隨著全基因組重測序技術的發(fā)展，InDel標記在果樹的真假雜種鑒定方面具有優(yōu)越性[31]。王玨等[32]對中國櫻桃進行了InDel標記的開發(fā)，并發(fā)現(xiàn)在薔薇科果樹中具有較強的通用性。湯雨晴等[8]利用InDel標記鑒別金蘭柚，利用最少兩對InDel分子標記即可區(qū)分金蘭柚與其他47個柚品種，證明使用引物組鑒別種質具有一定的可靠性。筆者利用重測序數(shù)據(jù)篩選出的InDel分子標記P1-21與P4-46可以區(qū)分蜂糖李與供試的其他21個李種質。在本研究中貴州本地的李種質如打幫李、安順本地晚熟李與蜂糖李在孢粉上差距較小，而他們在標記P1-21與P4-46的鑒定中表現(xiàn)出不同的帶型，能夠直觀、快捷地對他們進行鑒別區(qū)分。

孢粉學結果雖然能夠表達更多的遺傳信息，可作為判斷種質之間親緣關系的一種重要的參考依據(jù)，但作為品種鑒別的方法，具有一定的局限性。在本研究中，一點紅蜂糖李的花粉外壁紋飾與其他品系存在差異，同時標記P3-38能區(qū)分蜂糖李中的黃皮、青皮和一點紅。這對引物能在任何生長階段為這3個品系的鑒別提供參考，彌補了孢粉學上存在的時效性問題。但未來還需進一步對上述引物的準確性進行驗證，對蜂糖李中的品系進行進一步的劃分，并開發(fā)更多的分子標記以及其他鑒別方法，完善蜂糖李的鑒別體系。

4結論

筆者在本研究中揭示了蜂糖李與三月李、四月李在孢粉特征上存在顯著區(qū)別，不同品系蜂糖李孢粉差距集中在外壁紋飾上。筆者還開發(fā)了2對In-Del分子標記，聯(lián)合使用能夠將蜂糖李與其他21份李種質有效區(qū)分，同時還篩選出一對InDel分子標記，可用于區(qū)分蜂糖李中的3個品系。

參考文獻References：

[1]張毅，李用奇，肖祎，吳家麗，程蕾.李新品種‘蜂糖李’的選育及栽培技術[J].中國南方果樹，2018，47（6）：146-148.

ZHANG Yi，LI Yongqi，XIAO Yi，WU Jiali，CHENG Lei.Breeding and cultivation techniques of the new plum variety‘Fengtangli’[J].South China Fruits，2018，47（6）：146-148.

[2]周婷，沈星誠，周道建，范俊俊，趙明明，張往祥，曹福亮.海棠品種分類研究進展[J].園藝學報，2018，45（2）：380-396.

ZHOU Ting，SHEN Xingcheng，ZHOU Daojian，F(xiàn)AN Junjun，ZHAO Mingming，ZHANG Wangxiang，CAO Fuliang.Advanc-es in the classification of crabapple cultivars[J].Acta Horticul-turae Sinica，2018，45（2）：380-396.

[3]黃禮森，李樹玲，傅倉生，李振蘭.中國梨屬植物花粉形態(tài)的比較觀察[J].園藝學報，1993，20（1）：17-22.

HUANG Lisen，LI Shuling，F(xiàn)U Cangsheng，LI Zhenlan.Com-parative observations on morphological characteristics of pollen of Pyrus in China[J].Acta Horticulturae Sinica，1993，20（1）：17-22.

[4]王茜，楊旭東，夏常英，李瑾，于勝祥.鳳仙花組（Impatiens sect.Impatiens）植物花粉形態(tài)研究[J].園藝學報，2020，47（5）：893-906.

WANG Qian，YANG Xudong，XIA Changying，LI Jin，YU Shengxiang.Pollen morphology of Impatiens sect.Impatiens（Balsaminaceae）[J].Acta Horticulturae Sinica，2020，47（5）：893-906.

[5]陳朝文，朱海生，凌永勝，鄭雅超，方桂花，李揚，王智卿，林金秀，鄭凱玲.20個絲瓜品種的花粉形態(tài)特征研究[J].福建農業(yè)學報，2023，38（1）：31-38.

CHEN Chaowen，ZHU Haisheng，LING Yongsheng，ZHENG Yachao，F(xiàn)ANG Guihua，LI Yang，WANG Zhiqing，LIN Jinxiu，ZHENG Kailing.Morphological characteristics of pollens of 20 varieties of luffa[J].Fujian Journal of Agricultural Sciences，2023，38（1）：31-38.

[6]宋海巖，孫淑霞，李靖，涂美艷，王玲利，徐子鴻，陳棟，江國良.基于SSR標記檢測與重測序技術的3個李品種鑒定與遺傳背景簡析[J].中國南方果樹，2023，52（3）：94-101.

SONG Haiyan，SUN Shuxia，LI Jing，TU Meiyan，WANG Ling-li，XU Zihong，CHEN Dong，JIANG Guoliang.Identification and genetic background analysis of three plum varieties based on SSR marker detection and resequencing technology[J].South China Fruits，2023，52（3）：94-101.

[7]左力輝，韓志校，梁海永，楊敏生.不同產(chǎn)地中國李資源遺傳多樣性SSR分析[J].園藝學報，2015，42（1）：111-118.

ZUO Lihui，HAN Zhixiao，LIANG Haiyong，YANG Minsheng.Analysis of genetic diversity of Prunus salicina from different producing areas by SSR markers[J].Acta Horticulturae Sinica，2015，42（1）：111-118.

[8]湯雨晴，楊惠棟，閆承璞，王斯妤，王雨亭，胡鐘東，朱方紅.基于重測序的‘金蘭柚’基因組InDel標記的開發(fā)及應用[J].園藝學報，2023，50（1）：15-26.

TANG Yuqing，YANG Huidong，YAN Chengpu，WANG Siyu，WANG Yuting，HU Zhongdong，ZHU Fanghong.Development and application of Jinlan pummelo（Citrus maxima）InDel mark-ers based on genome re-sequencing[J].Acta Horticulturae Sini-ca，2023，50（1）：15-26.

[9]馬福萌，王明霞，劉童光，張其安，方凌，王本勤，劉雪靜.安徽烏菜DNA提取與InDel引物篩選[J].中國瓜菜，2014，27（2）：36-38.

MA Fumeng，WANG Mingxia，LIU Tongguang，ZHANG Qi’an，F(xiàn)ANG Ling，WANG Benqin，LIU Xuejing.DNA extraction and indel primer screening of Wucai（Brassica campestris L.ssp.chinese（L.）Makino var.rosularis Tsen et Lee）in Anhui[J].China Cucurbits and Vegetables，2014，27（2）：36-38.

[10]姜童，王輝，陳寧，付翔，楊延杰，林多.利用InDel指紋圖譜評價魯西南地區(qū)簇生朝天椒品種的相似度[J].華北農學報，2018，33（2）：126-132.

JIANG Tong，WANG Hui，CHEN Ning，F(xiàn)U Xiang，YANG Yan-jie，LIN Duo.Similarity evaluation of clustered pepper varieties in southwest Shandong Province with InDel fingerprint[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica，2018，33（2）：126-132.

[11]謝志亮，何業(yè)華，彭兵，劉成明，胡中沂，余小玲，方少秋，韓景忠，盧敏.幾種三華李基因組DNA提取方法的比較研究[J].中國南方果樹，2010，39（1）：56-59.

XIE Zhiliang，HE Yehua，PENG Bing，LIU Chengming，HU Zhongyi，YU Xiaoling，F(xiàn)ANG Shaoqiu，HAN Jingzhong，LU Min.Comparison of total DNA extraction methods for‘San-hua’plum[J].South China Fruits，2010，39（1）：56-59.

[12]ERDTMAN G.Handbook of palynology：Morphology，taxono-my，ecology[M].New York：Verlag Munksgaard，1969：1-48.

[13]羅新書，陳學森，郭延奎，苗良，于希志.杏品種孢粉學研究[J].園藝學報，1992，19（4）：319-325.

LUO Xinshu，CHEN Xuesen，GUO Yankui，MIAO Liang，YU Xizhi.Studies on the pollen morphology of apricot varety re-sources[J].Acta Horticulturae Sinica，1992，19（4）：319-325.

[14]SHI W T，WEN J，LUTZ S.Pollen morphology of the Madden-ia clade of Prunus and its taxonomic and phylogenetic implica-tions[J].Journal of Systematics and Evolution，2013，51（2）：164-183.

[15]廖汝玉，任麗花，曾志芳，尹蘭香.?李的孢粉學初步研究[J].熱帶亞熱帶植物學報，2016，24（4）：429-436.

LIAO Ruyu，REN Lihua，ZENG Zhifang，YIN Lanxiang.Paly-nological studies on the Nai plum germplasms[J].Journal of Tropical and Subtropical Botany，2016，24（4）：429-436.

[16]?ALI?D，DEVRNJA N，KOSTI?I，KOSTI?M.Pollen mor-phology，viability，and germination of Prunus domestica cv.Po?ega?a[J].Scientia Horticulturae，2013，155：118-122.

[17]孫琪，廖康，耿文娟，周宏偉，樊丁宇，劉歡，曹倩.基于花粉微觀特征的新疆歐洲李親緣關系分析[J].果樹學報，2015，32（3）：393-403.

SUN Qi，LIAO Kang，GENG Wenjuan，ZHOU Hongwei，F(xiàn)AN Dingyu，LIU Huan，CAO Qian.Phylogenetic relationship analy-sis of European plum in Xinjiang based on pollen microscopic characteristics[J].Journal of Fruit Science，2015，32（3）：393-403.

[18]劉有春，陶承光，劉威生，劉寧，劉碩，章秋平，郁香荷，張玉萍，徐銘，張同喜.花粉形態(tài)在核果類果樹遺傳起源和系統(tǒng)關系研究中的應用[J].園藝學報，2013，40（9）：1701-1709.

LIU Youchun，TAO Chengguang，LIU Weisheng，LIU Ning，LIU Shuo，ZHANG Qiuping，YU Xianghe，ZHANG Yuping，XU Ming，ZHANG Tongxi.Application of pollen morphology in the genetic origin and phylogenic relationship of stone fruit trees[J].Acta Horticulturae Sinica，2013，40（9）：1701-1709.

[19]趙洋，穆雪，李春艷，汪衛(wèi)星.獼猴桃屬（Actinidia Lindl.）植物親緣關系研究進展[J].果樹學報，2019，36（9）：1214-1228.

ZHAO Yang，MU Xue，LI Chunyan，WANG Weixing.Research advances on the genetic relationships of kiwifruit（Actinidia Lindl.）[J].Journal of Fruit Science，2019，36（9）：1214-1228.

[20]李洪池，吳天彧，羅建.西藏色季拉山區(qū)龍膽科30種植物的花粉形態(tài)特征[J].園藝學報，2021，48（12）：2427-2442.

LI Hongchi，WU Tianyu，LUO Jian.Pollen morphological char-acteristics of 30 species of Gentianaceae in Shergyla Mountain Area，Tibet[J].Acta Horticulturae Sinica，2021，48（12）：2427-2442.

[21]劉碩，徐銘，劉家成，章秋平，馬小雪，劉寧，張玉萍，張玉君，趙海娟，劉威生.世界李育種概況[J].中國農業(yè)科學，2023，56（9）：1744-1759.

LIU Shuo，XU Ming，LIU Jiacheng，ZHANG Qiuping，MA Xiaoxue，LIU Ning，ZHANG Yuping，ZHANG Yujun，ZHAO Haijuan，LIU Weisheng.An overview of the worldwide plum breeding[J].Scientia Agricultura Sinica，2023，56（9）：1744-1759.

[22]魏瀟，章秋平，劉威生.中國李種質資源研究進展[J].園藝學報，2020，47（6）：1203-1212.

WEI Xiao，ZHANG Qiuping，LIU Weisheng.Research progress on plum germplasm resources in China[J].Acta Horticulturae Si-nica，2020，47（6）：1203-1212.

[23]王嘯博，曹潁，郭偉，馬琳，劉秀麗.玉蘭亞屬44種（品種）的花粉形態(tài)特征研究[J].園藝學報，2023，50（11）：2417-2434.

WANG Xiaobo，CAO Ying，GUO Wei，MALin，LIU Xiuli.Mor-phological characteristics of pollen from 44 species of subgen.Yulania[J].Acta Horticulturae Sinica，2023，50（11）：2417-2434.

[24]楊向暉，吳穎欣，林順權.6種枇杷屬植物花粉形態(tài)掃描電鏡觀察[J].果樹學報，2009，26（4）：572-576.

YANG Xianghui，WU Yingxin，LIN Shunquan.SEM observa-tion on the pollen morphology of six Eriobotrya plants[J].Jour-nal of Fruit Science，2009，26（4）：572-576.

[25]劉偉，李桂祥，董曉民，李勃，韓真，張安寧.肥城桃花粉粒形態(tài)觀察[J].果樹學報，2018，35（1）：38-45.

LIU Wei，LI Guixiang，DONG Xiaomin，LI Bo，HAN Zhen，ZHANG Anning.Observation on pollen grains of Feicheng peaches[J].Journal of Fruit Science，2018，35（1）：38-45.

[26]NOROOZI M，GHAHREMANINEJAD F，BOGLER D，WITH-ERSPOON J M，RYAN G L，MILLER J S，RIAHI M，COHEN J I.Parsing a plethora of pollen：the role of pollen size and shape in the evolution of Boraginaceae[J].Cladistics，2022，38（2）：204-226.

[27]WALKER J W.Evolution of exine structure in the pollen of primitive angiosperms[J].American Journal of Botany，1974，61（8）：891.

[28]劉有春，劉威生，郁香荷，孫猛，劉寧，章秋平，張玉萍，徐銘，劉碩.歐洲李（Prunus domestica）及其近緣種的孢粉學研究[J].果樹學報，2010，27（4）：526-532.

LIU Youchun，LIU Weisheng，YU Xianghe，SUN Meng，LIU Ning，ZHANG Qiuping，ZHANG Yuping，XU Ming，LIU Shuo.Palynological study on Prunus domestica and its related species[J].Journal of Fruit Science，2010，27（4）：526-532.

[29]王淋，敖敦，包文泉，張淑寧，陳俊興，李鳳鳴，孟繁慶，楊鈺瑩，白玉娥.基于SSR分子標記的桃品種鑒別及指紋圖譜構建[J].中南林業(yè)科技大學學報，2021，41（6）：131-138.

WANG Lin，AO Dun，BAO Wenquan，ZHANG Shuning，CHEN Junxing，LI Fengming，MENG Fanqing，YANG Yuying，BAI Yu’e.Research on the identification of main peach variet-ies and construction of fingerprint based on SSR markers[J].Journal of Central South University of Forestryamp;Technology，2021，41（6）：131-138.

[30]金玲，劉明國，董勝君，吳月亮，張欣.97個山杏無性系的遺傳多樣性及SSR指紋圖譜[J].林業(yè)科學，2018，54（7）：51-61.

JIN Ling，LIU Mingguo，DONG Shengjun，WU Yueliang，ZHANG Xin.Genetic diversity and fingerprints of 97 Armenia-ca sibirica clones based on SSR markers[J].Scientia Silvae Sini-cae，2018，54（7）：51-61.

[31]孫世航，林苗苗，齊秀娟，孫雷明，鐘云鵬，方金豹.應用InDel標記進行軟棗獼猴桃雜交子代真實性鑒定[J].果樹學報，2018，35（1）：32-37.

SUN Shihang，LIN Miaomiao，QI Xiujuan，SUN Leiming，ZHONG Yunpeng，F(xiàn)ANG Jinbao.Application of InDel markers on progeny identification in Actinidia arguta[J].Journal of Fruit Science，2018，35（1）：32-37.

[32]王玨，王燕，張靜，陳濤，王磊，陳清，湯浩茹，王小蓉.中國櫻桃InDel標記開發(fā)及其在薔薇科果樹中通用性評價[J].園藝學報，2020，47（1）：98-110.

WANG Jue，WANG Yan，ZHANG Jing，CHEN Tao，WANG Lei，CHEN Qing，TANG Haoru，WANG Xiaorong.Develop-ment of insertion-deletion（InDel）markers based on whole-ge-nome sequencing data in Chinese cherry and their transferability in Rosaceae fruit trees[J].Acta Horticulturae Sinica，2020，47（1）：98-110.