基于數(shù)據(jù)挖掘分析KEAP1基因在肺癌中的表達(dá)及意義

摘要：目的" 利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)人胞質(zhì)接頭蛋白（KEAP1）進(jìn)行分析，并匯總其在肺癌中的表達(dá)情況及意義，為后續(xù)肺癌相關(guān)治療和預(yù)后提供有力的依據(jù)。方法" 利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘KEAP1基因表達(dá)及染色體定位，利用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)分析肺癌中KEAP1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，通過(guò)Linkedomics數(shù)據(jù)庫(kù)和String數(shù)據(jù)庫(kù)獲取該基因在不同組織和疾病中的表達(dá)數(shù)據(jù)和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，分析KEAP1與其他蛋白之間的關(guān)系，探索與其他基因的關(guān)聯(lián)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEAP1表達(dá)分析，比較KEAP1在正常肺組織和肺癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果" KEPA1基因位于19號(hào)染色體上；該基因表達(dá)量與肺癌患者的預(yù)后生存分析有相關(guān)性（P＜0.05）；基因共分析顯示，在肺癌中PTGER4、CD36、KRAS等基因與KEAP1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；KEAP1在肺癌中主要通過(guò)KEAP1-NFE2L2 通路發(fā)揮作用；與正常肺組織相比，KEAP1基因突變后在肺癌組織中表達(dá)異常下降（P＜0.05）。結(jié)論" KEAP1突變與肺癌患者更短的生存期相關(guān)，該基因的降低與肺癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。在肺癌的驅(qū)動(dòng)基因中，KEAP1在肺癌患者中屬于突變風(fēng)險(xiǎn)較高的基因，有望成為肺癌預(yù)后評(píng)估和治療的有效靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：肺癌；KEAP1基因；生物信息學(xué)；預(yù)后；生存期

中圖分類號(hào)：R734.2" " " " " " " " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A" " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.18.003

文章編號(hào)：1006-1959（2024）18-0012-07

Abstract：Objective" To analyze the expression and significance of human cytoplasmic adaptor protein 1 （KEAP1） in lung cancer by bioinformatics technology， and to provide a strong basis for the follow-up treatment and prognosis of lung cancer.Methods" GEO database was used to mine the expression and chromosomal localization of KEAP1 gene. Kaplan-Meier database was used to analyze the relationship between KEAP1 expression and prognosis of patients with lung cancer. Linkedomics database and String database were used to obtain the expression data and protein interaction network of KEAP1 gene in different tissues and diseases， the relationship between KEAP1 and other proteins was analyzed， and the association and regulatory network with other genes was explored. The expression of KEAP1 was analyzed by GEPIA2 database to compare the expression of KEAP1 in normal lung tissues and lung cancer tissues.Results" KEPA1 gene was located on chromosome 19， and the expression of this gene was correlated with the prognosis and survival analysis of patients with lung cancer （Plt;0.05）. Gene co-analysis showed that PTGER4， CD36， KRAS and other genes were negatively correlated with KEAP1 gene expression in lung cancer （Plt;0.05）. KEAP1 played a role in lung cancer mainly through the KEAP1-NFE2L2 pathway; compared with normal lung tissues， the expression of KEAP1 in lung cancer tissues decreased significantly after gene mutation （Plt;0.05）.Conclusion" KEAP1 mutation is associated with shorter survival time in patients with lung cancer， and the decrease of this gene is related to the occurrence and progression of lung cancer. Among the driving genes of lung cancer， KEAP1 is a gene with a high risk of mutation in patients with lung cancer， which is expected to become an effective target for prognosis evaluation and treatment of lung cancer.

Key words：Lung cancer;KEAP1 gene;Bioinformatics;Prognosis;Survival period

肺癌（lung cancer）是美國(guó)癌癥相關(guān)死亡的主要原因，平均5年生存率為15%。吸煙仍然是肺癌的主要危險(xiǎn)因素。肺癌分為小細(xì)胞癌及非小細(xì)胞癌（如腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌）[1]。盡管目前很容易識(shí)別出有患肺癌風(fēng)險(xiǎn)的人群，但現(xiàn)有的證據(jù)并不支持對(duì)肺癌進(jìn)行大規(guī)模篩查。對(duì)于早期診斷肺癌的患者，通過(guò)手術(shù)切除和術(shù)后化療可能治愈，切除的程度取決于腫瘤的大小、位置以及患者的術(shù)前肺儲(chǔ)備[2]。然而，在絕大多數(shù)肺癌患者中，被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期階段，可用的治療策略有限。因此尋找有效的分子靶標(biāo)對(duì)肺癌的治療和預(yù)后具有重要的臨床意義[3]。KEAP1 是一種高度保守的富含半胱氨酸的624個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在哺乳動(dòng)物中具有大約92%的序列同源性。KEAP1屬于BTB-Kelch家族蛋白，該家族的所有成員都能夠通過(guò)其BTB結(jié)構(gòu)域與CUL3結(jié)合[4]。Nrf2轉(zhuǎn)錄因子控制著參與細(xì)胞防御氧化應(yīng)激的數(shù)百個(gè)基因的表達(dá)。Nrf2活性調(diào)節(jié)的主要途徑是通過(guò)與KEAP1蛋白的相互作用。在常氧下，KEAP1結(jié)合Nrf2并將其靶向蛋白酶體降解，而KEAP1再生。在氧化應(yīng)激下，Nrf2和KEAP1之間的相互作用被中斷，Nrf2激活保護(hù)基因的轉(zhuǎn)錄。目前，Nrf2系統(tǒng)激活被認(rèn)為是治療不同病理的強(qiáng)大細(xì)胞保護(hù)策略[5]。KEAP1-Nrf2系統(tǒng)就像一把雙刃劍：Nrf2 活性保護(hù)細(xì)胞并使細(xì)胞抵抗氧化和親電應(yīng)激，而升高的 Nrf2 活性有助于癌細(xì)胞的存活和增殖。KEAP1基因的缺失或突變會(huì)導(dǎo)致Nrf2蛋白的過(guò)度激活，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移和抵抗化療藥物[6]。為此，本研究通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)、Kaplan-Meier等數(shù)據(jù)庫(kù)分析KEAP1基因在肺癌中的表達(dá)和預(yù)后關(guān)系，旨在為后續(xù)研究提供參考。

1資料與方法

1.1數(shù)據(jù)來(lái)源" 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）輸入關(guān)鍵詞“KEAP1”，數(shù)據(jù)集篩選：選擇與肺癌相關(guān)的數(shù)據(jù)集。

1.2生存分析" 在Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫(kù)（http：kmplot.com/）的mRNA gene chip一欄中選擇“Start KM plotter”，Gene Symbol選擇“KEAP1”，Split patients by“Auto”，篩選性能最佳的閾值作為截止值。Survival選擇“OS or PPS”。分析KEAP1基因表達(dá)與肺癌患者生存率之間的關(guān)系。

1.3相關(guān)性分析" 在Linkedomics數(shù)據(jù)庫(kù)（http：www.linkedomics.org/）選擇癌癥類型“TCGA_LUAD”，選擇研究數(shù)據(jù)“TCGA LUAD HiSeq RNA”，輸入基因“KEAP1”，選擇數(shù)據(jù)集“TCGA LUADHiSeq RNA ”，確定統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 “Pearson Correlation test”。

1.4 KEAP1相互作用蛋白分析" 在String-db數(shù)據(jù)庫(kù)（http： string-db.org）中，Protein Name輸入“KEAP1”基因，Organisms選擇“Homo sapiens”，獲取KEAP1的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5組織表達(dá)差異分析" 在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）以“KEAP1”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，選擇與LUAD相關(guān)的數(shù)據(jù)集，基因表達(dá)分析點(diǎn)擊“Expression”標(biāo)簽，選擇腫瘤類型為“LUAD”，觀察KEAP1在LUAD腫瘤與正常組織中的表達(dá)水平。

1.6免疫組化表達(dá)情況" 在The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.proteinatlas.org/）中，關(guān)鍵詞輸入“KEAP1”，選擇肺組織數(shù)據(jù)集：點(diǎn)擊“Tissue specificity”，選擇“Respiratory system”，再選擇“Lung”，查看KEAP1在正常肺組織和肺癌組織中的免疫組化圖像。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" 采用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，配對(duì)樣本比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析KEAP1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)比較組間生存率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著。

2結(jié)果

2.1 KEAP1基因結(jié)構(gòu)及數(shù)據(jù)集表達(dá)情況" KEAP1基因是人類基因組中的一種重要基因，位于染色體19p13.2位點(diǎn)。KEAP1蛋白質(zhì)屬于Cullin3-RBX1 E3泛素連接酶復(fù)合物的組分之一，并與核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）相互作用。該復(fù)合物在細(xì)胞中通過(guò)對(duì)Nrf2的調(diào)控，參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)和抗氧化防御系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[7]，見(jiàn)圖1。

2.2 KEAP1表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系" Kaplan-Meier分析顯示，KEAP1 mRNA表達(dá)量與肺癌患者的OS和PPS均有相關(guān)性（OS：Log-rank P=0.044；PPS：Log-rank P=0.023），見(jiàn)圖2。

2.3 KEAP1相關(guān)基因的Linkedomics分析" 基因共表達(dá)分析顯示，與KEPA1呈正相關(guān)的基因和與KEPA1呈負(fù)相關(guān)的基因大概有50多種，見(jiàn)圖3。

2.4 KEAP1在肺癌組織String數(shù)據(jù)分析" KEAP1與SQSTM1、CUL3、NEIL2、NFE2L2、IKBKB、RBX1等基因關(guān)系密切，見(jiàn)圖4。根據(jù)通路分析發(fā)現(xiàn)，KEAP1在肺癌中主要通過(guò)KEAP1-NFE2L2 通路發(fā)揮作用。

2.5 KEAP1在肺癌組織中的GEPIA2分析結(jié)果" KEAP1基因在大多數(shù)腫瘤組織中均呈高表達(dá)，但在胰腺癌（PAAD）、胸腺瘤（THYM）、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBC）及腦低級(jí)膠質(zhì)瘤（LGG）中KEAP1表達(dá)水平比其相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)水平顯著增高，見(jiàn)圖5、圖6。為明確KEAP1基因表達(dá)與肺癌患者病理分期是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在GEPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)輸入KEAP1基因并進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，結(jié)果顯示：KEAP1mRNA在不同病理分期肺癌患者中的表達(dá)存差異（F=0.592，P=0.62），見(jiàn)圖7A?；贕EPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘與KEAP1相關(guān)基因分析結(jié)果顯示，肺癌組織KEAP1的mRNA表達(dá)水平與基因PTGER4、CD36、KRASmRNA 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)圖7B～圖7D。通過(guò)GEPIA2分析KEAP1肺癌數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集中包括例肺癌組織樣本和例正常肺組織樣本。結(jié)果顯示，與正常肺組織相比，KEAP1基因突變后在肺癌組織中表達(dá)異常，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖7E。

2.6 KEAP1在正常肺臟與肺癌的免疫組化" 在The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到KEAP1蛋白在1例正常肺組織和12例肺癌組織中的表達(dá)情況，其中2例肺癌組織蛋白表達(dá)及抗體染色程度為“高度”水平，4例為“中度”水平，5例為“低度”水平，1例未檢測(cè)到染色結(jié)果，見(jiàn)圖8。

3討論

在全球范圍內(nèi)，肺癌在過(guò)去幾十年中一直是最常見(jiàn)的癌癥，是北美和其他發(fā)達(dá)國(guó)家癌癥相關(guān)死亡的主要原因[8]。肺癌通常直到晚期才被診斷出來(lái)，其死亡率較高。因而，肺癌的早期診斷至關(guān)重要，特別是在篩查高危人群時(shí)，如吸煙者、暴露于煙霧、油田、有毒職業(yè)場(chǎng)所時(shí)，需要確定用于早期診斷的敏感和特異性分子標(biāo)志物[9]。2004年，肺癌遺傳流行病學(xué)聯(lián)盟首次發(fā)現(xiàn)6q23-25區(qū)域存在影響肺癌風(fēng)險(xiǎn)的主要易感位點(diǎn)[10]。隨著全基因組學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在有可能更全面地探索人類基因組，以了解遺傳單核苷酸多態(tài)性（snp）與人類疾病之間的關(guān)聯(lián)。有研究已經(jīng)成功地確定了與肺癌易感性顯著相關(guān)的遺傳因素，相關(guān)證據(jù)的強(qiáng)度各不相同，一些基因座已被細(xì)化為特定的亞組，包括性別、種族、吸煙狀況和組織學(xué)亞型[11]。

KEAP1/Nrf2通路被認(rèn)為是氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在生理環(huán)境下保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和外源物的影響。癌細(xì)胞在起始和進(jìn)展過(guò)程中經(jīng)常經(jīng)歷這一途徑，異常的KEAP1-Nrf2活性主要在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中被發(fā)現(xiàn)，這表明細(xì)胞/起源組織可能會(huì)影響惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的遺傳選擇[12]。KEAP1在約16%的NSCLC中發(fā)生突變，包括12%的肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSCs）和20%的肺腺癌（LUADs）[13]。KEAP1突變的肺癌患者總生存期較短，預(yù)后較差[14-16]。有研究報(bào)告了Nrf2介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄在預(yù)防癌癥方面的潛在作用是由涉及異生物質(zhì)和氧化應(yīng)激的機(jī)制引起的。這表明 KEAP1-Nrf2系統(tǒng)是通過(guò)Nrf2激活的調(diào)節(jié)劑（抑制劑/激活劑）來(lái)對(duì)抗癌癥的潛在治療靶點(diǎn)[6]。

KEAP1基因是人類基因組中的一種重要基因，位于染色體19p13.2位置[17]。本研究顯示，KEAP1 mRNA表達(dá)量與肺癌患者的OS和PPS均有相關(guān)性，與KEAP1mRNA低表達(dá)組相比，KEAP1 mRNA高表達(dá)組肺癌患者總體生存時(shí)間和進(jìn)展生存時(shí)間縮短。通過(guò)Linkedomics數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)KEAP1基因進(jìn)行分析，確定KEAP1基因在反應(yīng)性氧化物種的清除過(guò)程中扮演著重要角色，揭示了與KEAP1相互作用的蛋白質(zhì)，此外，還確定了KEAP1與其他信號(hào)通路蛋白的關(guān)聯(lián)，如Nrf2、PI3K/AKT等。KEAP1是調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵基因，它通過(guò)調(diào)控Nrf2的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)[18]。根據(jù)GEPIA2的分析結(jié)果，可以看到KEAP1基因在正常組織和肺癌組織中的表達(dá)差異。在某些肺癌類型中，KEAP1基因的表達(dá)水平下降；同時(shí)，一些突變體和功能失活的KEAP1也被發(fā)現(xiàn)[19]?；贕EPIA2數(shù)據(jù)庫(kù)基因相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在肺癌中過(guò)表達(dá)的PTGER4[20]、CD36[21]、KRAS[22]等基因與KEAP1基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這意味著KEAP1基因的降低與肺癌的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)。需要注意的是，GEPIA2的分析結(jié)果雖然提供了有關(guān)KEAP1在肺癌組織中的表達(dá)變化的信息，但仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和研究來(lái)確定其確切的功能和調(diào)控機(jī)制。因此，這些結(jié)果僅作為初步的參考，需要與其他研究結(jié)果相結(jié)合來(lái)全面理解KEAP1在肺癌中的作用。利用THPA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEAP1免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)KEAP1在正常生理狀態(tài)和疾病中的表達(dá)模式和定位信息存在差異。

綜上所述，KEAP1突變與肺癌患者更短的生存期相關(guān)，該基因的降低與肺癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。在肺癌的驅(qū)動(dòng)基因中，KEAP1在肺癌患者中屬于突變風(fēng)險(xiǎn)較高的基因，有望成為肺癌預(yù)后評(píng)估和治療的有效靶點(diǎn)。

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收稿日期：2023-09-26；修回日期：2023-10-09

編輯/成森

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81760236）

作者簡(jiǎn)介：張馨文（1999.7-），女，山西侯馬人，碩士研究生，主要從事糖尿病神經(jīng)科學(xué)研究

通訊作者：趙貝（1983.1-），男，山東棗莊人，博士，副教授，主要從事糖尿病神經(jīng)科學(xué)研究