中風(fēng)停顆粒對急性腦梗死大鼠NLRP3炎癥小體及MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子A、表皮生長因子表達(dá)的影響

摘要" 目的：探討中風(fēng)停顆粒對急性腦梗死（ACI）大鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）及表皮生長因子（EGF）表達(dá)的影響。方法：將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組和中藥組，每組20只，中藥組每只大鼠每次給予中風(fēng)停顆粒0.51 mL/100 g，每日灌胃2次；空白對照組、模型組每只大鼠每次給予生理鹽水0.51 mL/100 g，每日灌胃2次。連續(xù)干預(yù)7 d取材。以大腦中動脈線栓法建立大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠模型，采用Zea-longa 5分法評估大鼠神經(jīng)功能，蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠腦組織NLRP3表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測血漿MMP-9、VEGF-A、EGF表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，中藥組大鼠神經(jīng)功能評分降低（P＜0.05）；與空白對照組比較，模型組、中藥組大鼠腦組織NLRP3表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05），血漿MMP-9、VEGF-A水平升高（P＜0.01），EGF水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，中風(fēng)停顆粒組大鼠腦組織NLRP3表達(dá)水平降低（P＜0.05），血漿VEGF-A、EGF水平升高（P＜0.01），MMP-9水平降低（P＜0.01）。結(jié)論：中風(fēng)停顆?？梢种艫CI大鼠NLRP3炎癥小體表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)，改善MMP-9、VEGF-A、EGF表達(dá)。

關(guān)鍵詞" 急性腦梗死；中風(fēng)停顆粒；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族蛋白3； 基質(zhì)金屬蛋白酶9；血管內(nèi)皮生長因子A；表皮生長因子；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.23.011

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）嚴(yán)重危害人類的健康，具有較高的發(fā)病率、致死率、致殘率和復(fù)發(fā)率［1］。中國腦卒中疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，2020年我國腦梗死的患病率為2.6%，年發(fā)病率為505.2/10萬，年死亡率為343.4/10萬，其中缺血性腦卒中占所有腦卒中的86.8%［2］。研究表明，炎癥反應(yīng)與ACI發(fā)生密切相關(guān)，隨著溶栓、動脈取栓等血管再通技術(shù)不斷發(fā)展，腦卒中后再灌注治療成為ACI重要的治療措施，繼發(fā)的血管再灌注損傷也伴隨著更劇烈的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)影響神經(jīng)功能缺損的發(fā)生發(fā)展，抑制炎癥反應(yīng)能夠促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［3-4］。故而減輕炎癥反應(yīng)，抑制炎性因子表達(dá)有望成為治療ACI、改善神經(jīng)功能缺損的重要靶點(diǎn)。ACI屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，風(fēng)痰、瘀血痹阻脈絡(luò)為中風(fēng)病急性期核心病機(jī)，內(nèi)風(fēng)、火熱、痰濕、瘀血為最常見證候要素［5］。中風(fēng)停顆粒具有息風(fēng)清火、活血化痰之功效，能夠提高ACI屬風(fēng)火痰瘀證病人的臨床療效，改善病人神經(jīng)功能，降低炎性因子［6-7］。本研究通過大腦中動脈線栓法建立ACI大鼠模型，以探討中風(fēng)停顆粒對ACI大鼠核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族蛋白3（NLRP3）炎癥小體及基質(zhì)金屬蛋白酶9

基金項(xiàng)目" 第五批全國中醫(yī)臨床優(yōu)秀人才研修項(xiàng)目，編號：國中醫(yī)藥人教函〔2022〕1號；山東省中醫(yī)藥科技項(xiàng)目（No.M-2023066）

作者單位" 1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院（北京 100020）；2.淄博市中醫(yī)醫(yī)院（山東淄博 255399）；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)；4.山東省臨沂市中醫(yī)醫(yī)院

通訊作者" 朱文浩，E-mail：doctorzwh@163.com

引用信息" 董珍宇，朱文浩，黃英俊，等.中風(fēng)停顆粒對急性腦梗死大鼠NLRP3炎癥小體及MMP-9、血管內(nèi)皮生長因子A、表皮生長因子表達(dá)的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2022，22（23）：4301-4304.

（MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）及表皮生長因子（EGF）表達(dá)的影響，探討中風(fēng)停顆粒治療ACI的作用機(jī)制。

1" 材料與方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動物

無特定病原體動物（SPF）級雄性SD大鼠共60只，6～8周齡，體質(zhì)量240～260 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物房。實(shí)驗(yàn)前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度（20±2）℃，相對濕度45%～70%，維持明暗每次各12 h交替循環(huán)，自由飲水及進(jìn)食。本研究獲得淄博市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2023-倫審-004）。

1.2" 實(shí)驗(yàn)藥物

中風(fēng)停顆粒（由天麻10 g，鉤藤15 g，生牡蠣30 g，生龍骨30 g，生石決明30 g，丹參10 g，牡丹皮10 g，川芎10 g，赤芍10 g，紅花10 g，膽南星10 g，白附子6 g，石菖蒲10 g，黃芩10 g，梔子10 g，蜈蚣2 g，全蝎3 g等17味中藥組成），由淄博市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的配方顆粒。用300mL開水將配方顆粒1劑溶解，將藥液混勻后紗布過濾，濃縮成相當(dāng)于每毫升2.2 g生藥，滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3" 試劑及儀器

Anti-NLRP3抗體（Abcam，批號：Ab263899）；大鼠MMP-9、VEGF-A、EGF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒均購自武漢基因美生物科技有限公司（批號：GR20220110）；Goat Anti-Rabbit IgG（H＋L）辣根過氧化物酶（HRP）（Sparkjade，EF0002）；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒（Sparkjade，EC0003）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（Sparkjade，EC0001）。VELOCITY 18R高速冷凍離心機(jī)（Dynamica公司）；Tanon5200 Multi全自動化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY92-IIN（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3K15型4 ℃低溫離心機(jī)（美國sigma公司），AMR-100型酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司），MVS-1型旋渦混合器（北京金北德工貿(mào)有限公司），UB1001型隔水式培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.4" 分組及造模

將60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白對照組、模型組、中藥組，每組20只。模型組、中藥組動物采用大腦中動脈線栓法制備大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，參照Longa改良線栓法［8］。大鼠腹腔注射5%水合氯醛（0.7 mL/100 g）麻醉。大鼠仰臥于手術(shù)臺上，經(jīng)頸正中切口顯露右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）。頭端直徑為（0.36±0.02）mm的尼龍線從右側(cè)CCA進(jìn)入右側(cè)ICA，直到超出ICA分叉18 mm。結(jié)扎血管，切斷多余的尼龍線?？p合切口后，局部輸注0.2 mL的0.25%布比卡因以減輕術(shù)后疼痛。在整個手術(shù)過程中，使用加熱墊檢測并維持大鼠肛門溫度（37.0±0.5）℃。術(shù)后3 h采用5級4分法標(biāo)準(zhǔn)［8］進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分，分值≥1分判定為造模成功。插線操作超過15 min、術(shù)中出血多、麻醉過深呼吸不規(guī)律、術(shù)后3 h仍不能蘇醒的動物不列入統(tǒng)計(jì)范圍。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中補(bǔ)充剔除出組的動物，保證每組動物數(shù)。

1.5" 給藥方法

造模后當(dāng)天給藥。大鼠灌胃的中風(fēng)停顆粒中藥劑量根據(jù)成人每日服用215 g生藥，參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［9］中人和動物間體表面積折算系數(shù)換算，即大鼠等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍，估算大鼠每天的臨床劑量為22.68 g/kg。中藥組每只大鼠每次給予中風(fēng)停顆粒0.51 mL/100 g，每日灌胃2次；空白對照組、模型組每只大鼠每次給予生理鹽水0.51 mL/100 g，每日灌胃2次。連續(xù)干預(yù)7 d。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)已證明本研究中藥劑量因素對藥效的影響無明顯差異，故此實(shí)驗(yàn)中只選用臨床常規(guī)中藥劑量。

1.6" 神經(jīng)功能評分

采用Zea Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)神經(jīng)功能缺損程度。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損（右前爪不能完全伸展）；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損（向右側(cè)轉(zhuǎn)圈）；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損（向右側(cè)傾倒）；4分：不能自主行走，意識水平下降［8］。

1.7" 標(biāo)本采集與檢測

1.7.1" 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測NLRP3表達(dá)

取病灶側(cè)腦組織，加入RIPA裂解液，低溫條件下勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心10 min，提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后將電泳產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，一抗NLRP3 1∶2 000稀釋；孵育，二抗［Goat Anti-RabbitIgG（H＋L）HRP］1∶5 000稀釋孵育，將膜置于發(fā)光板上，用濾紙吸去膜上的多余的TBST，加入適量的發(fā)光液，完全覆蓋住聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用化學(xué)發(fā)光成像儀曝光顯影。用NIH Image J 1.41計(jì)算灰度值，與內(nèi)參（β-actin）做比值后分析。

1.7.2" ELISA法檢測MMP-9、VEGF-A、EGF表達(dá)

大鼠麻醉后抽取靜脈血，置于抗凝管中，3 000 r/min離心20 min，取血漿上清液。按照ELISA分析試劑盒步驟，酶標(biāo)儀測定細(xì)胞上清液MMP-9、VEGF-A、EGF含量。

1.8" 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩個樣本均數(shù)的比較采用t或t′檢驗(yàn)，多個樣本均數(shù)的比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 各組一般情況及神經(jīng)功能評分比較

造模后，空白對照組大鼠進(jìn)食正常，體質(zhì)量逐漸增加，未出現(xiàn)大小便失禁情況。模型組、中藥組存在進(jìn)食減少，體質(zhì)量下降，每組各有1只存在大小便失禁情況?？瞻讓φ战M無神經(jīng)功能缺損癥狀。第1天，模型組神經(jīng)功能評分與中藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第7天，模型組、中藥組神經(jīng)功能評分均低于第1天，中藥組神經(jīng)功能評分低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2" 3組血漿MMP-9、VEGF-A、EGF水平比較

與空白對照組比較，模型組、中藥組血漿MMP-9、VEGF-A水平均升高（P＜0.01），EGF水平降低（P＜0.01）。與模型組比較，中藥組血漿VEGF-A、EGF水平均升高（P＜0.01），MMP-9水平降低（P＜0.01）。詳見表2。

2.3" 3組大鼠腦組織NLRP3水平比較

模型組、中藥組腦組織NLRP3表達(dá)水平均高于空白對照組（P＜0.05）；中藥組腦組織NLRP3表達(dá)水平低于模型組（P＜0.05）。詳見表3、圖1。

3" 討" 論

ACI發(fā)生后，腦組織缺血缺氧，引起一系列細(xì)胞死亡事件如興奮性毒性、氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥［10］，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，血腦屏障通透性增加，腦細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損。近年來，中藥復(fù)方治療ACI的報(bào)道逐漸增多，研究表明中藥復(fù)方能降低炎性因子水平、改善氧化應(yīng)激指標(biāo)、緩解神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，保護(hù)缺血損傷的腦組織［11-14］。隨著研究不斷深入，炎癥反應(yīng)在ACI病程進(jìn)展中的作用被日益重視。最新研究顯示，NLRP3炎癥小體在ACI后炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，能誘導(dǎo)ACI后神經(jīng)炎癥，抑制其表達(dá)能促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［15-16］。課題組前期研究已證實(shí)，中風(fēng)停顆粒能降低ACI病人血漿炎性因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、白細(xì)胞介素17A（IL-17A）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等水平，改善病人的神經(jīng)功能［6，17］。本研究在前期臨床研究基礎(chǔ)上，探討中風(fēng)停顆粒對ACI大鼠NLRP3炎癥小體及MMP-9、EGF、VEGF-A表達(dá)的影響，以期深入探討中風(fēng)停顆粒的作用機(jī)制。

本研究采用大腦中動脈線栓法建立MCAO大鼠模型，是目前常用的模擬腦缺血損傷模型，被廣泛應(yīng)用于缺血性腦卒中的研究，該模型能夠模擬人腦缺血損傷后的病理機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠的神經(jīng)功能缺損評分、腦組織NLRP3表達(dá)水平顯著升高，血漿MMP-9、VEGF-A水平升高，EGF水平降低，表明MCAO模型大鼠存在明顯的炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞受損、血腦屏障破壞及神經(jīng)功能損傷，提示模型構(gòu)建成功。

炎癥反應(yīng)在腦缺血早期對神經(jīng)功能的損傷被臨床逐漸重視，NLRP3炎癥小體是最具特征的炎性小體，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［9］。腦組織缺血缺氧時，細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）含量下降，NLRP3被激活而啟動炎癥反應(yīng)，釋放大量促炎細(xì)胞因子，如IL-1β和白細(xì)胞介素8（IL-18），促炎細(xì)胞因子使血腦屏障通透性增加，并透過血腦屏障加重神經(jīng)炎癥，使梗死體積擴(kuò)大和腦水腫形成，從而使神經(jīng)功能損傷程度加重［18］。抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)和活性成為目前ACI的重要治療靶點(diǎn)［15］。中藥復(fù)方和西藥均證實(shí)通過調(diào)控NLRP3炎癥小體，抑制炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)?！豆沤皲涷?yàn)》續(xù)命湯［19］通過抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）/NLRP3途徑，可抑制缺血性中風(fēng)細(xì)胞焦亡，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，脈絡(luò)舒通丸［20］可通過調(diào)控Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）/NLRP3信號通路，抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)小鼠腦缺血再灌注損傷，依達(dá)拉奉右冰片醇［21］可通過抑制NLRP3炎癥小體和NF-κB信號激活，以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞焦亡，而起到神經(jīng)保護(hù)作用。內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障重要的細(xì)胞組成，MMP-9是細(xì)胞外基質(zhì)重要的調(diào)節(jié)蛋白酶，主要在缺血腦組織的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，MMP-9激活是血腦屏障損傷的直接原因［22-23］。VEGF-A在腦缺血修復(fù)過程的血管生成中起重要作用，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，促進(jìn)新血管形成，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［24］。研究表明，通過激活HIF-1α/血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）信號通路，可促進(jìn)血管生成，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)，減輕腦缺血損傷［25-26］。也有研究認(rèn)為，VEGF-A在腦缺血早期過表達(dá)可誘導(dǎo)血管通透性增強(qiáng)，破壞血腦屏障，產(chǎn)生負(fù)面影響，加重腦損傷［27］，但目前研究總體認(rèn)為，負(fù)面損傷是暫時的，VEGF有明顯的臨床意義。EGF是一種促神經(jīng)生長因子，能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞生長、增殖、分化和再生，促進(jìn)腦組織再生和神經(jīng)元修復(fù)［28］。研究證實(shí)，腦缺血時EGF可刺激MMP-9的表達(dá)，損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞［29］，上調(diào)EGF的表達(dá)水平，可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，發(fā)揮腦保護(hù)作用［30］，給MCAO大鼠腦室內(nèi)注入外源性EGF后，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的可塑性更強(qiáng)［28］。

本研究結(jié)果顯示，模型組、中藥組大鼠腦組織NLRP3表達(dá)顯著升高，中風(fēng)停顆粒治療后NLRP3表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示炎癥反應(yīng)是ACI病理過程的重要表現(xiàn)，中風(fēng)停顆粒能抑制NLRP3水平的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)。模型組、中藥組大鼠血漿MMP-9、VEGF-A水平升高，EGF水平降低，中風(fēng)停顆粒治療后血漿MMP-9水平降低，VEGF-A、EGF水平升高，提示ACI發(fā)生后腦血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、血管屏障完整性破壞，中風(fēng)停顆粒能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖，修復(fù)血腦屏障，促進(jìn)神經(jīng)元再生，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究予中風(fēng)停顆粒治療后ACI大鼠腦組織中NLRP3的表達(dá)水平降低，血漿MMP-9表達(dá)水平下降，VEGF-A、EGF水平表達(dá)升高，神經(jīng)功能損傷和神經(jīng)炎癥明顯減輕，提示中風(fēng)停顆粒可能通過抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，促進(jìn)血腦屏障修復(fù)，進(jìn)而改善ACI大鼠神經(jīng)損傷。

本研究不足之處在于對NLRP3炎癥小體與焦亡之間的信號通路，以及焦亡下游的效應(yīng)機(jī)制尚未明確，將在后續(xù)研究中進(jìn)行深入探索。

綜上所述，中風(fēng)停顆粒可抑制ACI大鼠NLRP3炎癥小體表達(dá)水平，減輕炎癥反應(yīng)，改善MMP-9、EGF、VEGF-A表達(dá)。

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（收稿日期：2023-11-28）

（本文編輯郭懷?。?/p>