環(huán)泊酚減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究

摘要" 目的：探究環(huán)泊酚對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）性損傷的影響及其潛在機(jī)制。方法：H9c2心肌細(xì)胞分別用不同濃度環(huán)泊酚預(yù)處理48 h，并在缺氧條件下培養(yǎng)7 h，再?gòu)?fù)氧培養(yǎng)6 h。將細(xì)胞分為6組：對(duì)照組、H/R組、異丙酚組、環(huán)泊酚1 μmol/L組、環(huán)泊酚2 μmol/L組和環(huán)泊酚4 μmol/L組。使用噻唑藍(lán)（MTT）評(píng)估H9c2心肌細(xì)胞存活；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFHDA）評(píng)估細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平；試劑盒檢測(cè)丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法測(cè)定白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，H/R組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01），Caspase-3蛋白水平升高（P＜0.01）；ROS濃度和MDA含量增加（P＜0.01），SOD和GSH-Px活性降低（P＜0.01）；炎性細(xì)胞因子釋放明顯增加（P＜0.01）；蛋白激酶B（AKT）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、血紅素加氧酶1（HO-1）、核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2（Nrf2）蛋白表達(dá)下降（P＜0.01）。與H/R組相比，環(huán)泊酚2 μmol/L組、環(huán)泊酚4 μmol/L組心肌細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)明顯減輕（P＜0.01），AKT/GSK-3β/Nrf2通路明顯激活（P＜0.01）。結(jié)論：環(huán)泊酚在H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，是一種潛在的抗心肌缺血再灌注損傷候選藥物。

關(guān)鍵詞" 環(huán)泊酚；H9c2心肌細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧；細(xì)胞凋亡；氧化應(yīng)激；炎癥反應(yīng)；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.23.010

心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)病，具有高致殘率和高死亡率，也是病人生活質(zhì)量下降的主要原因［1-2］。心肌缺血與多種心臟病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是心肌梗死和惡性心律失常的急性加重因素。心肌缺血是由于缺乏血液流向心肌，導(dǎo)致氧氣、葡萄糖和其他可支持線(xiàn)粒體氧化磷酸化的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足［3］?；謴?fù)缺血性心臟的血供是缺血性心臟病的主要治療方法，但血液再灌注可引起心肌缺血/再灌注（I/R）損傷，使病人病情惡化，影響病人預(yù)后［4］。I/R伴有氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和炎癥反應(yīng)，可激活細(xì)胞凋亡、壞死和自噬，最終導(dǎo)致心肌的進(jìn)一步損傷［5］。由于心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，不能再生，因此，防止心肌細(xì)胞損傷是一種治療心肌缺血的有效策略。

環(huán)泊酚（HSK3486）是一種新型2，6-烷基二取代苯酚衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)似于異丙酚。在前期實(shí)驗(yàn)中，環(huán)泊酚具有起效快、恢復(fù)快、無(wú)積累、注射后疼痛小、呼吸抑制小等特點(diǎn)，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值［6］。研究表明，環(huán)泊酚表現(xiàn)出比異丙酚更高的脂溶性和藥代效力［6］。動(dòng)物研究表明，異丙酚對(duì)心肌I/R損傷具有保護(hù)作用［7］，環(huán)泊酚可以有效保護(hù)心臟心肌梗死［8］，但環(huán)泊酚對(duì)心肌I/R損傷是否有保護(hù)作用尚不清楚。本研究用缺氧/復(fù)氧（H/R）處理H9c2細(xì)胞以模擬體外I/R損傷，旨在確定環(huán)泊酚對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用和潛在機(jī)制。

1" 材料與方法

1.1" 主要試劑

大鼠心肌細(xì)胞（H9c2）購(gòu)自上海生物科學(xué)研究所；

基金項(xiàng)目" 山西省衛(wèi)健委科研課題項(xiàng)目（No.2019WS0605）

作者單位" 山西省心血管病醫(yī)院（太原 030024），E-mail：13835138359@163.com

引用信息" 劉艷，郝杰，張迅，等.環(huán)泊酚減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（23）：4293-4300.

環(huán)泊酚和異丙酚購(gòu)自四川海思科制藥公司；V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自武漢云克隆生物公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）診斷試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；所有抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2" 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠心肌H9c2細(xì)胞孵育在DMEM高糖培養(yǎng)基中，補(bǔ)充有10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）。在37 ℃，5% CO2的環(huán)境下，細(xì)胞保存在含95%空氣的加濕培養(yǎng)箱中。本研究獲得山西省心血管病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2023WJ500）。

1.3" 體外H/R模型［9］及分組

H9c2心肌細(xì)胞分別用0.5、1、2、4、8、16和32 μmol/L 環(huán)泊酚預(yù)處理48 h，并在缺氧條件下培養(yǎng)7 h，再?gòu)?fù)氧培養(yǎng)6 h。比較不同濃度環(huán)泊酚預(yù)處理后的H9c2細(xì)胞存活率以及缺氧7 h/復(fù)氧1～6 h的H9c2細(xì)胞存活率。將培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、H/R組、異丙酚組、環(huán)泊酚1 μmol/L組、環(huán)泊酚2 μmol/L組和環(huán)泊酚4 μmol/L組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，環(huán)丙酚各濃度組細(xì)胞在缺氧前用不同濃度的環(huán)泊酚處理1 h，異丙酚組細(xì)胞在缺氧前用異丙酚處理1 h，然后在缺氧條件下培養(yǎng)7 h，再?gòu)?fù)氧6 h。用4 μmol/L 環(huán)泊酚和10 μmol/L" PI3K抑制劑Ly294002共同處理H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞，分為對(duì)照組、環(huán)泊酚4 μmol/L組、環(huán)泊酚4 μmol/L＋10 μmol/L Ly294002組，檢測(cè)3組蛋白激酶B（AKT）/糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）/紅細(xì)胞相關(guān)因子2（Nrf2）信號(hào)通路蛋白表達(dá)、H9c2細(xì)胞凋亡率、氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎性因子。

1.4" 噻唑藍(lán)（MTT）法

將H9c2細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔的密度孵育在96孔板（美國(guó)Croning公司）中，環(huán)泊酚處理完成后，用磷酸緩沖液溶液（PBS）清洗每組H9c2細(xì)胞2次，并向每孔中加入100 μL正常培養(yǎng)基，20 μL的MTT溶液，并在37 ℃下孵育4 h。去除上清液后，向每孔中加入150 μL二甲基亞砜，并在振蕩器上振蕩10 min，并通過(guò)微孔板讀數(shù)器在490 nm處測(cè)量吸光度（OD）值。

1.5" 流式細(xì)胞術(shù)

環(huán)泊酚預(yù)處理和H/R損傷后，收集培養(yǎng)基中的懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞。用胰蛋白酶（北京碧云天生物技術(shù)有限公司）消化H9c2細(xì)胞。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用冰PBS洗滌細(xì)胞2次，并將其重懸在1×結(jié)合緩沖液（300 μL）中。室溫條件下，用異Annexin V-FITC（5 μL）和PI（5 μL）在黑暗中對(duì)細(xì)胞染色15 min。最后，使用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）分析伴隨光散射的熒光信號(hào)。

1.6" 活性氧（ROS）水平檢測(cè)

環(huán)泊酚預(yù)處理和H/R損傷的H9c2細(xì)胞達(dá)到70%～80%的融合度時(shí)，取出上層培養(yǎng)基，并用PBS洗滌2次。用ROS測(cè)定試劑盒（美國(guó)Abcam公司）在37 ℃下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行30 min的染色。用適合于異硫氰酸熒光素（FITC）的過(guò)濾器組對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像。在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.7" MDA、SOD和 GSH-Px 活性測(cè)定

環(huán)泊酚預(yù)處理和H/R損傷后，用指定的商業(yè)試劑盒采集細(xì)胞，測(cè)量H9c2細(xì)胞中MDA、SOD水平和GSH-Px活性。

1.8" 促炎細(xì)胞因子水平測(cè)定

環(huán)泊酚預(yù)處理和H/R損傷后，離心H9c2細(xì)胞并收集上清液。根據(jù)制造商的說(shuō)明，通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)白介素（IL）-6、IL-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α水平。

1.9" 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

在4 ℃下用RIPA裂解緩沖液提取H9c2蛋白，使用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)有限公司）測(cè)定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 （SDS-PAGE） 電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯（PVDF） 膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，4 ℃下用稀釋的抗Caspase-3（1∶1 000）、抗蛋白激酶B（AKT）（1∶1 000）、抗糖原合酶激酶3β（GSK-3β）（1∶1 000）、抗核因子紅細(xì)胞相關(guān)因子2（Nrf2）和抗血紅素加氧酶1（HO-1）孵育過(guò)夜。用與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育1 h，并用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)。用Image J 分析圖像灰度值。以β-actin作為內(nèi)參。

1.10" 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)" 果

2.1" 環(huán)泊酚對(duì)H/R損傷性H9c2細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組相比，H9c2細(xì)胞存活率隨著復(fù)氧時(shí)間的增加而降低（P＜0.01）。在缺氧7 h和復(fù)氧6 h條件下，細(xì)胞存活率為（55.23±3.41）%。詳見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，環(huán)泊酚0.5 μmol/L組、環(huán)泊酚1 μmol/L組、環(huán)泊酚2 μmol/L組、環(huán)泊酚4 μmol/L組H9c2細(xì)胞存活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明在0.5～4 μmol/L劑量下環(huán)泊酚對(duì)H9c2細(xì)胞沒(méi)有毒性。與對(duì)照組相比，環(huán)泊酚濃度高于8 μmol/L時(shí)，H9c2細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.01），表明高于8 μmol/L的劑量對(duì)細(xì)胞有毒性。詳見(jiàn)圖2。與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞存活率下降至（56.87±1.95）%（P＜0.01）；與H/R組相比，不同濃度環(huán)泊酚組細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0.01）。詳見(jiàn)圖3。

2.2" 環(huán)泊酚對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，H/R誘導(dǎo)了HCC827和PC-9細(xì)胞凋亡，裂解的Caspase-3表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。與H/R組相比，環(huán)泊酚明顯抑制H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，裂解的Caspase-3表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），表明環(huán)泊酚抑制H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。詳見(jiàn)圖4～圖7。

2.3" 環(huán)泊酚對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對(duì)照組相比，H/R組MDA含量明顯增加，GSH-Px和SOD活性明顯降低，ROS水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與H/R組相比，環(huán)泊酚2、4 μmol/L處理明顯減弱了H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激（P＜0.01），表明環(huán)泊酚處理可減少H/R誘導(dǎo)心肌損傷中的氧化應(yīng)激。詳見(jiàn)圖8～圖10。

2.4" 環(huán)泊酚對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響

與對(duì)照組相比，H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高（P＜0.01）；與H/R組相比，環(huán)泊酚2 μmol/L組、環(huán)泊酚4 μmol/L組IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低（P＜0.01），表明環(huán)泊酚處理減弱了H9c2細(xì)胞炎癥反應(yīng)。詳見(jiàn)圖11。

2.5" 環(huán)泊酚對(duì)AKT/GSK-3β/Nrf2通路的影響

與對(duì)照組相比，環(huán)泊酚可下調(diào)p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)（P＜0.01）。與H/R組相比，環(huán)泊酚2、4 μmol/L處理明顯增加p-AKT、p-GSK-3β、Nrf2和HO-1表達(dá)（P＜0.01），表明環(huán)泊酚激活了AKT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)通路。詳見(jiàn)圖12、圖13。

2.6" 環(huán)泊酚通過(guò)AKT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)通路保護(hù)心臟損傷

用4 μmol/L環(huán)泊酚和10 μmol/L的磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑Ly294002共同處理H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞。與環(huán)泊酚組相比，LY294002在H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中明顯逆轉(zhuǎn)了環(huán)泊酚的抗凋亡、抗氧化應(yīng)激和抗炎癥反應(yīng)作用（P＜0.05），表明環(huán)泊酚通過(guò)抑制AKT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)通路保護(hù)心肌I/R損傷。詳見(jiàn)圖14～圖21。

3" 討" 論

本研究闡明了環(huán)泊酚在調(diào)節(jié)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞心肌損傷中的保護(hù)作用。結(jié)果表明，環(huán)泊酚減輕了H9c2心肌細(xì)胞中H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)生和炎性因子的釋放。PI3K抑制劑Ly294002下調(diào)Nrf2的激活，并部分逆轉(zhuǎn)了環(huán)泊酚的保護(hù)作用。此外，環(huán)泊酚通過(guò)激活A(yù)KT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)在心肌I/R損傷中發(fā)揮重要作用。

炎癥反應(yīng)是心肌損傷的一個(gè)關(guān)鍵特征，表現(xiàn)為釋放出大量的促炎細(xì)胞，包括IL-6、IL-1β 和TNF-α［10］，加劇心臟損害和心肌細(xì)胞凋亡。此外，炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，互相調(diào)節(jié)，引發(fā)惡性循環(huán)最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡和凋亡［11］。本研究中，I/R誘導(dǎo)明顯升高IL-6、IL-1β 和TNF-α表達(dá)水平，而環(huán)泊酚給藥明顯降低炎性因子的釋放。在心肌I/R損傷條件下，細(xì)胞凋亡通路被異常激活，并發(fā)生過(guò)度凋亡［12］。一些實(shí)驗(yàn)研究表明，可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡改善心肌I/R損傷［13］。本研究還發(fā)現(xiàn)，環(huán)泊酚處理明顯抑制H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率，并抑制Caspase-3的裂解。這些結(jié)果表明，環(huán)泊酚可作為一種抗H/R誘導(dǎo)的心臟炎癥和心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)劑。

ROS是心肌I/R損傷的主要致病因素之一［14］，內(nèi)源性抗氧化劑SOD水平間接影響細(xì)胞清除氧自由基的能力。心肌細(xì)胞更容易受到自由基損傷，因?yàn)槠浜休^少的抗氧化劑和抗氧化酶，如GSH、SOD和過(guò)氧化氫酶。當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生H/R損傷時(shí)，心肌損傷標(biāo)志物乳酸脫氫酶（LDH）和MDA會(huì)增加［15］。MDA是一種脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)，可以遷移到細(xì)胞內(nèi)外，從而加劇了氧化應(yīng)激引起的損傷范圍。本研究發(fā)現(xiàn)，H/R處理后MDA和ROS水平明顯增加，活細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并明顯降低了抗氧化酶GSH-Px和SOD的活性。這些結(jié)果表明，環(huán)泊酚可以通過(guò)增加GSH-Px和SOD活性來(lái)減少ROS和MDA的產(chǎn)生，從而防止心肌H/R損傷。

活性AKT可促進(jìn)體外心肌細(xì)胞的存活，并對(duì)心肌H/R損傷具有保護(hù)作用。GSK-3β是PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵下游分子，通常通過(guò)PI3K/AKT介導(dǎo)的磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［16］。缺血預(yù)處理或后處理可以通過(guò)激活PI3K-AKT-GSK-3β通路抑制線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔道（mPTP）開(kāi)放來(lái)預(yù)防心肌H/R損傷［17］。本研究中，環(huán)泊酚增強(qiáng)了AKT和GSK-3β的磷酸化水平，同時(shí)環(huán)泊酚對(duì)心肌H/R損傷的保護(hù)作用被PI3K抑制劑逆轉(zhuǎn)。Nrf2是氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子之一，被認(rèn)為是抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的重要抗氧化傳感器［18］。增強(qiáng)Nrf2轉(zhuǎn)錄活性可以減弱H/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和心肌損傷［19］。Nrf2上調(diào)易位到細(xì)胞核以增加氧化應(yīng)激反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄［如HO-1、醌氧化還原酶-1（NQO-1）］，而HO-1的上調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)H/R誘導(dǎo)損傷的抗性［19］。研究表明，Nrf2的核轉(zhuǎn)位需要PI3K/AKT途徑的激活［20］。在本研究中，環(huán)泊酚處理增加了AKT和GSK-3β的磷酸化。此外，環(huán)泊酚可明顯上調(diào)Nrf2蛋白及其下游基因HO-1，以抑制H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷。這些結(jié)果表明，環(huán)泊酚通過(guò)激活H9c2細(xì)胞中的AKT/GSK3β/Nrf2信號(hào)軸發(fā)揮抗心肌損傷作用。

綜上所述，本研究闡明了環(huán)泊酚通過(guò)激活A(yù)KT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)保護(hù)H9c2細(xì)胞免受H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥的影響。環(huán)泊酚可能在心肌I/R損傷的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，并提示環(huán)泊酚/AKT/GSK-3β/Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)是調(diào)節(jié)心肌I/R損傷的一種新機(jī)制。本研究為環(huán)泊酚在臨床麻醉中，特別是在心臟病病人中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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（收稿日期：2023-04-11）

（本文編輯郭懷?。?/p>