焙烤食品微生物檢測現(xiàn)狀及對策研究

摘 要：焙烤食品易受微生物污染，威脅食品安全。本文分析了焙烤食品微生物檢測現(xiàn)狀，指出快速檢測技術(shù)應(yīng)用范圍有限、多重PCR檢測方法優(yōu)化不足、微生物毒素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化程度低等問題，提出了拓展快速檢測技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域、優(yōu)化多重PCR檢測方法的設(shè)計(jì)與條件、建立微生物毒素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化體系，以期為強(qiáng)化焙烤食品質(zhì)量安全監(jiān)管提供參考。

關(guān)鍵詞：焙烤食品；微生物檢測；多重PCR；毒素

Current Situation and Countermeasures of Microbial Detection in Baked Food

HU Zhigao

（Tsui Xiangyuan Health Food （Zhongshan） Co.， Ltd.， Zhongshan 528437， China）

Abstract： Baked goods are susceptible to microbial contamination， threatening food safety. This paper analyzed the current situation of microbial detection of baked food， pointed out that the application range of rapid detection technology was limited， the optimization of multiple PCR detection methods was insufficient， and the standardization of microbial toxin detection methods was low. It proposed to expand the application field of rapid detection technology， optimize the design and conditions of multiple PCR detection methods， and establish a standardized system of microbial toxin detection methods， in order to provide reference for strengthening the quality and safety supervision of baked food.

Keywords： baked food; microbial detection; multiplex PCR; toxin

隨著人們生活水平的提高，焙烤食品已成為人們餐桌上不可或缺的一部分。然而，焙烤食品在生產(chǎn)、貯存和銷售過程中極易受到微生物的污染，給食品安全和消費(fèi)者健康帶來隱患[1]。微生物檢測是評估焙烤食品安全狀況的重要手段，然而目前國內(nèi)外焙烤食品微生物檢測仍存在諸多問題亟待改進(jìn)。本文就焙烤食品微生物檢測現(xiàn)狀進(jìn)行分析，并提出相應(yīng)的優(yōu)化對策。

1 焙烤食品類別及常見微生物

焙烤食品按原料、工藝、口感特點(diǎn)可分為面包、蛋糕、餅干、曲奇和月餅等多個品類。其中，面包主要由小麥粉、酵母發(fā)酵而成，品種涵蓋歐包、丹麥包、吐司等；蛋糕以雞蛋、砂糖、小麥粉為主要原料，經(jīng)打發(fā)、烘烤等工序制成，如戚風(fēng)蛋糕、芝士蛋糕等；餅干則通過調(diào)制餅干坯、成型、烘烤等步驟制得，常見品類有蘇打餅干、奶油餅干等。焙烤食品生產(chǎn)涉及原輔料處理、面團(tuán)調(diào)制、發(fā)酵、整形、裝飾、烘焙、冷卻和包裝等環(huán)節(jié)。生產(chǎn)過程中如果衛(wèi)生條件控制不當(dāng)，容易引入多種微生物而污染產(chǎn)品[2]。一般而言，焙烤食品中常見微生物包括霉菌、酵母菌、耐熱菌和大腸菌群等。霉菌主要有葡萄孢屬、曲霉屬等，可引起面包、蛋糕等發(fā)霉變質(zhì)；酵母菌如白色念珠菌等可造成面團(tuán)醒發(fā)不良、產(chǎn)品酸??；耐熱菌如嗜熱脂肪芽孢桿菌等在焙烤工藝中有一定存活率，可影響產(chǎn)品貨架期；大腸菌群如大腸埃希菌等在食品中被檢測到，則提示食品受到糞便污染，存在潛在致病風(fēng)險。此外，部分微生物還會產(chǎn)生對人體有害的毒素，如曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素、棒曲霉菌產(chǎn)生的赭曲霉毒素等。

2 焙烤食品微生物檢測技術(shù)概述

焙烤食品微生物檢測技術(shù)經(jīng)歷了從傳統(tǒng)培養(yǎng)方法到快速檢測方法的發(fā)展歷程。傳統(tǒng)微生物檢測依賴于選擇性培養(yǎng)基。然而，傳統(tǒng)微生物檢測方法耗時長、操作煩瑣，難以滿足食品工業(yè)快節(jié)奏生產(chǎn)的需求。為提升檢測效率，酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）等快速檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)。ELISA法是利用抗原抗體特異性結(jié)合原理，通過酶促顯色反應(yīng)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的高靈敏檢出。例如，利用雙抗體夾心ELISA檢測赭曲霉毒素，靈敏度可達(dá)0.1 ng·mL-1。PCR技術(shù)以特異性引物擴(kuò)增微生物基因組特定序列，結(jié)合電泳、熒光探針等手段實(shí)現(xiàn)微生物的定性定量分析。例如，采用TaqMan探針法對大腸埃希菌進(jìn)行定量PCR檢測，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)[3]。此外，生物芯片技術(shù)、生物傳感技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)等新興手段也為焙烤食品微生物檢測提供了新的思路。例如，基于核酸適配體的微生物生物芯片可實(shí)現(xiàn)多種致病菌的同時檢測；基于抗體修飾石英晶體微天平的生物傳感器可用于霉菌毒素快速篩查；結(jié)合熒光原位雜交與流式細(xì)胞術(shù)可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中微生物的原位定量分析。上述新興技術(shù)在提升檢測速度、靈敏度等方面優(yōu)勢明顯，但仍需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)業(yè)化，以期在焙烤食品微生物檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

3 焙烤食品微生物檢測現(xiàn)狀及常見問題

3.1 快速檢測技術(shù)應(yīng)用范圍有限

焙烤食品微生物快速檢測技術(shù)雖已取得長足進(jìn)步，但在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一定局限性。酶聯(lián)免疫吸附測定法是一種常用的快速檢測手段，然而當(dāng)前商品化的ELISA試劑盒多針對單一菌種或毒素，如僅檢測沙門氏菌或黃曲霉毒素，尚難以實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的同時檢測，不利于全面評估食品安全風(fēng)險。此外，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的分子生物學(xué)檢測方法的靈敏度高，但對反應(yīng)條件控制要求嚴(yán)格，樣品基質(zhì)中共提物、抑制物等干擾因素可導(dǎo)致假陰性結(jié)果，影響檢出率。而生物芯片、生物傳感器等新興快檢技術(shù)雖可實(shí)現(xiàn)高通量、智能化檢測，如基于微流控芯片的多重PCR可同時分析多達(dá)24種食源性致病菌，但儀器設(shè)備昂貴、操作專業(yè)性強(qiáng)，在基層檢測機(jī)構(gòu)中推廣應(yīng)用仍面臨諸多挑戰(zhàn)[4]。

3.2 多重PCR檢測方法優(yōu)化不足

當(dāng)前焙烤食品中致病菌污染問題不容忽視，而多重PCR技術(shù)雖有望實(shí)現(xiàn)多病原體同時檢測，但仍面臨優(yōu)化不足的問題。多重PCR檢測通量有限，一次反應(yīng)能夠同時檢測的目標(biāo)菌種數(shù)量較少，如雙重PCR、三重PCR等，難以全面覆蓋焙烤食品中的各類致病菌。以三重PCR檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌為例，雖然可一步篩查3種常見致病菌，但對于李斯特菌、腸炎病毒等其他可能存在的病原體則無能為力。同時，引物和探針的設(shè)計(jì)是影響多重PCR特異性和靈敏度的關(guān)鍵因素。不同引物競爭性結(jié)合模板會導(dǎo)致擴(kuò)增效率下降，特異性降低，產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。而TaqMan探針雖然特異性強(qiáng)，但價格昂貴，多重檢測所需探針數(shù)量多，成本高昂。新型探針如熔解曲線探針雖然經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但在多重檢測中交叉信號干擾問題更為突出[5]。此外，多重PCR產(chǎn)物一般采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，而常規(guī)凝膠電泳的分辨率和靈敏度有限，易出現(xiàn)條帶拖尾、彌散等現(xiàn)象，不利于準(zhǔn)確判讀結(jié)果。

3.3 微生物毒素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化程度低

微生物毒素是焙烤食品安全監(jiān)管的重點(diǎn)之一，但現(xiàn)行檢測方法存在標(biāo)準(zhǔn)化程度不高等問題，直接影響到檢測數(shù)據(jù)的可比性和權(quán)威性。以黃曲霉毒素檢測為例，酶聯(lián)免疫吸附測定法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography Tandem-Mass Spectrometry，LC-MS/MS）是兩類常用的檢測方法。理論上，兩種方法的靈敏度和特異性均能滿足痕量分析要求，但在實(shí)際應(yīng)用中，不同廠家生產(chǎn)的ELISA試劑盒質(zhì)量參差不齊，缺乏統(tǒng)一的性能評價標(biāo)準(zhǔn)；而LC-MS/MS雖然被視為痕量分析的金標(biāo)準(zhǔn)，但基質(zhì)效應(yīng)顯著，缺乏可溯源的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)室采用的前處理方法和檢測條件差異較大，結(jié)果的重現(xiàn)性難以保證。類似問題在赭曲霉毒素、伏馬毒素等其他常見真菌毒素的檢測中同樣存在。由于缺乏統(tǒng)一、權(quán)威的毒素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，不同實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)可比性差，既不利于精準(zhǔn)評估焙烤食品的安全風(fēng)險，又無法為制定科學(xué)的限量標(biāo)準(zhǔn)提供可靠依據(jù)。

4 焙烤食品微生物檢測技術(shù)優(yōu)化對策

4.1 拓展快速檢測技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域

焙烤食品微生物快速檢測技術(shù)應(yīng)用范圍有限的問題亟待突破。針對ELISA法單一靶標(biāo)檢測的局限性，可考慮發(fā)展多重抗體芯片技術(shù)。通過在芯片表面固定化多種特異性抗體，實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等多種致病菌的同時檢測，大幅提升檢測通量。同時，優(yōu)化芯片表面化學(xué)修飾方法，引入納米金、量子點(diǎn)等新型信號放大元件，有望進(jìn)一步提高靈敏度，拓寬檢測下限。而針對PCR技術(shù)易受基質(zhì)干擾的問題，可探索將核酸適配體技術(shù)與PCR相結(jié)合，利用核酸適配體高特異性、強(qiáng)親和力和耐受性的優(yōu)勢，通過優(yōu)化富集捕獲條件，減少樣品基質(zhì)對PCR反應(yīng)的抑制作用，提高檢出率。在PCR產(chǎn)物檢測方面，可嘗試將毛細(xì)管電泳、熔解曲線分析等方法引入食品檢測領(lǐng)域。毛細(xì)管電泳具有分離效率高、靈敏度強(qiáng)、自動化程度高等特點(diǎn)，有望提升PCR產(chǎn)物的分辨率和定量精度。而熔解曲線分析可實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物鑒定一體化，通過分析擴(kuò)增子的熔解溫度判斷其特異性，避免了凝膠電泳操作，縮短了檢測周期。此外，隨著微流控芯片、生物傳感器等新興技術(shù)的發(fā)展，有望突破現(xiàn)有快檢技術(shù)的應(yīng)用瓶頸。例如，基于核酸適配體的生物傳感器具有響應(yīng)速度快、重復(fù)使用性強(qiáng)的特點(diǎn)，將其與無線射頻識別等物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)相結(jié)合，有望實(shí)現(xiàn)對焙烤食品生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的實(shí)時監(jiān)控和溯源。

4.2 優(yōu)化多重PCR檢測方法的設(shè)計(jì)與條件

針對當(dāng)前多重PCR檢測方法優(yōu)化不足的問題，可從引物和探針設(shè)計(jì)、擴(kuò)增條件優(yōu)化、產(chǎn)物檢測手段等方面入手進(jìn)行系統(tǒng)改進(jìn)。①在引物設(shè)計(jì)方面，應(yīng)綜合考慮引物的特異性、靈敏度、擴(kuò)增效率等關(guān)鍵參數(shù)。例如，采用生物信息學(xué)軟件輔助優(yōu)化引物序列，通過比對分析排除引物間二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等熱力學(xué)不穩(wěn)定因素，降低非特異擴(kuò)增風(fēng)險；同時優(yōu)化引物退火溫度、GC含量等，在提高特異性的同時兼顧擴(kuò)增效率。②在探針設(shè)計(jì)方面，可開發(fā)新型通用探針以降低成本。例如，設(shè)計(jì)以堿基類似物為修飾的通用熔解曲線探針，通過改變堿基類似物的種類和數(shù)量調(diào)控探針熔解溫度，實(shí)現(xiàn)對不同擴(kuò)增子的精細(xì)判別，避免了多重檢測中探針信號重疊的問題。③在擴(kuò)增條件優(yōu)化方面，可引入新型耐高溫DNA聚合酶，如采用來源于嗜熱古細(xì)菌的SD DNA聚合酶，擴(kuò)大退火溫度范圍，提高引物結(jié)合特異性；同時優(yōu)化鎂離子濃度、dNTP用量等，在保證擴(kuò)增效率的前提下最大限度地抑制非特異擴(kuò)增。④在產(chǎn)物檢測手段方面，可將高分辨率熔解曲線（High-Resolution Melting，HRM）分析引入多重PCR結(jié)果判讀。HRM通過檢測擴(kuò)增子解鏈過程中熒光信號變化，依據(jù)熔解曲線形狀差異實(shí)現(xiàn)基于擴(kuò)增子長度、序列、GC含量的精確分型，區(qū)分能力遠(yuǎn)超傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠電泳；結(jié)合飽和染料如Eva Green、LC Green等，可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增子熔解溫度的可視化調(diào)控，進(jìn)一步提升分型的靈敏度和準(zhǔn)確性。

4.3 建立微生物毒素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化體系

微生物毒素檢測方法標(biāo)準(zhǔn)化程度低的問題亟待系統(tǒng)解決，其關(guān)鍵在于構(gòu)建一個覆蓋毒素提取、凈化、濃縮和檢測全流程的標(biāo)準(zhǔn)化體系。針對ELISA法試劑盒質(zhì)量參差不齊的問題，可從抗體制備入手，通過優(yōu)化免疫原設(shè)計(jì)和篩選策略，制備出高親和力、高特異性的單克隆抗體，并建立統(tǒng)一的表征方法和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，從源頭提升試劑盒性能的穩(wěn)定性和可比性。針對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法存在基質(zhì)效應(yīng)和缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等問題，可從樣品前處理、儀器參數(shù)優(yōu)化、定量方法確證等方面系統(tǒng)優(yōu)化。例如，在樣品前處理環(huán)節(jié)，可引入固相萃取、分子印跡等高效凈化技術(shù)，通過優(yōu)化凈化填料和洗脫溶劑，最大限度地去除基質(zhì)干擾；在儀器參數(shù)優(yōu)化方面，可通過選擇合適的電離模式、母離子和子離子、碰撞能量等參數(shù)，提高檢測的靈敏度和特異性；在定量分析中，應(yīng)重點(diǎn)加強(qiáng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)品的合成與應(yīng)用，通過同位素稀釋等手段準(zhǔn)確校正基質(zhì)效應(yīng)，保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。此外，還應(yīng)加快推進(jìn)各類微生物毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和應(yīng)用，其純度和均勻性應(yīng)通過核磁共振、高效液相色譜等多種手段嚴(yán)格質(zhì)控，并建立完善的定值方法和不確定度評估體系，從而在不同實(shí)驗(yàn)室間實(shí)現(xiàn)毒素定量檢測結(jié)果的有效溯源和比對。

5 結(jié)語

微生物污染是威脅焙烤食品安全的重要因素?，F(xiàn)有檢測技術(shù)雖取得一定進(jìn)展，但仍面臨諸多亟待改進(jìn)的問題。未來應(yīng)著力拓展快速檢測新方法的應(yīng)用、優(yōu)化多重PCR檢測方案設(shè)計(jì)、構(gòu)建微生物毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)化體系，為精準(zhǔn)評估和有效控制焙烤食品安全風(fēng)險提供更加有力的技術(shù)支撐，切實(shí)維護(hù)消費(fèi)者的健康權(quán)益。

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作者簡介：胡志高（1983—），男，廣東中山人，本科，高級工程師。研究方向：食品安全工程。