高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉及兒童食品中的防腐劑

摘 要：目的：建立采用高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉及兒童食品中防腐劑的分析方法。方法：樣品經(jīng)水提取，通過(guò)蛋白劑沉降，正己烷萃取純化，高效液相色譜定量分析。結(jié)果：脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸在0.5～100.0 mg·L-1線性關(guān)系良好，檢出限為0.5～1.1 mg·kg-1，定量限為0.9～2.2 mg·kg-1；平均加標(biāo)回收率在90.1%～109.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～4.2%（n=6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高，適用于嬰幼兒乳粉及兒童食品中脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；防腐劑；嬰幼兒乳粉；兒童食品

Determination of Preservatives in Infant Milk Powder and Children’s Food by High Performance Liquid Chromatography

LI Xiaojuan

（Pediatric Department， Longxi Maternal and Child Care Service Centre， Longxi 748100， China）

Abstract： Objective： To establish an analytical method for determining preservatives in infant milk powder and children’s food using high-performance liquid chromatography. Method： The sample was extracted with water， precipitated with a protein agent， purified by n-hexane extraction， and quantitatively analyzed by high-performance liquid chromatography. Result： Dehydroacetic acid， benzoic acid， and sorbic acid showed a good linear relationship between 0.5 mg·L-1 to 100.0 mg·L-1， with a detection limit of 0.5 mg·kg-1 to 1.1 mg·kg-1 and a quantification limit of 0.9 mg·kg-1 to 2.2 mg·kg-1; the average recovery rate of spiked samples ranged from 90.1% to 109.2%， with a relative standard deviation of 1.2% to 4.2% （n=6）. Conclusion： This method is easy to operate， highly accurate， and suitable for the detection of dehydroacetic acid， benzoic acid， and sorbic acid in infant milk powder and children’s food.

Keywords： high performance liquid chromatography method; additives; infant milk powder; children food

食品中添加防腐劑的作用是防止食品變質(zhì)，延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期及保鮮期[1]。食品中適當(dāng)添加防腐劑對(duì)人體健康沒(méi)有太大影響，但過(guò)量攝入則會(huì)對(duì)身體健康構(gòu)成威脅。特別地，嬰幼兒及兒童腸胃虛弱，攝入過(guò)量防腐劑會(huì)對(duì)胃腸道黏膜產(chǎn)生刺激，引起惡心嘔吐等癥狀，對(duì)身體健康造成嚴(yán)重影響[2]。研究表明，脫氫乙酸在食品中的應(yīng)用有較高的風(fēng)險(xiǎn)，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2024）對(duì)食品中脫氫乙酸的使用進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定，并提出在部分食品中禁止使用脫氫乙酸[3]。部分市售的嬰幼兒乳粉及兒童產(chǎn)品宣稱“零添加”，為了確認(rèn)該標(biāo)識(shí)是否屬實(shí)，有必要對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。

目前，防腐劑的常用檢測(cè)方法有氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）[4]、液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[5]、液相色譜-質(zhì)譜法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MS）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas Chromatography Mass Spectrometry，GC-MS）[7]等。目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中針對(duì)脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的檢測(cè)方法不同，存在前處理煩瑣、儀器方法不統(tǒng)一、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，給檢驗(yàn)帶來(lái)不便。本文參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脫氫乙酸的測(cè)定》（GB 5009.121—2016）[8]和《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》（GB 5009.28—2016）[9]，進(jìn)行檢測(cè)條件優(yōu)化，采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定嬰幼兒乳粉及兒童食用產(chǎn)品中脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的含量，以期為嬰幼兒乳粉及兒童食用產(chǎn)品中防腐劑的檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒乳粉及兒童食用產(chǎn)品，購(gòu)自超市、醫(yī)院、藥店、育嬰店。

苯甲酸（純度為99.7%；CAS：65-85-0），中國(guó)食品藥品檢定研究院；山梨酸（純度為99.7%；CAS：22500-92-1），中國(guó)食品藥品檢定研究院；脫氫乙酸（純度為99.9%；CAS：520-45-6），曼哈格生物科技有限公司；正己烷、乙腈、乙酸乙酯、丙酮和氯仿，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙酸鋅、亞鐵氰化鉀，分析純，上海聯(lián)試化工試劑有限公司；乙酸銨，分析純，天津聚恒達(dá)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（配DAD二極管陣列檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫公司；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），美國(guó)Waters公司；電子天平，美國(guó)奧豪斯公司；臺(tái)式離心機(jī)，常州金壇良友儀器有限公司；渦旋振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平，賽多利斯公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈-0.02 mol·L-1乙酸銨（10∶90，V∶V），等度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)：293 nm、230 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用移液管取苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度均為1 000 mg·L-1）0.5 mL，用水配制成50 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)液。再用嬰幼兒乳粉空白基質(zhì)配制成濃度為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5.0 g，置于50 mL塑料離心管中，加水10 mL，再加2 mL乙酸鋅溶液（183 g·L-1）和2 mL亞鐵氰化鉀（92 g·L-1），加水至25 mL，渦旋振蕩5 min，加入5 mL正己烷，渦旋振蕩5 min，8 000 r·min-1離心5 min，取下層水層過(guò)0.22 μm濾膜，供檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

在市售的嬰幼兒乳粉和兒童食品中，兒童果汁、兒童醬油等液體樣品的蛋白質(zhì)和脂肪含量低，脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸提取容易；但對(duì)于蛋白質(zhì)和脂肪含量較高的產(chǎn)品，如嬰幼兒乳粉及含乳食品奶片、兒童乳酪、兒童有機(jī)核桃油和嬰幼兒輔食等，因待測(cè)組分包裹在樣品中，如果不除去大量蛋白質(zhì)和脂肪，提取時(shí)會(huì)出現(xiàn)乳化和待測(cè)物提取不完全的現(xiàn)象。而脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸在水中溶解性較好，故本實(shí)驗(yàn)在樣品前處理中先加入10 mL水，使樣品分散，再用有機(jī)試劑除去脂溶性雜質(zhì)，釋放出游離態(tài)脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸。

本文研究過(guò)程中考察了乙酸乙酯、丙酮、正己烷對(duì)嬰幼兒乳粉中脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的提取效果，以加標(biāo)濃度50 mg·L-1的待測(cè)物在嬰幼兒配方乳品中的回收率為考察指標(biāo)，對(duì)比乙酸乙酯、丙酮、正己烷和氯仿對(duì)脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的提取效果。結(jié)果表明，正己烷萃取效果最佳，見(jiàn)圖1。

2.2 色譜條件優(yōu)化

對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)按1.3.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，嬰幼兒配方乳品和兒童食品中的脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸能完全分離，相鄰色譜峰分離度大于2.0，理論板數(shù)大于10 000，干擾小。詳見(jiàn)圖2。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

按1.3.2項(xiàng)方法配制系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，經(jīng)液相色譜儀檢測(cè)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程及相關(guān)系數(shù)如下。脫氫乙酸：Y=0.034X-0.020，r2=0.999 2；苯甲酸：Y=3.17X+0.036，r2=0.999 0；山梨酸：Y=5.22X+0.019，r2=0.999 1。各目標(biāo)物質(zhì)在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均＞0.99。

以3倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，以10倍信噪比（S/N）對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，得出脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的檢出限為0.5～1.1 mg·kg-1，定量限為0.9～2.2 mg·kg-1，能夠滿足嬰幼兒配方乳粉和兒童食品中脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的定量分析[3]。

2.4 回收率和精密度

依次在嬰幼兒配方乳粉和兒童食品空白基質(zhì)中加入0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別平行測(cè)定6次，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。在3個(gè)添加水平下，本方法對(duì)應(yīng)的脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的平均回收率在90.1%～109.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.2%～4.2%（n=6），優(yōu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[8-9]，表明本方法適用于嬰幼兒配方乳粉和兒童食品中脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸的提取和凈化，方法的準(zhǔn)確度和精密度均滿足定量分析要求。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

抽取市場(chǎng)上不同嬰幼兒配方乳粉和兒童食品樣品35批次，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，2份兒童醬油樣品中測(cè)出防腐劑山梨酸，2份樣品檢出脫氫乙酸（分別是嬰兒輔食餅干和兒童肉腸）；2份樣品防腐劑超標(biāo)，分別是兒童醬油（山梨酸超標(biāo)）和兒童奶酪棒（脫氫乙酸超標(biāo)），山梨酸和脫氫乙酸的超標(biāo)率均為2.9%；其他樣品均未檢出脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸。

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒乳粉及兒童食品中的防腐劑含量，并對(duì)前處理方法及檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該方法前處理簡(jiǎn)單，僅需要簡(jiǎn)單溶解和萃取，檢測(cè)結(jié)果提取回收率高、分離效果好，能滿足嬰幼兒配方乳粉和兒童食品中脫氫乙酸、苯甲酸和山梨酸含量的測(cè)定要求。

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