西維來司他鈉對LPS誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

【摘要】 目的：探討西維來司他鈉對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法：海南省人民醫(yī)院于2021年7月—2022年2月采用LPS建立大鼠H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，分為對照組、LPS組、西維來司他鈉+LPS組。其中西維來司他鈉+LPS組分為高濃度組（LPS+high，10 μg/mL）、中濃度組（LPS+medium，4.8 μg/mL）、低濃度組（LPS+low，1.6 μg/mL）。LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷6 h后，檢測心肌細(xì)胞上清液中的白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，對比各組上述因子水平的差異性。結(jié)果：與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組、高濃度組的IL-6、TNF-α、IL-1β、LDH水平均顯著升高，SOD均下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組的MDA水平均顯著升高（Plt;0.05）；與LPS組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組的IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA、LDH均下降，SOD水平均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）。結(jié)論：西維來司他鈉可減少LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥因子和氧化應(yīng)激因子的產(chǎn)生，減輕心肌細(xì)胞損傷，從而起到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

【關(guān)鍵詞】 膿毒癥 膿毒癥心肌病 炎癥因子 氧化應(yīng)激 西維來司他鈉

Protective Effect of Sivelestat Sodium on LPS-induced Myocardial Cells Injury in Rats/GAO Xiaoxin， ZHANG Rujun， TIAN Jia， LEI Zhenlin， CHEN Qing’an. //Medical Innovation of China， 2024， 21（33）： -174

[Abstract] Objective： To investigate the protective effect of Sivelestat Sodium on lipopolysaccharide （LPS）-induced myocardial cells injury in rats. Method： The rat H9c2 myocardial cells injury model was established by LPS in Hainan General Hospital from July 2021 to February 2022， which were divided into control group， LPS group， and Sivelestat Sodium + LPS group. Among them， Sivelestat Sodium + LPS group were divided into high concentration group （LPS + high， 10 μg/mL）， medium concentration group （LPS + medium， 4.8 μg/mL） and low concentration group （LPS+low， 1.6 μg/mL）. The levels of interleukin-6 （IL-6）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β）， malondialdehyde （MDA）， lactate dehydrogenase （LDH） and superoxide dismutase （SOD） in the supernatant of myocardial cell were detected after 6 h of LPS-induced myocardial cell injury. The differences of the above factors in each group were compared. Result： Compared with control group， the levels of IL-6， TNF-α， IL-1β and LDH in LPS group and low concentration group， medium concentration group and high concentration group were significantly increased， and SOD were decreased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Compared with control group， the levels of MDA in LPS group and low concentration group， medium concentration group and high concentration group were significantly increased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Compared with LPS group， IL-6， TNF-α， IL-1β， MDA and LDH in low concentration group， medium concentration group and high concentration group were decreased， and SOD levels were increased， the differences were statistically significant （Plt;0.05）. Conclusion： Sivelestat Sodium can reduce the production of inflammatory factors and oxidative stress factors in LPS-induced induced myocardial cells， alleviate the injury of myocardial cells， and thus play a role in protecting myocardial cells.

[Key words] Sepsis Sepsis-induced cardiomyopathy Inflammatory factors Oxidative stress Sivelestat Sodium

First-author's address： Department of Intensive Medical Unit， Hainan General Hospital （Hainan Affiliated Hospital of Hainan Medical University）， Haikou 570311， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2024.33.041

膿毒癥已成為臨床上常見的危重癥疾病，是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的主要原因之一。流行病學(xué)研究顯示，目前全球膿毒癥患者病死率仍處于較高的水平，約為20%[1]。隨著對膿毒癥的研究和深入了解，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，膿毒癥是宿主對感染反應(yīng)失調(diào)而出現(xiàn)的危及生命的多器官功能障礙[2]，常繼發(fā)于全身各部位的感染、嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷等，嚴(yán)重時可進(jìn)展為膿毒癥休克，具有較高的病死率[3]。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今仍未明確，可能是在致病因素的作用下導(dǎo)致宿主體內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)級聯(lián)風(fēng)暴，誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷、免疫細(xì)胞凋亡和功能障礙等，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)多個器官、系統(tǒng)的功能衰竭甚至死亡。

心臟是膿毒癥發(fā)生時容易累及的靶器官之一，有40%～60%的膿毒癥患者在膿毒癥基礎(chǔ)上合并心功能障礙[4]，稱為膿毒癥心肌?。╯epsis-induced cardiomyopathy，SIC），其是在感染基礎(chǔ)上出現(xiàn)的心臟收縮和/或舒張功能障礙，表現(xiàn)為左右心室舒張和/或收縮功能障礙、左心室射血分?jǐn)?shù)下降，為可逆性的心肌抑制性損傷[5]。SIC的發(fā)生加速了心血管系統(tǒng)的功能障礙，加重各器官的灌注不足和功能衰竭，導(dǎo)致膿毒癥患者的死亡率明顯升高，影響著膿毒癥患者的生存和預(yù)后，亦是亟待解決的重要社會公共衛(wèi)生問題[6]。目前對于該疾病的治療主要是藥物干預(yù)和各器官功能支持，包括使用增強心肌收縮力藥物、有創(chuàng)或無創(chuàng)呼吸機(jī)支持及連續(xù)性血液濾過等，但是治療效果、患者的疾病結(jié)局和預(yù)后并不樂觀[7]。SIC的病理生理機(jī)制復(fù)雜多樣，仍處于探索的階段。目前研究表明，SIC可能是線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等多種因素共同作用下發(fā)生的結(jié)果[8]。中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、增加血管通透性，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的發(fā)生。西維來司他鈉作為該酶的抑制劑，是否可以通過抑制某些炎癥因子、減少心肌細(xì)胞的損害，降低SIC的發(fā)生率，少有文獻(xiàn)報道。本研究觀察西維來司他鈉對LPS誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，探索可能的機(jī)制，以期能夠?qū)ふ业絊IC有效的預(yù)防和治療措施。

1 材料與方法

1.1 材料

研究時間為2021年7月—2022年2月。大鼠H9c2心肌細(xì)胞（武漢普諾賽公司），H9c2（2-1）細(xì)胞專用培養(yǎng)基（武漢普諾賽公司，CM-0089），注射用西維來司他鈉（生產(chǎn)廠家：蘇州二葉制藥有限公司，上海匯倫江蘇藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20203093，規(guī)格：0.1 g）。ELISA試劑盒：白介素-6（IL-6，聯(lián)科生物，EK306/3-96）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，聯(lián)科生物，EK382/3-96）、白介素-1β（IL-1β，聯(lián)科生物，EK301B/4-96）；丙二醛測定試劑盒（MDA，南京建成生物工程研究所，A003-1-2，TBA法）、乳酸脫氫酶測定試劑盒（LDH，南京建成生物工程研究所，A020-2-2，微板法）、超氧化物歧化酶測定試劑盒（SOD，南京建成生物工程研究所，A001-3-2，WST-1法）。本研究經(jīng)海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 將大鼠H9c2心肌細(xì)胞在H9c2（2-1）細(xì)胞專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)基1次，每日在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長情況。待細(xì)胞生長密度達(dá)到傳代要求后，給予0.25%胰蛋白酶消化，取消化完成的細(xì)胞進(jìn)行離心，離心后將細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)基中。

1.2.2 心肌細(xì)胞分組 將傳代后正常生長的大鼠H9c2心肌細(xì)胞接種在96孔板上，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105個/mL，分為5組：對照組、LPS組、西維來司他鈉+LPS組，其中西維來司他鈉+LPS組分為高濃度組（LPS+high，10 μg/mL）、中濃度組（LPS+medium， 4.8 μg/mL）和低濃度組（LPS+low，1.6 μg/mL）。每組細(xì)胞分為5個孔。西維來司他鈉+LPS組細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，先給予西維來司他鈉溶液預(yù)處理2 h，然后用1.0 μg/mL LPS分別刺激誘導(dǎo)6 h。

1.2.3 生物學(xué)指標(biāo)檢測 LPS誘導(dǎo)6 h后（對照組無誘導(dǎo)）收集各組的心肌細(xì)胞上清液，離心后保存。檢測各組心肌細(xì)胞上清液中的IL-6、TNF-α、IL-1β、MDA、LDH、SOD濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 西維來司他鈉對心肌細(xì)胞炎癥因子的影響

與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組、高濃度組的炎癥因子水平均明顯升高（Plt;0.05）；與LPS組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組炎癥因子水平逐漸下降（Plt;0.05）。見表1。

2.2 西維來司他鈉對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組、高濃度組的LDH水平均顯著升高，SOD均下降（Plt;0.05）；與對照組比較，LPS組及低濃度組、中濃度組的MDA水平均顯著升高（Plt;0.05）；與LPS組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組的MDA和LDH逐漸下降，SOD均逐漸升高（Plt;0.05）。見表2。

3 討論

隨著全球醫(yī)療技術(shù)水平的快速發(fā)展，目前膿毒癥的治療措施和臨床治療效果已得到顯著改善，但是膿毒癥的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，且對該病的認(rèn)知仍然存有一定的局限。全球每年仍有數(shù)百萬新增膿毒癥患者，其中1/4以上的患者出現(xiàn)死亡，說明膿毒癥是導(dǎo)致普通人群死亡和重大疾病發(fā)生的主要原因[9-10]。對于有糖尿病、慢性腎臟病、免疫性疾病等慢性疾病的患者，膿毒癥造成的不良后果可能是致命性的。膿毒癥主要是在感染的誘導(dǎo)下導(dǎo)致宿主體內(nèi)出現(xiàn)多種細(xì)胞因子和炎癥因子的釋放[11]，包括大量的活性氧類物質(zhì)、促炎癥介質(zhì)、腫瘤壞死因子等[12]，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙、免疫功能異常、氧化應(yīng)激損傷，從而出現(xiàn)多個器官或系統(tǒng)的功能障礙或衰竭[13]。膿毒癥與心肌損傷的發(fā)生密切相關(guān)，并發(fā)SIC的患者，死亡率明顯增加[14]。在膿毒癥基礎(chǔ)上引發(fā)的心功能障礙是可逆的病理過程[15]。有研究表明，線粒體損傷、功能缺陷導(dǎo)致的氧化應(yīng)激增加是造成心肌損傷的重要原因之一[16]。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞能量代謝異常是SIC發(fā)生的起始環(huán)節(jié)，包括心肌脂類和糖類代謝異常、線粒體損傷等[17]。SIC的主要臨床表現(xiàn)是心功能障礙，往往會出現(xiàn)心輸出量下降，甚至休克[18]，進(jìn)一步導(dǎo)致全身各組織器官供血供氧不足，并且對液體復(fù)蘇和兒茶酚胺類藥物的反應(yīng)明顯下降[19]。

氧化應(yīng)激反應(yīng)主要是由于體內(nèi)活性氧（ROS）和活性氮（RNS）產(chǎn)生過多，引起氧化與抗氧化作用的失衡。在過氧化起主導(dǎo)作用的情況下，機(jī)體會出現(xiàn)免疫細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡，引發(fā)多器官功能的損傷[20]。ROS主要包括了O2-、OH-和H2O2等自由基。心肌細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的ROS過量可抑制氧化磷酸化，使ATP生成減少，心肌細(xì)胞能量代謝異常，出現(xiàn)心肌抑制[21]。另外，氧化應(yīng)激還可以通過ROS依賴的通路激活細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致凋亡蛋白出現(xiàn)級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡[22-23]，導(dǎo)致心功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，在采用盲腸穿孔法制作小鼠膿毒癥模型時，氧化應(yīng)激引起的脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致心肌細(xì)胞肌膜和肌層損傷[24]。此外，在膿毒癥發(fā)生時，ROS使心肌細(xì)胞線粒體膜通透性發(fā)生改變而引起心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能障礙[25]。內(nèi)毒素LPS是常見的介導(dǎo)炎癥的因子，在LPS的誘導(dǎo)下可使細(xì)胞出現(xiàn)炎癥損傷從而出現(xiàn)氧化和抗氧化反應(yīng)的失衡，可以模擬動物體內(nèi)炎癥反應(yīng)機(jī)制，具有良好的效果[26]。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞，可觀察到IL-6、TNF-α、IL-1β水平均明顯升高，但是在經(jīng)過西維來司他鈉進(jìn)行干預(yù)處理后，血清中的炎癥因子水平呈逐步下降的趨勢，與藥物劑量呈正相關(guān)。說明西維來司他鈉可以降低LPS誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷后炎癥因子的分泌，降低心肌細(xì)胞損傷，對心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。而在LPS的刺激下，心肌細(xì)胞產(chǎn)生的MDA和LDH均明顯升高，SOD均下降，說明在炎癥因子的刺激下細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)氧化和抗氧化反應(yīng)的失衡。在給予西維來司他鈉處理后，抗氧化因子SOD水平均明顯升高，氧化因子水平均下降，提示西維來司他鈉可以通過減少氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕炎癥損傷從而達(dá)到保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。但本研究存在一定的局限性，后期研究我們將通過結(jié)合臨床和動物體內(nèi)實驗進(jìn)一步探討西維來司他鈉對心肌細(xì)胞炎癥損傷的保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，以期尋找出相關(guān)的靶基因位點，為疾病的治療提供更多的理論依據(jù)。

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（收稿日期：2024-04-02） （本文編輯：陳韻）