非洲豬瘟病毒p30蛋白氨基酸序列分段表達(dá)及反應(yīng)原性分析

收稿日期：2023-12-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFD1800601）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31941013）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（21）3137）]；河北省省級(jí)科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（21322401D）；蘇北科技專(zhuān)項(xiàng)（SZ-LYG202109）

作者簡(jiǎn)介：周俊明（1983-），男，江蘇東臺(tái)人，碩士，副研究員，主要從事動(dòng)物傳染病防治和診斷技術(shù)研究。（Tel） 025-84390988；（E-mail） zhoujm075@163.com

通訊作者：李 彬，（E-mail） libinana@126.com

摘要： 為比較非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）p30蛋白氨基酸序列中不同片段的反應(yīng)原性，探究p30蛋白氨基酸序列中可能的抗原優(yōu)勢(shì)片段。本研究通過(guò)PCR、克隆技術(shù)將p30蛋白氨基酸序列中不同片段的編碼基因分別插入表達(dá)質(zhì)粒pET32a，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、Ni柱純化、透析后，獲得p30蛋白氨基酸序列中8～101 aa片段（P-1#）、58～101 aa片段（P-2#）、101～158 aa片段（P-3#）、8～194 aa片段（P-4#），用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分析p30蛋白氨基酸序列中不同片段與p30蛋白免疫兔血清和ASFV陽(yáng)性豬血清的反應(yīng)原性。結(jié)果顯示，上述片段均獲得誘導(dǎo)表達(dá)及純化，表達(dá)形式有可溶性表達(dá)（P-1#、P-3#）和包涵體表達(dá)（P-2#、P-4#）。各片段以1.0 mg/L包被時(shí)，p30免疫兔血清與p30蛋白氨基酸序列中4種片段均能發(fā)生免疫反應(yīng)，ASFV陽(yáng)性豬血清與P-4#、P-1#反應(yīng)較佳，與P-3#反應(yīng)中等，與P-2#反應(yīng)最弱。綜上，p30蛋白氨基酸序列中不同片段反應(yīng)原性的差異為認(rèn)識(shí)p30抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)域提供了數(shù)據(jù)，這將有助于非洲豬瘟血清學(xué)診斷抗原的科學(xué)篩選。

關(guān)鍵詞： 非洲豬瘟病毒；p30蛋白；氨基酸序列片段；反應(yīng)原性

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.65"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-4440（2024）10-1875-07

Expression and reactogenicity analysis of the truncated amino acid sequence of p30 protein in African swine fever virus

ZHOU Junming， NI Yanxiu， FAN Baochao， ZHU Haodan， ZHU Xuejiao， WANG Dandan， HU Yiyi， LI Bin

（Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014， China）

Abstract： The purpose of this study was to compare the reactogenicity of different fragments of the p30 protein amino acid sequence of African swine fever virus （ASFV）， and to explore the possible antigen-dominant fragments in the p30 protein amino acid sequence. In this study， the coding genes of different fragments of p30 amino acid sequence were inserted into the expression plasmid pET32a by PCR and cloning techniques. After IPTG induction， Ni column purification and dialysis， 8-101 aa fragment （P-1#）， 58-101 aa fragment （P-2#）， 101-158 aa fragment （P-3#） and 8-194 aa fragment （P-4#） in the amino acid sequence of p30 protein were obtained. The reactogenicity of different fragments of p30 protein amino acid sequence with p30 protein immunized rabbit serum and ASFV positive pig serum was analyzed by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The results showed that the above fragments were induced and purified. The expression forms were soluble expression （P-1#， P-3#） and inclusion body expression （P-2#， P-4#）. When each fragment was coated at 1.0 mg/L， the p30 immunized rabbit serum and the four fragments in the amino acid sequence of p30 protein could react with each other. The reaction of ASFV-positive pig serum with P-4# and P-1# was better， with P-3# was moderate， and with P-2# was the weakest. In summary， the differences in the reactogenicity of different fragments in the amino acid sequence of p30 protein provide data for understanding the dominant fragments of p30 antigen， which will help the scientific screening of serological diagnostic antigens of African swine fever.

Key words： African swine fever virus;p30 protein;amino acid sequence fragment;reactogenicity

非洲豬瘟（Afircan swine fever， ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的一種高度致死性傳染病，可感染不同日齡和品種的家豬和野豬^[1]，臨床表現(xiàn)急性出血熱、皮膚斑點(diǎn)，剖檢有淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官出血等癥狀^[2]。ASF被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，2018年8月，首次報(bào)道了非洲豬瘟病毒基因Ⅱ型毒株傳入中國(guó)，在短短6個(gè)月內(nèi)，高致死率的急性非洲豬瘟在中國(guó)大多數(shù)省份迅速傳播，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失^[3]；2020年報(bào)道非洲豬瘟病毒出現(xiàn)了低毒力基因Ⅱ型毒株^[4]；2021年出現(xiàn)非洲豬瘟基因Ⅰ型毒株，該毒株可引起豬慢性感染^[5]，上述低致病力毒株的出現(xiàn)給非洲豬瘟的防控帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。

國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)將ASFV歸為非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，ASFV含有雙層囊膜，基因組全長(zhǎng)170～193 kb，包含151～167個(gè)基因^[6]，基因組中間區(qū)域較為保守，不同ASFV毒株之間的基因組差異主要來(lái)源于基因組末端多基因家族的不同^[7]。有研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了35種ASFV結(jié)構(gòu)蛋白，并利用ASFV陽(yáng)性豬血清評(píng)估這些蛋白的抗原性，結(jié)果顯示，感染ASFV后p30蛋白誘發(fā)的免疫反應(yīng)早且明顯^[7]。p30定位于ASFV囊膜的內(nèi)膜，由基因CP204L編碼，主要參與了ASFV與靶細(xì)胞結(jié)合以及內(nèi)化^[8-9]，目前已有較多研究利用p30單克隆抗體解析p30的抗原信息，以及表達(dá)p30全長(zhǎng)蛋白建立ASFV抗體檢測(cè)方法，但大部分原核表達(dá)獲得的p30蛋白是以包涵體形式存在的。本研究擬開(kāi)展p30蛋白氨基酸序列不同片段的原核表達(dá)，并分析p30蛋白不同區(qū)域的表達(dá)形式以及免疫反應(yīng)特性，進(jìn)一步豐富對(duì)p30抗原特性的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 載體、重組菌、蛋白和血清

p30重組表達(dá)質(zhì)粒 pET28a-p30（1～194位氨基酸）、表達(dá)載體pET-32a（+）、硫氧還蛋白（TRX）、pET32a-p30（8～101位氨基酸）重組菌、pET28a-p30純化重組蛋白均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存^[10]；非洲豬瘟陽(yáng)性豬血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑

PrimeSTARMax DNA Polymerase、限制性核酸內(nèi)切酶Bam HⅠ和SalⅠ、DNA Ligation Kit均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；羊抗兔IgG-HRP、硫酸卡那霉素溶液、10×PBS緩沖液、溶菌酶、Tween 20購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；HisTrap HP預(yù)裝柱購(gòu)自Cytiva公司；HRP標(biāo)記羊抗豬IgG（H+L）購(gòu)自Bethyl公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；IPTG溶液、即用型氨芐青霉素鈉溶液均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自GeneDireX公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.3 兔p30多克隆抗體的制備

取適量純化的pET28a-p30重組蛋白與弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑分別進(jìn)行乳化，蛋白質(zhì)與佐劑體積比為1∶1，乳化后p30蛋白質(zhì)量濃度為1 g/L。取3只體重3 kg的普通級(jí)新西蘭兔（購(gòu)自南京市青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)），分別皮下分點(diǎn)注射1 mL經(jīng)弗氏完全佐劑乳化的p30蛋白，首次免疫后14 d和28 d，分別取經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化的p30蛋白，同上進(jìn)行皮下免疫。首次免疫前7 d和末次免疫后7 d，分別采集兔血，分離出血清，分裝后在-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 編碼p30蛋白不同區(qū)域基因序列的克隆、轉(zhuǎn)化

按重組質(zhì)粒pET28a-p30中p30優(yōu)化編碼基因序列，設(shè)計(jì)系列引物，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增p30蛋白58～101位、101～158位、8～194位氨基酸序列的編碼基因序列，擴(kuò)增引物序列見(jiàn)表1；隨后將各PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行膠回收，利用限制性核酸內(nèi)切酶Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切回收PCR片段，分別以連接酶連接表達(dá)載體pET-32a（+），連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)BL21（DE3），經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定陽(yáng)性重組菌，送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將實(shí)驗(yàn)室保存的pET32a-p30（8～101）重組菌以及新構(gòu)建的表達(dá)p30蛋白不同氨基酸序列片段的重組菌pET32-p30（58～101）、pET32-p30（101～158）、pET32-p30（8～194）分別命名為1#、2#、3#、4#。

1.5 蛋白質(zhì)表達(dá)及純化

將4種重組菌進(jìn)行體外擴(kuò)大培養(yǎng)，按1%的比例接種至200 mL的LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L氨芐青霉素鈉）中，37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)菌液OD600值達(dá)到0.5左右時(shí)，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，37 ℃，220 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，10 000 r/min離心收集菌體，加入10 mL 1×PBS重懸菌體，再加入終濃度為0.2 g/L的溶菌酶，混勻后冰上孵育30 min，以300 W，5 s超聲，10 s間歇的條件，超聲波破碎上述細(xì)菌混懸液，10 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和沉淀，沉淀以變性緩沖液（8 mol/L尿素、20 mmol/L磷酸二氫鈉、500 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L咪唑、pH 7.4）溶解，10 000 r/min離心15 min，收集上清液（包涵體蛋白）。收集誘導(dǎo)前菌體蛋白、誘導(dǎo)后菌體超聲上清液、誘導(dǎo)后菌體超聲沉淀樣品各16 μL，加入4 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液混勻，沸水浴10 min，處理后樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），分析不同重組蛋白的表達(dá)形式。收集PBS重懸的各誘導(dǎo)后的菌體，同上處理樣品并進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)（Western blot），分析各重組菌誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與His單抗的反應(yīng)原性。隨后參照HiTrap HP親和層析柱說(shuō)明書(shū)，純化4種重組蛋白，以1×PBS作為緩沖液透析處理純化蛋白質(zhì)，隨后NanoDrop分析蛋白質(zhì)含量，調(diào)整含量后取適量重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.6 ELISA

以包被液（100 mmol/L NaHCO3、46 mmol/L Na2CO3、pH 9.6）將各純化的重組蛋白及硫氧還蛋白分別稀釋至1.0 mg/L和0.1 mg/L，每孔100 μL，分別加入96微孔板中，4 ℃包被過(guò)夜；棄去抗原液，用PBST（1×PBS，含0.05% Tween 20）洗滌5次，每孔300 μL，每次10 s，加入PBST（含5%脫脂奶粉）封閉，每孔300 μL，37 ℃孵育2 h；棄去孵育液，同上洗滌，用PBST（含2%脫脂奶粉）分別稀釋p30免疫兔血清或非洲豬瘟陽(yáng)性豬血清（按體積比1∶40、1∶80、1∶160、1∶320稀釋?zhuān)?，同時(shí)設(shè)立40倍稀釋的兔免疫p30前血清或ASFV抗體陰性豬血清分別作為陰性對(duì)照，每孔100 μL，加入96微孔板，37 ℃孵育30 min，棄去血清，同上洗滌，加入1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔二抗或HRP標(biāo)記羊抗豬二抗，每孔100 μL，在37 ℃條件下作用30 min，棄去二抗，同上洗滌，每孔加入50 μL單組分TMB顯色液，37 ℃避光作用10 min，最后加入2 mol/L H2SO4，每孔50 μL，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀OD450值，計(jì)算樣品OD450 （S-N）值[樣品OD450（S-N）值=樣品OD450-陰性血清OD450]。試驗(yàn)重復(fù)2次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒鑒定

提取重組菌1#、2#、3#、4#重組質(zhì)粒，經(jīng)Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳顯示，均獲得約5 900 bp的pET32a載體片段，同時(shí)分別產(chǎn)生282 bp、132 bp、174 bp和561 bp的插入片段，與預(yù)期目的片段長(zhǎng)度相符，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)測(cè)序，各載體中插入堿基序列編碼的多肽氨基酸序列均包含有Pig/HLJ/2018毒株的CP204L蛋白氨基酸序列（GenBank QBH90581.1）。

2.2 重組蛋白氨基酸序列片段誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，pET32a-p30（8～101）、pET32-p30 （58～101）、pET32-p30 （101～158）、pET32-p30 （8～194）分別表達(dá)獲得相對(duì)分子量32 000、25 000、33 000、50 000的重組蛋白氨基酸序列片段，分別命名為P-1#、P-2#、P-3#、P-4#，SDS-PAGE分析顯示，P-1#和P-3#表達(dá)在誘導(dǎo)細(xì)菌超聲波破碎的上清液中，P-4#表達(dá)在包涵體中，P-2#表達(dá)在上清液和包涵體中，但以表達(dá)在包涵體中為主（圖2A）。誘導(dǎo)后的4種重組菌，與His單克隆抗體均有對(duì)應(yīng)的特異性反應(yīng)條帶（圖2B）。

2.3 重組蛋白氨基酸序列片段純化

分別將表達(dá)在上清液中的P-1#和P-3#和表達(dá)在包涵體中的P-2#和P-4#進(jìn)行Ni柱純化，SDS-PAGE顯示，獲得4種純化的p30重組蛋白氨基酸序列片段，各相對(duì)分子量符合預(yù)期（圖3）。

2.4 p30蛋白氨基酸序列不同片段的反應(yīng)原性

將純化、透析后的4種重組蛋白氨基酸序列片段分別稀釋至1.0 mg/L和0.1 mg/L進(jìn)行包被，與不同稀釋濃度下的ASFV陽(yáng)性豬血清或p30免疫兔血清進(jìn)行ELISA反應(yīng)，結(jié)果顯示2種蛋白質(zhì)濃度包被下P-1#和P-4#，與40倍稀釋ASFV陽(yáng)性豬血清均有較好的免疫反應(yīng)，隨著血清稀釋度增加，其ELISA反應(yīng)OD450（S-N）值均顯示出下降趨勢(shì)；2種蛋白質(zhì)濃度包被的P-2#，與40倍稀釋的ASFV陽(yáng)性豬血清ELISA反應(yīng)OD450（S-N）值均較低，提示P-2#的抗原較弱。

由圖4可見(jiàn)，4種重組蛋白氨基酸序列片段以1.0 mg/L進(jìn)行包被，與系列稀釋的p30免疫兔血清均有較好的免疫反應(yīng)，隨著血清稀釋度增加，P-2#和P-3#的ELISA反應(yīng)OD450（S-N）值略有下降；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)包被濃度為0.1 mg/L時(shí)，P-2#與p30免疫兔血清反應(yīng)最弱，隨著血清稀釋度增加，P-3#的ELISA反應(yīng)OD450（S-N）值顯示出下降趨勢(shì)，而P-1#和P-4#與系列稀釋的p30免疫兔血清均保持較好的免疫反應(yīng)，由此可見(jiàn)P-2#和P-3#誘導(dǎo)的兔多抗效價(jià)弱于P-1#和P-4#，硫氧還蛋白（Trx）與ASFV陽(yáng)性豬血清和p30免疫兔血清均無(wú)反應(yīng)。

3 討論

非洲豬瘟是一種高傳染性動(dòng)物疫病，家豬感染后死亡率最高可達(dá)100%，20世紀(jì)90年代末，其流行僅限于非洲大陸和歐洲部分地區(qū)，2007年高加索地區(qū)出現(xiàn)非洲豬瘟疫情，加速了其在歐洲和亞洲的流行^[11-12]，現(xiàn)今ASFV基因Ⅱ毒株已經(jīng)傳至世界各大洲^[13]。目前，由于尚未有成熟的非洲豬瘟疫苗，對(duì)于該病的防控依賴于主動(dòng)監(jiān)測(cè)，ASFV可編碼接近200種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中結(jié)構(gòu)蛋白p30分布于病毒囊膜的內(nèi)膜，是ASFV主要的免疫原性蛋白之一，p30和p54的嵌合蛋白可產(chǎn)生中和性抗體^[14]，p30抗體對(duì)病毒內(nèi)化有一定的抑制作用^[15]，因此較多診斷試劑和亞單位疫苗的研制均將p30蛋白列為重要的研究靶標(biāo)。

通常以單克隆抗體來(lái)獲取p30蛋白抗原信息，目前已制備出多株p30單克隆抗體，同時(shí)對(duì)p30蛋白的表位有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)^[16-17]。本研究通過(guò)對(duì)p30蛋白氨基酸序列進(jìn)行分片段原核表達(dá)，直接分析ASFV陽(yáng)性豬血清和p30免疫兔血清與不同p30蛋白氨基酸序列片段的反應(yīng)原性，結(jié)果顯示P-2#與p30免疫兔血清有免疫反應(yīng)，但與ASFV陽(yáng)性豬血清反應(yīng)較弱，表明p30蛋白氨基酸序列中第58～101位片段的反應(yīng)原性弱，而該片段內(nèi)已被證實(shí)含有p30單克隆抗體識(shí)別的抗原表位（61～93 aa）^[18]。有研究以甲病毒表達(dá)的關(guān)聯(lián)片段（61～110 aa）2次免疫10頭豬，不能有效激活抗體產(chǎn)生（轉(zhuǎn)陽(yáng)比例1/10），以ASFV弱毒株OURT88/3繼續(xù)攻毒后，才激活了抗體產(chǎn)生（轉(zhuǎn)陽(yáng)比例9/10）^[19]。綜上，該片段存在的抗原表位（61～93 aa）可能不是p30的優(yōu)勢(shì)抗原表位，其抗體的產(chǎn)生需要該片段抗原的多次刺激。此外，甲病毒表達(dá)的p30的不同氨基酸片段，發(fā)現(xiàn)p30（1～100 aa）與ASFV弱毒株OURT88/3感染血清的反應(yīng)原性最弱，同時(shí)推測(cè)p30蛋白的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)域集中在101～150 aa^[19]，而本研究以大腸桿菌原核表達(dá)p30蛋白不同氨基酸片段，發(fā)現(xiàn)P-1#（8～101 aa）與ASFV陽(yáng)性豬血清的反應(yīng)原性高于P-3#（101～158 aa），上述結(jié)果差異是否與蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)差異或者血清來(lái)源差異有關(guān)，值得后續(xù)進(jìn)一步研究。

原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)p30全長(zhǎng)蛋白，用于建立ASFV抗體檢測(cè)方法已見(jiàn)多次報(bào)道^[20-21]，但多數(shù)獲得的蛋白質(zhì)是以包涵體形式表達(dá)，盡管通過(guò)蛋白質(zhì)復(fù)性可恢復(fù)部分活性，但復(fù)性效率較低。本研究通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了p30蛋白氨基酸序列系列片段，其中P-1#（8～101 aa）和P-3#（101～158 aa）均是可溶性表達(dá)，同時(shí)P-1#（8～101 aa）能夠與ASFV陽(yáng)性豬血清和p30免疫兔血清有較好的反應(yīng)原性，僅次于包涵體表達(dá)的P-4#（8～194 aa），結(jié)果表明P-1#（8～101 aa）可用于后續(xù)ASFV診斷候選靶抗原。此外，研制非洲豬瘟診斷試劑時(shí)，由于制備ASFV感染或免疫陽(yáng)性豬血清有條件限制，常以蛋白質(zhì)免疫豬或其他種屬動(dòng)物制備陽(yáng)性血清替代，本研究中1.0 mg/L包被的P-2#與ASFV陽(yáng)性豬血清反應(yīng)較弱，但與p30免疫兔血清有較明顯的免疫反應(yīng)，表示經(jīng)過(guò)抗原的多次免疫刺激可能存在較弱抗原性區(qū)域反應(yīng)性提升的現(xiàn)象，因此建議篩選診斷優(yōu)勢(shì)抗原和優(yōu)化診斷方法時(shí)，應(yīng)慎重選用多次免疫血清去評(píng)價(jià)。

4 結(jié)論

本研究分析了非洲豬瘟病毒p30蛋白不同氨基酸序列片段反應(yīng)原性，發(fā)現(xiàn)p30蛋白的8～101 aa氨基酸序列片段可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，同時(shí)該氨基酸序列為p30潛在抗原優(yōu)勢(shì)區(qū)域。

參考文獻(xiàn)：

[1] BLOME S， GABRIEL C， BEER M. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar[J]. Virus Research，2013，173（1）：122-130.

[2] SHI Z G， CAO L Y， LUO J C， et al. A chemiluminescent magnetic microparticle immunoassay for the detection of antibody against African swine fever virus[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2023，107（11）：3779-3788.

[3] WU K， LIU J， WANG L， et al. Current state of global African swine fever vaccine development under the prevalence and transmission of ASF in China[J]. Vaccines（Basel），2020，8（3）：531.

[4] SUN E C， ZHANG Z J， WANG Z L， et al. Emergence and prevalence of naturally occurring lower virulent African swine fever viruses in domestic pigs in China in 2020[J]. Science China Life Sciences，2021，64（5）：752-765.

[5] SUN E C， HUANG L Y， ZHANG X F， et al. Genotype I African swine fever viruses emerged in domestic pigs in China and caused chronic infection[J]. Emerg Microbes Infect，2021，10（1）：2183-2193.

[6] JIA N， OU Y W， PEJSAK Z， et al. Roles of African swine fever virus structural proteins in viral infection[J]. Journal of Veterinary Research，2017，61（2）：135-143.

[7] XU Z Y， HU Y F， LI J B， et al. Screening and identification of the dominant antigens of the African swine fever virus[J]. Frontiers in Veterinary Science，2023，10：1175701.

[8] GMEZ-PUERTAS P， RODRGUEZ F， OVIEDO J M， et al. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response[J]. Virology，1998，243（2）：461-471.

[9] HBNER A， PETERSEN B， KEIL G M， et al. Efficient inhibition of African swine fever virus replication by CRISPR/Cas9 targeting of the viral p30 gene （CP204L）[J]. Scientific Report，2018，8（1）：1449.

[10]ZHOU J M， NI Y X， WANG D D， et al. Development of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay targeting the-p30 protein for detection of antibodies against African swine fever virus[J]. Viruses，2023，15（1）：154.

[11]DANZETTA M L， MARENZONI M L， IANNETTI S， et al. African swine fever：lessons to learn from past eradication experiences. A systematic review[J]. Frontiers in Veterinary Science，2020，7：296.

[12]JURADO C， FERNNDEZ-CARRIN E， MUR L， et al. Why is African swine fever still present in Sardinia？[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2018，65（2）：557-566.

[13]LIBERTI R， COLABELLA C， ANZALONE L， et al. Expression of a recombinant ASFV p30 protein and production of monoclonal antibodies[J]. Open Veterinary Journal，2023，13（3）：358-364.

[14]BARDERAS M G， RODRGUEZ F， GMEZ-PUERTAS P， et al. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins[J]. Archives of Virology，2001，146（9）：1681-1691.

[15]NEILAN J G， ZSAK L， LU Z， et al. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30，p54，and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection[J]. Virology，2004，319（2）：337-342.

[16]ZHOU G J， SHI Z W， LUO J C， et al. Preparation and epitope mapping of monoclonal antibodies against African swine fever virus P30 protein[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2022，106（3）：1199-1210.

[17]馬天天，張亞楠，馮亞文，等. 非洲豬瘟病毒p30蛋白單克隆抗體的制備與鑒定[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2023，50（7）：2832-2842.

[18]PETROVAN V， YUAN F F， LI Y H， et al. Development and characterization of monoclonal antibodies against p30 protein of African swine fever virus[J]. Virus Research，2019，269：197632.

[19]MURGIA M V， MOGLER M， CERTOMA A， et al. Evaluation of an African swine fever （ASF） vaccine strategy incorporating priming with an alphavirus-expressed antigen followed by boosting with attenuated ASF virus[J]. Archives of Virology，2019，164（2）：359-370.

[20]張文燕，陳立功，騰召劍，等. 基于非洲豬瘟病毒p30蛋白的間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2022，42（7）：1320-1326.

[21]JIN J X， BAI Y L， ZHANG Y Y， et al. Establishment and characterization of a novel indirect ELISA method based on ASFV antigenic epitope-associated recombinant protein[J]. International Joural of Biological Macromolecules，2023，253（Pt7）：127311.

（責(zé)任編輯：黃克玲）