南通市蠶豆赤斑病病原菌鑒定及其抑菌藥劑篩選

收稿日期：2024-01-15

基金項(xiàng)目：江蘇省種業(yè)揭榜掛帥項(xiàng)目[JBGS（2021）058]；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目[JATS（2023）158]；江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所青年科技基金項(xiàng)目[YJ（2022）009]

作者簡(jiǎn)介：王 凡（1989-），女，江蘇南通人，博士，助理研究員，主要從事蠶豆抗病育種研究。（E-mail）2320951333@qq.com

通訊作者：吳春芳，（E-mail）jsyias@163.com

摘要： 為明確江蘇省南通市蠶豆赤斑病的病原菌種類(lèi)，對(duì)致病菌進(jìn)行分離純化，并結(jié)合致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察和多基因堿基序列分析對(duì)疑似病原菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，南通市蠶豆赤斑病病原菌為擬蠶豆葡萄孢（Botrytis fabiopsis）。生物學(xué)特性分析結(jié)果表明，該病原菌菌絲的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最適光照條件為12 h光照+12 h黑暗，對(duì)pH不敏感，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨，最適培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基。抑菌藥劑篩選結(jié)果表明，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)病原菌的抑制效果最好，半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）分別為0.005 4 mg/L和0.755 4 mg/L，而10.0%多抗霉素可濕性粉劑和80.0%波爾多液可濕性粉劑對(duì)病原菌幾乎無(wú)抑制效果。本研究結(jié)果可為江蘇省南通市蠶豆赤斑病的科學(xué)防治提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 蠶豆；赤斑??；病原鑒定；生物學(xué)特性；抑菌藥劑

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.43"" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A"" 文章編號(hào)： 1000-4440（2024）10-1810-08

Identification and screening of antifungal agents for the pathogen causing broad bean chocolate spot in Nantong City

WANG Fan， BIAN Xiaochun， LIU Chenwei， XU Renchao， LU Hongchen， WU Chunfang

（Jiangsu Yanjiang Institute of Agricultural Sciences， Nantong 226012， China）

Abstract： To clarify the pathogen causing broad bean chocolate spot in Nantong City， Jiangsu province， the pathogen was isolated and purified， and the suspected pathogen was identified through pathogenicity testing， morphological observation， and multi-gene base sequence analysis. The results indicated that the pathogen of broad bean chocolate spot in Nantong City was Botrytis fabiopsis. The results of biological characteristics analysis showed that the optimal growth temperature for the pathogen was 25 ℃， and the optimal light condition was 12 h light + 12 h dark. The pathogen was insensitive to pH. The optimal carbon source for the pathogen was glucose， the optimal nitrogen sources were yeast extract， beef extract， and ammonium sulfate， and the optimal culture medium was potato dextrose agar （PDA） medium. The screening results of antifungal agents indicated that 2.0% sophocarpidine aqueous solution and 10.0% difenoconazole water dispersible granules had the best inhibitory effect on the pathogen， with median effective concentration （EC50） of 0.005 4 mg/L and 0.755 4 mg/L， respectively. However， 10.0% polyoxin wettable powder and 80.0% Bordeaux liquid wettable powder had almost no inhibitory effect on the pathogen. The research results can provide a theoretical basis for the scientific prevention and control of broad bean chocolate spot in Nantong City， Jiangsu province.

Key words： Vicia faba L.；chocolate spot；pathogen identification；biological characteristics；antifungal agents

蠶豆（Vicia faba L.）是重要的糧食、蔬菜、飼料和綠肥兼用豆科作物，適應(yīng)性廣，有較強(qiáng)的固氮能力^[1]。蠶豆?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高，蛋白質(zhì)含量極為豐富，富含人體必須氨基酸、維生素A、維生素B2和鈣、鐵、鋅等礦質(zhì)元素^[2]。真菌病害是限制蠶豆生產(chǎn)的主要因素，目前為止，蠶豆上常見(jiàn)的真菌病害有銹病、赤斑病、根腐病、枯萎病、褐斑病和葉斑病等^[3]，其中赤斑病是世界蠶豆產(chǎn)區(qū)的一種主要病害。赤斑病發(fā)生在蠶豆生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，最初葉子上出現(xiàn)紅褐色斑點(diǎn)，在適宜的條件下，病斑上產(chǎn)生大量的分生孢子，借助風(fēng)雨的傳播侵染蠶豆，在連續(xù)陰雨的天氣，病斑迅速擴(kuò)大，最終葉片變黑并脫落，嚴(yán)重時(shí)整株萎蔫死亡^[4]。

蠶豆赤斑病的病原菌主要為葡萄孢屬（Botrytis）真菌^[5-6]，目前被分離出來(lái)的主要有3種，分別為蠶豆葡萄孢（B. fabae）、灰葡萄孢（B. cinerea）和擬蠶豆葡萄孢（B. fabiopsis）^[7]。蠶豆葡萄孢被認(rèn)為是引起蠶豆赤斑病的主要病原菌，其致病性和危害大于灰葡萄孢，其主要寄主有蠶豆、草莓、三葉草等^[8-9]?；移咸焰叩募闹鞣秶顝V，能侵染200多種植物^[10]?；移咸焰呦驳蜏馗邼瘢渚昃哂胸S富的多樣性，菌絲生長(zhǎng)速度快。擬蠶豆葡萄孢是2010年在湖北省發(fā)現(xiàn)和命名的1個(gè)新種，其對(duì)蠶豆的危害程度與蠶豆葡萄孢相近，均比灰葡萄孢引起的病害程度嚴(yán)重^[11]。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，擬蠶豆葡萄孢的生長(zhǎng)速度與蠶豆葡萄孢相近，比灰葡萄孢慢，其產(chǎn)生的菌核為同心環(huán)狀，數(shù)量多于灰葡萄孢，少于蠶豆葡萄孢。近年來(lái)，在青海省又發(fā)現(xiàn)并命名了5種引起蠶豆赤斑病的病原菌，分別為歐美灰霉菌（B. euroamericana）、牡丹葡萄孢（B. paeoniae）、卡羅萊納葡萄孢（B. caroliniana）、桉樹(shù)灰霉菌（B. eucalypti）和核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）^[12]。

赤斑病的防治主要有3種方式，分別為使用藥劑處理、改變作物栽培模式和尋找抗病品種，目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的赤斑病防治主要還是采用藥劑處理的方式^[12]。藥劑防治分為生物防治和化學(xué)防治，在南通市如皋市，曾使用井岡·枯草芽孢桿菌進(jìn)行生物防治，但效果不如化學(xué)藥劑明顯，因此需要篩選出對(duì)赤斑病病原菌有明顯殺菌效果的化學(xué)藥劑。本研究擬以江蘇省南通市如皋市的發(fā)病蠶豆為研究對(duì)象，從病株上分離純化病原菌，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和多基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，明確病原菌的種類(lèi)，同時(shí)對(duì)病原菌進(jìn)行生物學(xué)特性分析及室內(nèi)藥劑的防治篩選，以期為當(dāng)?shù)匦Q豆赤斑病的有效防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品為2022年在南通市吳窯鎮(zhèn)鑫磊生態(tài)家庭農(nóng)場(chǎng)采集具有典型赤斑病發(fā)病特點(diǎn)的蠶豆葉片樣品，拍照后帶回實(shí)驗(yàn)室，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、察氏（CZ）培養(yǎng)基、燕麥瓊脂（OMA）培養(yǎng)基、水瓊脂（WA）培養(yǎng)基。

試劑及儀器：Simgen Plant DNA提取試劑盒購(gòu)自杭州新景生物試劑開(kāi)發(fā)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。TL3200B光學(xué)顯微鏡購(gòu)自南京澤洋生物科技有限公司；RTOP-310Y人工氣候箱購(gòu)自浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司。

供試化學(xué)藥劑：10.0%多抗霉素可濕性粉劑為陜西麥可羅生物科技有限公司產(chǎn)品，75.0%百菌清可濕性粉劑為利民化工股份有限公司產(chǎn)品，70.0%甲基硫菌靈可濕性粉劑為山東鄒平農(nóng)藥有限公司產(chǎn)品，80.0%波爾多液可濕性粉劑為美國(guó)仙農(nóng)有限公司產(chǎn)品，10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑為先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司產(chǎn)品，12.5%腈菌唑乳油為深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司產(chǎn)品，24.0%腈苯唑懸浮劑為美國(guó)陶氏益農(nóng)公司產(chǎn)品，3.0%甲霜口惡霉靈水劑為山東東合生物科技有限公司產(chǎn)品，2.0%苦參堿水劑為河北瑞寶德生物化學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蠶豆赤斑病病原菌的分離純化 采用組織分離法分離病原菌^[13-14]。將采集的蠶豆葉片樣品用清水沖洗并晾干，在病健交界處剪取5 mm×5 mm的組織。先用75%的酒精消毒45 s，然后用3%的NaClO溶液消毒35 s，再用無(wú)菌水清洗2～3次，轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙吸干水分后，接種于PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)基放置5個(gè)組織。25 ℃恒溫黑暗條件下培養(yǎng)約5 d，待組織周?chē)L(zhǎng)出菌落后，挑取菌落邊緣的菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。

1.2.2 蠶豆赤斑病病原菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：從純化的菌落邊緣用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌落的生長(zhǎng)速度、大小、顏色等特征。同時(shí)，用光學(xué)顯微鏡觀察其菌絲形態(tài)，菌株是否產(chǎn)生分生孢子和孢子梗，拍照記錄觀察結(jié)果，進(jìn)行形態(tài)學(xué)的鑒定^[15-16]。

分子生物學(xué)鑒定：從PDA培養(yǎng)基上挑取培養(yǎng)約7 d的菌絲，利用Simgen Plant DNA提取試劑盒提取病原菌的DNA。用rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）/ITS4（5′-TCCTC￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣T￣T￣G￣ATATGC-3′）和葡萄孢屬特異性引物G3PDH正向引物（￣5￣′￣-￣A￣T￣T￣G￣A￣C￣A￣T￣C￣G￣T￣C￣G￣C￣T￣G￣T￣C￣A￣ACGA-3′）/G3PDH反向引物（5′-ACCCCACTCGTTGTCGTACCA-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技股份有限公司測(cè)序，將獲得的堿基序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）中與葡萄孢相關(guān)的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（G3PDH）堿基序列進(jìn)行比對(duì)，下載葡萄孢屬內(nèi)各近緣種模式菌株和參考菌株的目的堿基序列，利用MEGA 11.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定病原菌的種類(lèi)^[17-19]。

1.2.3 蠶豆赤斑病病原菌的致病性測(cè)定 根據(jù)柯赫氏法則，采用活體葉片菌餅接種法進(jìn)行病原菌的致病性測(cè)定^[20]。選取6～7葉期第3～4葉位葉片，刺傷，用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種于刺傷葉片上，以接種PDA培養(yǎng)基的葉片作為對(duì)照，在人工氣候箱25 ℃黑暗培養(yǎng)，每隔24 h觀察并記錄葉片的發(fā)病情況，這期間噴水并用加濕器保濕。待接種葉片發(fā)病后，對(duì)接種病葉進(jìn)行病原菌的再次分離，比較分離出來(lái)的菌株與原菌株形態(tài)是否一致^[21]。

1.2.4 蠶豆赤斑病病原菌的生物學(xué)特性測(cè)定 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：將病原菌轉(zhuǎn)接在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng)5～7 d。用直徑9 mm的打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種至新的PDA培養(yǎng)基中央，分別在5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃條件下黑暗培養(yǎng)^[22]。5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種至PDA培養(yǎng)基上，將平板置于25 ℃人工氣候箱中培養(yǎng)。將3個(gè)人工氣候箱設(shè)置成3種光照條件，分別為24 h連續(xù)光照、12 h光照+12 h黑暗和24 h連續(xù)黑暗^[23]。5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：用1 mol/L的HCl溶液和1 mol/L的NaOH溶液將PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為5、6、7、8、9和10。用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，接種至不同pH的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)^[24]。5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

碳源、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，分別接種至碳源為蔗糖、葡萄糖、乳糖和麥芽糖的察氏培養(yǎng)基上，采用同樣的方法將菌餅分別接種至氮源為酵母膏、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨、甘氨酸和蛋白胨的察氏培養(yǎng)基上，以缺碳源和氮源的察氏培養(yǎng)基作為對(duì)照，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)^[25]。5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響：用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，分別接種至PDA、CZ、OMA和WA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)^[26]。5 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 蠶豆赤斑病抑菌藥劑的篩選 抑菌藥劑初篩：配制9種化學(xué)藥劑（10.0%多抗霉素可濕性粉劑、75.0%百菌清可濕性粉劑、70.0%甲基硫菌靈可濕性粉劑、80.0%波爾多液可濕性粉劑、10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、12.5%腈菌唑乳油、24.0%腈苯唑懸浮劑、3.0%甲霜口惡霉靈水劑、2.0%苦參堿水劑）母液，將藥劑與PDA培養(yǎng)基按體積比1∶9制成含藥PDA培養(yǎng)基，藥劑最終質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。用直徑9 mm的打孔器打取菌餅，分別接種至含不同農(nóng)藥的PDA培養(yǎng)基上，以接種至含等體積無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，25 ℃黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，測(cè)量菌落直徑，每種藥劑重復(fù)3次。觀察病原菌生長(zhǎng)是否受到抑制，選擇有抑制效果的化學(xué)藥劑進(jìn)行進(jìn)一步的質(zhì)量濃度篩選試驗(yàn)。

抑菌藥劑復(fù)篩：將對(duì)赤斑病病原菌有抑制效果的化學(xué)藥劑進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瑢⑺巹┡cPDA培養(yǎng)基按體積比1∶9配制不同質(zhì)量濃度的PDA培養(yǎng)基，藥劑最終質(zhì)量濃度為250.0 mg/L、100.0 mg/L、10.0 mg/L、1.0 mg/L和0.1 mg/L。接種菌餅，以含無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，25 ℃黑暗培養(yǎng)。5 d后，測(cè)量菌落直徑，每種藥劑每個(gè)質(zhì)量濃度各重復(fù)3次。通過(guò)DPS軟件計(jì)算各藥劑處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率和毒力回歸方程、半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)^[27-28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆赤斑病的病害癥狀

蠶豆赤斑病病原菌早期主要侵染蠶豆葉片，發(fā)病初期葉片上出現(xiàn)紅褐色小斑點(diǎn)，后來(lái)逐漸擴(kuò)大，形成圓形或橢圓形的病斑。病斑中間略凹陷，周?chē)月∑?，病健交界處明顯。嚴(yán)重時(shí)，病斑處葉片表皮破裂或者病斑擴(kuò)大合并，葉片變黑、枯萎，導(dǎo)致落葉（圖1A、圖1B）。

2.2 病原菌的分離和致病性

從病健交界處分離蠶豆赤斑病的病原菌，得到1株疑似菌株，命名為VFL39。將該菌株活體接種到蠶豆葉片，接種2 d后，葉片開(kāi)始出現(xiàn)黑色的病斑，隨著接種天數(shù)的增加，病斑逐漸擴(kuò)大至葉片邊緣，最終葉片變黑、枯萎（圖1C），而接種PDA培養(yǎng)基的葉片未出現(xiàn)任何病斑（圖1D）。從接種后的發(fā)病葉片上重新分離病原菌，得到與原接種病原菌形態(tài)學(xué)特性一致的病原菌。因此，通過(guò)柯赫氏法則，確定VFL39是蠶豆赤斑病的病原菌。

2.3 病原菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)特征 在25 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)，蠶豆赤斑病病原菌VFL39菌落初期呈現(xiàn)白色，菌絲絨毛狀，不易挑起（圖2A），約7 d后菌絲開(kāi)始變黃。培養(yǎng)約15 d開(kāi)始有菌核產(chǎn)生，排列較規(guī)則，呈同心環(huán)狀排列，菌核的形狀大小不一，呈球形或橢球形（圖2B），20 d后，菌核開(kāi)始變褐變黑，25 d后菌核已完全變黑，菌核個(gè)數(shù)150～200個(gè)/皿（圖2C）。VFL39在PDA培養(yǎng)基上菌絲為二叉型（圖2D），產(chǎn)生很少量的分生孢子，分生孢子淺褐色，長(zhǎng)棒狀（圖2E）。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，VFL39的形態(tài)特征與葡萄孢屬的擬蠶豆葡萄孢、卡羅萊納葡萄孢以及核盤(pán)菌屬的核盤(pán)菌類(lèi)似。

2.3.2 多基因序列分析 將菌株VFL39的ITS堿基序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)其屬于葡萄孢屬，但無(wú)法與某個(gè)具體的菌株聚為一支（圖3A）。將VFL39的G3PDH堿基序列提交至GenBank進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)其與模式菌株B. fabiopsis BroadbeanBC-2聚為一支（圖3B）。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因序列分析結(jié)果，最終將VFL39鑒定為擬蠶豆葡萄孢（B. fabiopsis）。

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1 不同溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 由圖4A可知，5～30 ℃的條件下病原菌菌絲能生長(zhǎng)，35 ℃以上的高溫條件下病原菌菌絲不能生長(zhǎng)，10 ℃以下病原菌菌絲生長(zhǎng)非常緩慢。隨著溫度的升高，菌絲的生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。在25 ℃時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)5 d，菌落直徑達(dá)到63.00 mm（圖4A）；溫度低于25 ℃，菌絲生長(zhǎng)速度顯著降低，20 ℃培養(yǎng)5 d，直徑為28.33 mm；溫度高于25 ℃，菌絲生長(zhǎng)速度降低更為顯著，30 ℃培養(yǎng)5 d，菌落直徑僅為6.83 mm。因此，該菌株對(duì)溫度比較敏感，最適宜的生長(zhǎng)溫度為25 ℃左右，溫度偏高或偏低均會(huì)嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)。

2.4.2 不同光照條件對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 圖4B顯示，在3種光照條件下，病原菌菌絲均能生長(zhǎng)。在12 h光照+12 h黑暗條件下，生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)5 d，菌落直徑達(dá)到68.67 mm；其次為24 h連續(xù)黑暗條件，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為52.83 mm；24 h連續(xù)光照條件下，菌絲生長(zhǎng)速度最慢，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為39.17 mm。因此，最適宜該菌株生長(zhǎng)的光照條件是12 h光照+12 h黑暗。

2.4.3 不同pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 由圖4C可知，pH為5～10的條件下，病原菌菌絲均能生長(zhǎng)，且差異不顯著。在5～10的pH范圍內(nèi)，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為43.83～49.17 mm（圖4C）。因此，該菌株對(duì)pH不敏感。

2.4.4 不同碳源、氮源對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 由圖4D可知，在4種碳源條件下，病原菌菌絲均能生長(zhǎng)，在無(wú)碳條件下，菌絲也能生長(zhǎng)。以不加碳源的培養(yǎng)基作為對(duì)照，在4種供試碳源中，菌株對(duì)葡萄糖的利用效果最好，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為22.50 mm（圖4D）；菌株對(duì)麥芽糖和蔗糖的利用效果均不好，與無(wú)碳條件差異不顯著。因此，最適宜該菌株生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖。

由圖4E可知，在6種氮源條件下，病原菌菌絲均能生長(zhǎng)，在無(wú)氮條件下，菌絲也能生長(zhǎng)。以不加氮源的培養(yǎng)基作為對(duì)照，在6種供試氮源中，菌株對(duì)酵母膏、牛肉膏和硫酸銨的利用效果最好，培養(yǎng)5 d，菌落直徑分別為56.67 mm、56.00 mm和55.83 mm（圖4E）；菌落對(duì)其他氮源的利用效果均不好，與無(wú)氮條件差異不顯著，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為7.83～10.17 mm。因此，適宜該菌株生長(zhǎng)的氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨。

2.4.5 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 由圖4F可知，在4種培養(yǎng)基上，病原菌菌絲均能生長(zhǎng)。在PDA培養(yǎng)基上，菌絲的生長(zhǎng)速度最快，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為54.00 mm；其次為OMA培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d，菌落直徑為43.50 mm；在CZ和WA培養(yǎng)基上，菌絲生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異，培養(yǎng)5 d，直徑分別為27.33 mm和25.50 mm。因此，最適宜該菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

2.5 病原菌抑菌藥劑的室內(nèi)篩選

藥劑初篩試驗(yàn)結(jié)果表明，9種化學(xué)藥劑中有2種對(duì)赤斑病病原菌幾乎無(wú)抑制效果，分別為10.0%多抗霉素可濕性粉劑和80.0%波爾多液可濕性粉劑。另外7種化學(xué)藥劑中，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)病原菌的抑制效果最好，EC50lt;1.000 0 mg/L；24.0%腈苯唑懸浮劑、12.5%腈菌唑乳油和75.0%百菌清可濕性粉劑對(duì)病原菌的抑制效果次之，1.000 0 mg/Llt;EC50lt;5.000 0 mg/L；其次為70.0%甲基硫菌靈可濕性粉劑，5.000 0 mg/Llt;EC50lt;10.000 0 mg/L；3.0%甲霜口惡霉靈水劑的抑制效果最差，EC50gt;10.000 0 mg/L（表1）。

3 討論

赤斑病是世界各地蠶豆最主要的病害之一，蠶豆葡萄孢是最早發(fā)現(xiàn)的致病菌，其次是灰葡萄孢^[29]。擬蠶豆葡萄孢最早是在中國(guó)湖北省被發(fā)現(xiàn)的^[11]，后來(lái)在中國(guó)其他省份及其他國(guó)家也發(fā)現(xiàn)了擬蠶豆葡萄孢能引起蠶豆赤斑病^[30-32]。不同蠶豆產(chǎn)區(qū)的不同蠶豆品種，引起赤斑病的病原菌也有所不同。黃燕等^[30]發(fā)現(xiàn)甘肅省、青海省、江蘇省、四川省、河北省、重慶市的蠶豆赤斑病是由蠶豆葡萄孢、灰葡萄孢、擬蠶豆葡萄孢引起的，但在安徽省、湖北省僅分離到灰葡萄孢^[33]。馬生彪等^[7]發(fā)現(xiàn)甘肅省渭源縣的蠶豆赤斑病是由蠶豆葡萄孢引起的，未發(fā)現(xiàn)另外2種病原菌。喻敏博^[12]在青海省不僅發(fā)現(xiàn)了上述3種主要赤斑病病原菌，還分離出另外6種病原菌。本研究在江蘇省南通市吳窯鎮(zhèn)僅鑒定出擬蠶豆葡萄孢1種病原菌，其原因可能是蠶豆病樣僅來(lái)自吳窯鎮(zhèn)1個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的1個(gè)蠶豆品種，病原菌的分離范圍和數(shù)量較小所致。

研究病原菌的生物學(xué)特性有助于了解病害的發(fā)生規(guī)律及其與環(huán)境之間的關(guān)系，從而便于在實(shí)際生產(chǎn)中通過(guò)控制環(huán)境條件減少病害的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，擬蠶豆葡萄孢菌絲在5～30 ℃能夠生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，這與張靜^[15]對(duì)湖北省擬蠶豆葡萄孢的生物學(xué)特性研究結(jié)果一致。擬蠶豆葡萄孢菌絲在pH為5～10范圍內(nèi)也均能正常生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)速度無(wú)顯著差異，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨。本研究在pH和碳/氮源上的研究結(jié)果與張靜^[15]對(duì)湖北省擬蠶豆葡萄孢的生物學(xué)特性研究結(jié)果存在差異，這可能是采集病樣的品種及生長(zhǎng)區(qū)域不同導(dǎo)致的。有研究結(jié)果表明，擬蠶豆葡萄孢的生長(zhǎng)溫度范圍和pH范圍比蠶豆葡萄孢廣，且致病力較強(qiáng)^[15]，其對(duì)蠶豆的危害可能會(huì)進(jìn)一步加重，在今后的蠶豆田間生產(chǎn)中要重視對(duì)擬蠶豆葡萄孢引起的赤斑病的防治。

抑菌藥劑室內(nèi)篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)擬蠶豆葡萄孢的抑制效果最好?？鄥A水劑是天然植物性農(nóng)藥，在生產(chǎn)上是一種廣譜的殺蟲(chóng)劑，其對(duì)蔬菜的霜霉病、疫病、炭疽病等也有很好的防治效果，殺菌機(jī)理是抑制菌體生物合成，影響菌體的生物氧化過(guò)程。有研究結(jié)果表明，苦參堿水劑對(duì)小麥赤霉病、水稻稻瘟病和芍藥紅斑病、炭疽病、根腐病的病原菌生長(zhǎng)均有一定的抑制作用^[34]。苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑屬于三唑類(lèi)殺菌劑，其對(duì)梨黑星病、蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病、番茄早疫病、辣椒炭疽病等均有較好的防治效果，殺菌機(jī)理是抑制真菌細(xì)胞壁的合成和細(xì)胞膜的功能，從而有效抑制真菌的生長(zhǎng)和繁殖。藥劑篩選田間試驗(yàn)結(jié)果表明，80.0%代森錳鋅可濕性粉劑和75.0%的百菌清可濕性粉劑對(duì)蠶豆赤斑病的防治效果最好^[35]。在本研究中，75.0%百菌清可濕性粉劑對(duì)擬蠶豆葡萄孢也有抑制效果，但不如2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑效果明顯，這可能是由室內(nèi)試驗(yàn)和田間試驗(yàn)的環(huán)境差異導(dǎo)致?？鄥A水劑是植物源農(nóng)藥，苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑也是三唑類(lèi)殺菌劑中毒性較低的一種，對(duì)環(huán)境友好，可以安全使用，但本研究?jī)H為室內(nèi)篩選結(jié)果，還需進(jìn)行相關(guān)的田間試驗(yàn)以便在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

4 結(jié)論

江蘇省南通市蠶豆赤斑病的病原菌為擬蠶豆葡萄孢（Botrytis fabiopsis）。該病原菌菌絲最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最適光照條件為12 h光照+12 h黑暗，對(duì)pH不敏感，最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母膏、牛肉膏和硫酸銨，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。室內(nèi)抑菌藥劑篩選結(jié)果表明，2.0%苦參堿水劑和10.0%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑對(duì)病原菌的抑制效果最好，在今后的田間生產(chǎn)中可用于蠶豆赤斑病的化學(xué)防治。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）