基于單分子納米孔測(cè)序技術(shù)揭示大白菜抽薹期全長轉(zhuǎn)錄組差異的復(fù)雜性

關(guān)鍵詞：第三代高通量測(cè)序技術(shù)；單分子納米孔測(cè)序技術(shù)；大白菜；抽薹期；全長轉(zhuǎn)錄本

中圖分類號(hào)：S634.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）11-0001-12

春白菜未熟抽薹是指短縮莖因?qū)Φ蜏孛舾袕亩ㄟ^春化在結(jié)球后過度伸長生長，致使葉球部分或全部喪失商品價(jià)值的現(xiàn)象，是困擾春白菜生產(chǎn)的主要難題。大白菜抽薹是多基因控制的數(shù)量性狀，且存在基因型與環(huán)境互作的復(fù)雜情況。擬南芥中，薹莖發(fā)育受6條開花途徑控制，包括受環(huán)境因子影響的春化途徑、光周期途徑、環(huán)境溫度途徑及受內(nèi)部因子調(diào)控的自主途徑、赤霉素途徑和年齡途徑，這6條途徑的上游基因相互獨(dú)立，但下游最終會(huì)作用于兩個(gè)關(guān)鍵整合因子FT和SOCl。春化途徑通過調(diào)控因子VRN1～5、VIL1～4、PRC 2、LHP1等協(xié)同作用感受低溫后，以表觀調(diào)控的方式使FLC（Flower Locus C）沉默，進(jìn)而解除對(duì)FT的抑制作用，其中長鏈非編碼RNA（IncRNA）也起到了關(guān)鍵作用：光周期途徑中，關(guān)鍵調(diào)控因子CO位于FT上游，其周期性變化受各種光受體和COP1/SPA-E3-泛素連接酶復(fù)合體的精細(xì)調(diào)控；在赤霉素途徑中，赤霉素合成與代謝以及由DELLA蛋白介導(dǎo)的赤霉素信號(hào)通路都會(huì)影響花芽分化和薹莖伸長。因此，植物的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是由多基因參與、多條途徑控制的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。

測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和大白菜全基因組參考序列的公布，為利用組學(xué)技術(shù)從全基因組水平揭示大白菜晚抽薹的復(fù)雜分子機(jī)制提供了新的研究策略。目前，大白菜抽薹相關(guān)組學(xué)研究已取得了一些進(jìn)展，研究者們先后采用二代測(cè)序技術(shù)、甲基化測(cè)序揭示出大白菜在春化作用或者不同光周期處理下的轉(zhuǎn)錄組、甲基化和microRNA的差異。但前人研究所用的多是單一材料在可控條件下的轉(zhuǎn)錄組變化，而對(duì)于晚抽薹和早抽薹材料在接近自然生長條件下通過春化后的全長轉(zhuǎn)錄組差異分析鮮見報(bào)道。因此，本研究選擇大白菜晚抽薹材料06-247與早抽薹材料He102.采用單分子納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)兩者抽薹期帶葉片的花序軸進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘兩個(gè)材料抽薹期全長轉(zhuǎn)錄組的結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)差異，并對(duì)兩者全長轉(zhuǎn)錄本之間存在的可變剪切（alternative splicing，AS）、可變多聚腺苷酸位點(diǎn)（alternative polyadenylation，APA）、長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，IncRNA）進(jìn)行分析，旨在為揭示大白菜晚抽薹分子機(jī)制提供新的線索。

1材料與方法

1.1供試材料與樣品采集

所用試材為大白菜晚抽薹自交系06-247與早抽薹自交系He102，二者在抽薹性方面的差異主要表現(xiàn)為在相同條件下完成春化后抽薹期主花莖長度存在極顯著差異。材料種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所核心試驗(yàn)基地。2018年12月31日，將經(jīng)催芽后的兩材料單粒點(diǎn)播于含壤土：草炭：珍珠巖（1：1：1）的育苗缽（口徑8 cm）中，置于冬暖大棚中育苗并使其自然通過春化。冬暖大棚為雙層棚膜結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，內(nèi)層棚膜外設(shè)有保溫被，當(dāng)夜間氣溫低于-3℃時(shí)覆蓋保溫被過夜，自然光照。2019年3月1日將幼苗轉(zhuǎn)移至紗網(wǎng)棚煉苗，3月10日移栽至紗網(wǎng)棚。小區(qū)設(shè)置為0.8 mx3.0m，雙行種植，行距40cm，株距30 cm，每小區(qū)18～20株，3次重復(fù)。3月30日，從每個(gè)小區(qū)至少10個(gè)生長正常的單株上采集帶葉片的主花序軸，在低溫下剪碎、混勻，用于總RNA的提取。

1.2全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.2.1總RNA提取及質(zhì)控 總RNA提取采用Trizol法，用RNase-free DNase I（Ambion，美國）處理總RNA以消除潛在的基因組DNA污染，用Bioanalyzer 2100（Agilent，美國）評(píng)估總RNA質(zhì)量，以RIN≥7且OD_260nm/OD_280nm值≥1.8為閾值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。自檢合格的RNA分成兩份，一份用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，一份用于qRT-PCR驗(yàn)證。

1.2.2全長cDNA文庫構(gòu)建和測(cè)序 用于測(cè)序的3次生物學(xué)重復(fù)的總RNA樣本等量混勻，采用SMART技術(shù)構(gòu)建全長cDNA文庫（SMARTer@PCR cDNA Synthesis Kit，Cat No：634925，TaKaRa生物科技（美國）有限公司生產(chǎn)），得到的cDNA添加switch oligo后再合成互補(bǔ)鏈。對(duì)合成的DNA進(jìn)行損傷修復(fù)和末端修復(fù)，再利用磁珠對(duì)cDNA進(jìn)行純化。最后委托北京百邁克生物科技有限公司對(duì)cDNA文庫進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Nanopore PromethION48（Oxford Nano-pore Technologies，簡(jiǎn)稱ONT，英國），實(shí)驗(yàn)按照ONT公司提供的標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。

1.3全長轉(zhuǎn)錄本鑒定與注釋

1.3.1原始讀段的初步處理 測(cè)序產(chǎn)生的原始下機(jī)序列稱為原始讀段（raw reads），用Min-KNOW2.2軟件包中的Guppy軟件進(jìn)行base call-ing，過濾掉Qlt;7、長度lt;500 bp的低質(zhì)量序列和核糖體RNA序列，得到有效讀段（clean reads），并根據(jù)序列兩端是否存在引物得到全長讀段（ full-length reads）。用Minmap2軟件對(duì)全長讀段與大白菜參考基因組V3.0進(jìn)行比對(duì)，再使用pin-fish軟件分析得到一致性序列（consensus se-quence）。用一致性序列進(jìn)行后續(xù)的所有分析。

1.3.2全長轉(zhuǎn)錄本以及新基因的篩選 合并每個(gè)樣品的一致性序列，再次通過Minimap2與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，去除冗余序列，過濾掉identitylt;0.9、coveragelt;0.85的序列，僅合并5’端外顯子有差異的序列，最終獲得高質(zhì)量非冗余全長轉(zhuǎn)錄本序列（ collapsed sequence）。將全長轉(zhuǎn)錄本與大白菜參考轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比對(duì)，篩選出已知基因或已知基因的異構(gòu)體。對(duì)于不能比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄本中的全長序列，再采用TransDecoder（v3.0.0）軟件，基于開放閱讀框（open reading frame，ORF）長度、對(duì)數(shù)似然函數(shù)值（log-likelihood score）、氨基酸序列與Pfam數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域序列的比對(duì)等信息，從中識(shí)別可靠的潛在編碼區(qū)序列（coding se-quence，CDS），視為具有編碼潛能的新基因。

1.3.3全長轉(zhuǎn)錄本的注釋 利用Blast工具將上述所有全長轉(zhuǎn)錄本在Pfam、KOG[24]、Swiss-Prot、NR、eggNOG、GO（Gene Ontolo-gy）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)的注釋信息。

1.4全長轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異分析

1.4.1可變剪切篩選 可變剪切（alternative spli-cing，AS）的類型主要包括外顯子互斥（mutually excluslve exons，MEE）、外顯子跳躍（skipping ex-on，SE）、內(nèi)含子保留（retained intron，RI）、可變5′剪切位點(diǎn)（alternative 5′splice-site，A5）、可變3′剪切位點(diǎn)（alternative 3′splice-site，A3）。通過Asta-lavista軟件獲取每個(gè)樣品的可變剪切類型，并對(duì)各種AS事件類型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4.2可變多聚腺苷酸位點(diǎn)分析 按下列方法對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行可變多聚腺苷酸位點(diǎn)（alternative polyadenylation，APA）的篩選：比較冗余轉(zhuǎn)錄本的3′端非翻譯區(qū)序列（3′-UTR），根據(jù)3′-UTR是否完全一致判斷APA的數(shù)目。利用MEME比較冗余轉(zhuǎn)錄本polyA位點(diǎn)上游50 bp的序列，鑒別相應(yīng)的polyA信號(hào)（PAS）。

1.5長鏈非編碼RNA預(yù)測(cè)

通過對(duì)所得非冗余轉(zhuǎn)錄本的編碼潛能進(jìn)行分析，篩選出不編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本，即長鏈非編碼RNA（IncRNA）。再用編碼潛能計(jì)算器（CodingPotential Calculato，簡(jiǎn)稱CPC）、編碼一非編碼指數(shù)分析工具（Coding-Non-Coding Inde，簡(jiǎn)稱CP-CI）、編碼潛能評(píng)估工具（Coding Potential As-sessment Tool，簡(jiǎn)稱CPAT）、蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)工具Pfam對(duì)IncRNA進(jìn)行分類，取4種方法的交集作為高質(zhì)量IncRNA。

采用兩種方法對(duì)IncRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。方法①：基于IncRNA調(diào)控其鄰近基因的表達(dá)，主要根據(jù)IncRNA與mRNA的位置關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)，定義染色體中每100kb范圍內(nèi)存在差異表達(dá)的IncRNA與差異表達(dá)的mRNA，得到順式作用（cis-acting）靶基因。方法②：lncRNA與mRNA由于堿基互補(bǔ)配對(duì)而發(fā)生作用，主要利用靶基因預(yù)測(cè)工具LncTar進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，得到反式調(diào)控靶基因。

1.6轉(zhuǎn)錄本定量分析及與抽薹相關(guān)的差異基因篩選

1.6.1轉(zhuǎn)錄本定量分析及差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本鑒定 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以模擬成一個(gè)隨機(jī)抽樣的過程，為了讓片段數(shù)目能真實(shí)地反映轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平，首先對(duì)樣品中Mapped Reads的數(shù)目進(jìn)行歸一化。采用CPM（counts per million） 作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，CPM計(jì)算公式如下：

CPM=N₁/N₂×1000000。

其中，CPM表示CPM；N₁表示reads mapped to tran-script，即比對(duì)到某一轉(zhuǎn)錄本上的reads數(shù)目；N₂表示total reads aligned in sample，即比對(duì)到參考轉(zhuǎn)錄組的片段總數(shù)。

對(duì)于沒有生物學(xué)重復(fù)的樣本，使用EBSeq進(jìn)行差異分析，參數(shù)設(shè)置FC≥2且FDRlt;0.01。FC（Fold Change）表示差異倍數(shù)，即兩（組）樣品間表達(dá)量的比值。FDR是False Discovery Rate的簡(jiǎn)稱，是通過對(duì)差異顯著性P值（P-value）進(jìn)行校正得到的。

1.6.2與抽薹有關(guān)的差異候選基因篩選 在差異表達(dá)基因集的GO注釋中，用“vernalization”、“photoperiod”、“gibberellins”和“gibberellic acid”為關(guān)鍵詞進(jìn)行基因條目的篩選，合并所有條目并去除重復(fù)項(xiàng)，獲得與抽薹直接相關(guān)的差異候選基因。

1.6.3差異候選基因qRT-PCR驗(yàn)證 總RNA的逆轉(zhuǎn)錄采用天根的Quant cDNA第一鏈合成試劑盒（KR103）進(jìn)行。qRT-PCR在Applied Biosys-tems QuantStudio 3型qPCR儀上進(jìn)行，采用天根RealUniversal彩色熒光定量預(yù)混試劑（SYBR Green，F(xiàn)P201）并按說明書操作，所用引物見表1。反應(yīng)總體積20μL，包含如下成分：2×RealUniver-sal PreMi×10μL，Primer F（10μmol·L^-1）0.6μL，Primer R（10μmol.L^-1） 0.6μL，0.1～100 ng cDNA模板，添加ddH2O至20μL。以葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因（G6PD）作為內(nèi)參基因，按照2^-ΔΔCt）法計(jì)算特異基因相對(duì)表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析用SAS Version 9.0軟件進(jìn)行，依據(jù)Duncan’s multiple range test法計(jì)算0.05水平差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控分析

He102與06-247分別得到6962774條和5659251條原始讀段，總堿基數(shù)分別為82.02Gb和62.64 Gb；最大長度分別是11902bp和10407bp，居中長度（N50）分別為1329bp和1211bp，平均長度分別是1178bp和1106bp（表2）。He102與06-247的原始讀段長度大部分介于1kb～10kb，其中分布reads數(shù)最多的長度均為1kb（圖1A、B）。原始讀段的質(zhì)量（Q）值介于1～18之間，讀段的質(zhì)量值分布最多的是11（圖1C、D），平均質(zhì)量值為11（表2）。上述數(shù)據(jù)表明本次測(cè)序產(chǎn)生了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

2.2全長轉(zhuǎn)錄本的鑒定

He102與06-247測(cè)序產(chǎn)生的高質(zhì)量有效讀段（clean reads）分別是6 896 814條和5586307條，兩側(cè)都有引物序列的全長讀段（full-length reads）分別有6051557條和4844987條，去冗余后分別得到64228條和55123條一致性序列（consensus isoforms）；過濾掉identitylt;0.9、cover-agelt;0.85的序列，合并僅5′端外顯子有差異的reads，兩者分別得到37309個(gè)和30415個(gè)高質(zhì)量非冗余全長轉(zhuǎn)錄本，其居中長度分別為1628bp和1537bp，平均長度分別為1413bp和1337bp，最大長度分別為7074bp和5642bp（表3）。

2.3全長轉(zhuǎn)錄本序列的比對(duì)及新基因的數(shù)據(jù)庫注釋

整合各樣品高質(zhì)量非冗余轉(zhuǎn)錄本，累計(jì)獲得46485個(gè)unigene，包括44797個(gè)已知基因和1688個(gè)新基因。經(jīng)過嚴(yán)格的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)22971個(gè)已知基因的序列與參考轉(zhuǎn)錄組同源基因的序列之間存在多態(tài)性差異，它們是已知基因的異構(gòu)體（isoforms）。全部1688個(gè)新基因在GO、KEGG、COG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG或NR 8個(gè)數(shù)據(jù)庫中獲得注釋。

2.4可變剪切分析

從He102與06-247中分別鑒定出3571個(gè)和2065個(gè)AS事件，分別獨(dú)有2421個(gè)和993個(gè)AS事件，涉及的基因數(shù)目分別是1832個(gè)和819個(gè)，He102獨(dú)有的AS基因數(shù)目是06-247的兩倍多。這些AS事件包括外顯子互斥、內(nèi)含子保留、外顯子跳躍、可變5′剪切位點(diǎn)和可變3′剪切位點(diǎn)共5種類型（表4）。其中，內(nèi)含子保留是最常見的可變剪切類型，分別占He102與06-247可變剪切的60.52%和57.58%；外顯子互斥則是比較罕見的可變剪切類型，在He102與06-247中分別鑒定出10個(gè)和4個(gè)，占比均不足3%0（圖2）。2.5可變多聚腺苷酸位點(diǎn)分析

在He102與06-247中分別有19636個(gè)和18 996個(gè)基因具有APA，APA數(shù)為1～29個(gè)不等，基因數(shù)與APA數(shù)統(tǒng)計(jì)如圖3所示。其中3 286個(gè)基因僅在He102中有APA現(xiàn)象，2646個(gè)基因僅在06- 247中有APA現(xiàn)象。雖然二者有16 350個(gè)相同基因發(fā)生了APA數(shù)的變化，但仍然有很多基因在兩者中存在APA數(shù)和polyA位置的差異。

2.6 IncRNA的鑒定與分析

IncRNA是不編碼蛋白的全長轉(zhuǎn)錄本，采用CPC、CNCI、CPAT和Pfam 4種方法分別鑒定出1358、554、1209條和453條IncRNA序列，4種方法的交集有453條高質(zhì)量IncRNA（圖4A），其中He102獨(dú)有81條，06-247獨(dú)有55條。80%以上的IncRNA屬于long intergemc non-coding RNA（lincRNA），來自基因間區(qū)（圖4B）。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，451個(gè)IncRNA具有順式調(diào)控靶基因的潛能，97個(gè)具有反式調(diào)控潛能。

2.7與開花相關(guān)的差異基因篩選

隨機(jī)抽取不同數(shù)量的測(cè)序數(shù)據(jù)單獨(dú)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本定量分析，得到He102與06-247轉(zhuǎn)錄本的飽和度模擬檢驗(yàn)結(jié)果，如圖5所示，最終發(fā)現(xiàn)有29 062個(gè)基因符合定量比較的要求，這些基因的差異比較火山圖和MA圖如圖6A、B所示。在設(shè)定閾值條件下篩選到差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本5197個(gè)，這些差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的聚類分析結(jié)果如圖6C所示，其中He102_vs_06-247上調(diào)的有2453個(gè)，下調(diào)的有2744個(gè)。

差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本中有GO注釋的4024個(gè)，以“vernalization”、“photoperiod”、“gibberellins”和“gibberellic acid”為關(guān)鍵詞分別在GO注釋中篩選，累計(jì)獲得41個(gè)差異轉(zhuǎn)錄本，它們?cè)趦刹牧现械牟町愱P(guān)系以及NR注釋見表5。其中有DNA甲基化修飾酶、赤霉素受體GIDIA、赤霉素調(diào)控蛋白6和7、開花調(diào)控因子FRI-like蛋白、FLC異構(gòu)體、SOCl-like基因AGIA2和AGL72、FT以及BFT等多種與開花相關(guān)的基因。

隨機(jī)選擇19個(gè)差異表達(dá)基因（12個(gè)下調(diào)、7個(gè)上調(diào)）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果如表6所示。總計(jì)有16個(gè)基因（占84.21%）的調(diào)控趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致，其中10個(gè)基因的差異達(dá)到顯著水平（Plt;0.05）。雖然有3個(gè)基因的驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果不一致，但在兩個(gè)材料之間的差異均未達(dá)到顯著性水平（Pgt;0.05）。表明本研究篩選到的差異基因可信度較高，可以為后續(xù)研究提供可靠的參考。

3討論

晚抽薹是春白菜育種最重要的目標(biāo)之一。晚抽薹性是多基因控制的數(shù)量性狀，且受溫度、光照等環(huán)境因素影響大。近年來，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，基于二代測(cè)序技術(shù)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究已經(jīng)用于晚抽薹和早抽薹大白菜材料之間的差異基因篩選，這為更全面闡釋大白菜晚抽薹分子機(jī)理提供了重要參考。但由于二代測(cè)序的讀段相對(duì)較短，通常僅有200～500 bp，而大白菜基因組在長期演化過程中經(jīng)歷了基因組的三倍化過程，有很多基因存在多拷貝現(xiàn)象，二代測(cè)序技術(shù)的短讀段無疑不能區(qū)分來自同源基因的同源片段，這使得比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)產(chǎn)生的差異基因信息存在先天的系統(tǒng)誤差。納米孔測(cè)序技術(shù)是第三代測(cè)序技術(shù)，它的最大優(yōu)點(diǎn)是可以使超長堿基構(gòu)成的DNA鏈在一個(gè)單通道中就能夠被解碼和識(shí)別，而不需要將長鏈分割成小的短鏈，因而可以對(duì)全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，對(duì)于區(qū)別同源基因、識(shí)別新基因、篩選可變剪切等基因結(jié)構(gòu)變異有更大的優(yōu)勢(shì)。但國內(nèi)外尚未見采用納米孔測(cè)序技術(shù)分析晚抽薹和早抽薹大白菜材料的帶葉片花序軸全長轉(zhuǎn)錄組的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究基于納米孔測(cè)序技術(shù)，對(duì)大白菜晚抽薹材料06-247與早抽薹材料He102春化完成后的帶葉片的花序軸進(jìn)行了全長轉(zhuǎn)錄組分析，所得結(jié)果與二代測(cè)序的結(jié)果可以互相印證，互為補(bǔ)充，將對(duì)闡釋大白菜晚抽薹分子機(jī)理提供重要參考。

本研究通過納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)單個(gè)文庫的數(shù)據(jù)產(chǎn)出分別是82.02 Gb（He102）和62.64 Gb（06-247），是前人二代測(cè)序單個(gè)文庫數(shù)據(jù)產(chǎn)出（6 Gb或8.81Gb）的7.1～13.7倍，成為轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析、新轉(zhuǎn)錄本／基因篩選以及定量比較的基礎(chǔ)。另外，本研究對(duì)新轉(zhuǎn)錄本的篩選質(zhì)控嚴(yán)格，僅保留identity≥0.9、coverage≥0.85且5′端外顯子有差異的序列，以確保獲得高質(zhì)量全長新轉(zhuǎn)錄本序列，最終從He102與06-247中分別獲得37309個(gè)和30415個(gè)高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄本。將兩材料的全長轉(zhuǎn)錄本序列合并，累計(jì)獲得44797個(gè)已知基因和1688個(gè)新基因，這一結(jié)果與Dai等采用二代測(cè)序技術(shù)獲得的數(shù)據(jù)（分別是44799個(gè)和2280個(gè)）相當(dāng)。進(jìn)一步進(jìn)行嚴(yán)格的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在44797個(gè)已知基因中有22971個(gè)是參考轉(zhuǎn)錄組同源基因的異構(gòu)體，這些大量存在的異構(gòu)體基因（即等位基因的多樣性）從分子水平為種質(zhì)資源多樣性提供了有力證據(jù)，而關(guān)于大白菜抽薹期同源基因異構(gòu)體的挖掘尚未見報(bào)道。

在比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，為了得到可靠的結(jié)果，常設(shè)生物學(xué)重復(fù)。如Dai等在晚抽薹材料JWW和早抽薹材料XBJ不同春化處理時(shí)期的葉片的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，發(fā)現(xiàn)JWW在春化處理5個(gè)階段均存在表達(dá)差異的基因有2 245個(gè)，而XBJ中有3278個(gè)，但并沒有比較兩個(gè)材料之間的差異表達(dá)基因。Wei等以花原基為試材，同樣設(shè)3次重復(fù)，將晚抽薹DH系“Y410-1”與早抽薹菜芯DH系“CX14-1”以及晚抽薹DH系“SY2004”與早抽薹菜芯DH系“CX14-1”進(jìn)行比較，分別獲得12932個(gè)和12711個(gè)差異表達(dá)的基因。上述如此龐大的差異基因?qū)罄m(xù)選擇候選基因以及深入闡釋大白菜耐抽薹分子機(jī)制造成一定困難?？紤]到一個(gè)物種特定時(shí)期表達(dá)的基因數(shù)目是有限的，隨著測(cè)序量的增加，檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目會(huì)趨于飽和，而且全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的成本也很高，因此本研究舍棄了生物學(xué)重復(fù)。但是表達(dá)量越高，轉(zhuǎn)錄本越容易被檢測(cè)定量，對(duì)于表達(dá)量低的轉(zhuǎn)錄本，則需要更大的數(shù)據(jù)量才能被準(zhǔn)確定量?；诖?，本研究采用大的數(shù)據(jù)產(chǎn)出來彌補(bǔ)不設(shè)重復(fù)的缺陷，并隨機(jī)抽取轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了飽和度檢測(cè)，僅僅選擇飽和度檢驗(yàn)合格的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定量比較，以使得定量分析結(jié)果更加可靠。經(jīng)檢驗(yàn)，最終有29062個(gè)基因符合定量比較的要求，在設(shè)定的閾值條件下篩選到5197個(gè)差異表達(dá)基因。這一數(shù)據(jù)比Dai等的報(bào)道結(jié)果略多但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Wei等的結(jié)果。由于兩個(gè)大白菜材料的背景差異比較大，這些差異基因未必都與晚抽薹性有關(guān)，鑒于春化、光周期、赤霉素等是影響大白菜抽薹性比較重要的因素，我們?cè)诓町惢蛑羞M(jìn)一步篩選GO注釋中含有關(guān)鍵詞“vernalization”、“photoperiod”、“gibberellins”或“gibberellic acid”的基因，累計(jì)得到41個(gè)與抽薹直接相關(guān)的差異基因，其中有與DNA表觀修飾有關(guān)的DNA（cytosine-5）-methyltransferase DRM2，有與赤霉素信號(hào)有關(guān)的赤霉素受體GIDIA和赤霉素調(diào)控蛋白，有調(diào)控開花的轉(zhuǎn)錄因子FRI-like蛋白、FLC異構(gòu)體、SOCl-like基因AGIA2和AGL72、FT以及BFT等。眾所周知，F(xiàn)LC是春化途徑的重要調(diào)控因子，F(xiàn)T、CONSTANS等是光周期途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子，DNA甲基化在春化介導(dǎo)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。因此，這些候選基因可為深入解析大白菜耐抽薹分子機(jī)制提供功能基因。qRT-PCR結(jié)果表明，將近85%的差異表達(dá)基因的表達(dá)趨勢(shì)與驗(yàn)證結(jié)果相一致，這進(jìn)一步增加了候選基因的可信度。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了大量He102與06-247獨(dú)有的AS、APA及IncRNA，而已有研究證明開花調(diào)控因子FLC的表達(dá)受IncRNA的調(diào)控，因此不排除與春化相關(guān)的基因可能也存在AS和APA方面的差異。本研究獲得的大白菜不同耐抽薹性自交系抽薹期轉(zhuǎn)錄組在結(jié)構(gòu)方面的差異將為揭示大白菜晚抽薹的分子機(jī)制提供新的參考。

4結(jié)論

大白菜的抽薹性是多基因控制的數(shù)量性狀，本研究采用單分子納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)晚抽薹材料06-247與早抽薹材料He102抽薹期花莖組織進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，獲得了1688個(gè)新基因，對(duì)新的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫注釋。篩選得到5197個(gè)差異表達(dá)基因，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步以關(guān)鍵詞篩選的方法挖掘出了41個(gè)與抽薹密切相關(guān)的差異基因，部分差異基因經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證準(zhǔn)確可靠，這為下一步選擇功能基因研究?jī)蓚€(gè)材料抽薹性差異的分子機(jī)制提供了信息。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)兩個(gè)材料的轉(zhuǎn)錄本在AS、APA、IncRNA等方面存在廣泛的變異，這些變異可能對(duì)大白菜抽薹性具有一定影響。綜上，全長轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示出大白菜抽薹期轉(zhuǎn)錄組存在多方面的復(fù)雜差異，這些結(jié)果可為進(jìn)一步闡釋大白菜晚抽薹的分子機(jī)制提供新的參考。