高碳基肥減氮施用對植煙土壤總碳、總氮和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

摘要：本研究采用田間試驗法，以常規(guī)施肥（純氮111 kg·hm-2）為對照（GCK），設置高碳基肥450kg·hm-2+減氮10%（C3）、高碳基肥750 kg·hm-2+減氮20%（C5）和高碳基肥1 050 kg·hm-2+減氮300-/0（C7）共4個處理，研究其對植煙土壤總碳、總氮含量的影響，并采用ITS測序技術(shù)分析煙田土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及其與土壤總碳和總氮的關(guān)系。結(jié)果表明：（1）高碳基肥減氮施用處理G7提高植煙土壤總碳含量和碳氮比（移栽后60、90 d），降低土壤總氮含量（移栽后60、90 d）。（2）高碳基肥減氮施用處理G3顯著提高土壤真菌豐富度（移栽后30、90 d）。（3）高碳基肥減氮施用改變了真菌的群落結(jié)構(gòu)，在門水平上提高了接合菌門（Zygomyco-ta）相對豐度（移栽后60 d），降低了子囊菌門（Ascomycota）相對豐度；在屬水平上提高了木霉屬（Trichoderma）相對豐度，降低了鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度（移栽后60 d）。（4）高碳基肥減氮施用通過影響土壤總碳、總氮含量和碳氮比改變其真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)。本試驗條件下，每公頃施用高碳基肥1 050 kg+純氮77.7kg（G7）對植煙土壤總碳、總氮、碳氮比以及真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。

關(guān)鍵詞：高碳基肥：減氮施用；總碳；總氮；碳氮比；真菌群落結(jié)構(gòu)；植煙土壤

中圖分類號：S572：S153：S154.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 10-0093-09

長期施用化肥會導致土壤性能退化和作物產(chǎn)質(zhì)量的下降。其中，氮肥的大量施用導致土壤碳庫缺失、土壤碳氮比失衡、耕地酸化和土壤微生態(tài)失衡等問題?？緹熓俏覈钪匾慕?jīng)濟作物之一，其產(chǎn)量和種植面積均居世界前列，但植煙土壤微生態(tài)失衡是制約優(yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)的主要因素之一，已成為我國煙草種植亟待解決的問題。

高碳基肥是一種主要由生物炭、植物油粕、天然礦物質(zhì)肥、腐殖酸和微量元素等原料混合而成的炭基肥，具有較大的孔隙結(jié)構(gòu)和巨大的比表面積，利于吸附有機質(zhì)、養(yǎng)分、水和氣體等，能為土壤微生物提供良好的生存環(huán)境，對土壤微生態(tài)的影響較大。大量研究表明，施用高碳基肥能提高土壤的陽離子交換量和土壤養(yǎng)分含量，減少營養(yǎng)元素的流失，改善土壤氮的儲存和利用，并且與氮肥配施能減少土壤氮素損失，提高土壤堿解氮和微生物量氮含量。而土壤真菌作為土壤微生物的重要組成，具有分解有機質(zhì)、釋放土壤酶、抑制病原菌等重要作用，助力土壤氮、碳循環(huán)。也有研究發(fā)現(xiàn)，高碳基肥與氮肥配施可以提高柄孢殼菌屬相對豐度，降低鐮刀菌屬相對豐度，抑制煙草病害發(fā)生，顯著改變植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和提高煙草的產(chǎn)質(zhì)量。Solaiman等也研究發(fā)現(xiàn)，生物炭能通過改變微生物群落結(jié)構(gòu)影響土壤養(yǎng)分循環(huán)和作物生長，改善真菌的生存環(huán)境，顯著提高小麥根部真菌菌根定殖率。

高碳基肥減氮施用可改善植煙土壤結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，減少化肥施用。然而，高碳基肥減氮施用對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響尚不明確。因此，本研究在重慶市豐都縣植煙區(qū)探究高碳基肥減氮施用對土壤總碳、總氮和真菌多樣性的影響，以期為采用高碳基肥調(diào)控植煙土壤微生態(tài)和減少化肥施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況和材料

試驗于2020年4-10月在重慶市豐都縣太平壩鄉(xiāng)（108°9＇27＂E，29°44＇10＂N）開展。試驗地土壤為砂壤土，耕層土壤理化性質(zhì)：有機質(zhì)含量29.8 g·kg-1、堿解氮168.0mg·kg-1、有效磷57.5mg·kg-1、速效鉀373.0 mg·kg-1，pH值為5.2。

供試高碳基肥總碳含量27.09%、總氮1.74%、磷（P2O5）1.28%、鉀（K2O）0．86%，含水率26.36%，pH值8.19，由河南惠農(nóng)土質(zhì)保育研發(fā)有限公司提供。供試單質(zhì)肥為硝酸銨（N 35%）、重過磷酸鈣（P2O5 43%）、硫酸鉀（K2O 50%）。

供試烤煙品種為云煙1 16（Nicotiana tabacumL．cv. Yunyan 116）。煙苗5月6日移栽，株行距為52 cm × 115 cm（約15 810株·hm-2）。

1.2 試驗設計

田間試驗共設置4個處理，見表1。使用單質(zhì)肥調(diào)整各處理的純氮和磷鉀含量，確保氮磷鉀比例與常規(guī)施肥一致（N：P2O5：K2O=1：0.95：3.37）。隨機區(qū)組排列，重復3次，設保護行。小區(qū)面積為147 m2。所有肥料均在移栽前進行條施，其他田間管理措施按當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進行。

1.3 土壤樣品采集與測定

分別于移栽后30 d（伸根期）、60 d（旺長期）和90 d（成熟期），采用抖根取樣法采集煙草根際土壤樣品，土樣用液氮速凍后放至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采集煙草根? - 20 cm的土壤樣品進行土壤指標測定。采用德國Elementar公司生產(chǎn)的全自動CNS元素分析儀（Vario MACROcube）測定土壤全氮（TN）和全碳（TC）含量，計算碳氮比（C/N）。

1.4 土壤DNA提取、擴增與高通量測序

采用DNA抽提試劑盒對土壤樣本的基因組DNA進行提取，以提取的基因組DNA為模板，使用Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase進行PCR擴增，所用引物為真菌ITS-F：5＇- CTTGGT-CATTTAGAGGAAGTAA-3＇和ITS-R：5＇- GCT-GCGTTCTTCATCGATGC -3＇。Miseq文庫構(gòu)建和測序委托上海歐易生物醫(yī)學科技有限公司完成，測序平臺為Illumina Miseq。使用Vsearch（version2.4.2）軟件對質(zhì)控得到的序列按照97%的相似度進行OTU分類，采用Blast算法對代表序列與數(shù)據(jù)庫進行比對注釋。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用QIIME（1.8.0）軟件對土壤真菌群落儀指數(shù)進行分析。利用歐易生物云平臺進行Venn圖的繪制，采用Bray Curtis算法進行主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA），利用Origin-Pr0 2021軟件進行冗余分析。使用SPSS Statistics23.0軟件進行方差分析，采用LSD法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 高碳基肥減氮施用對植煙土壤TC和TN的影響

由表2看出，在移栽后各關(guān)鍵生育期節(jié)點，高碳基肥減氮施用處理對土壤TC含量影響較為顯著（移栽后30、90 d），對土壤TN含量影響較?。ㄒ圃院?0、60 d）。移栽后30、60 d和90 d，G7處理土壤TC含量比GCK分別提高15. 38%、7.48%和3.32%，其中，移栽后30 d顯著高于對照。移栽后30 d和60 d，高碳基肥減氮施用對土壤TN含量無顯著影響，而移栽后90 d，高碳基肥減氮施用各處理土壤TN含量均降低，其中G5處理較對照顯著降低8. 22%。移栽后30 d，G3和G5處理的土壤C/N值顯著降低，而移栽后60 d，G5和G7處理的土壤C/N值顯著提高，分別提高9.68%和7.92%。綜上表明，高碳基肥減氮施用的G7處理能夠提高土壤TC、C/N值（移栽60、90d）和土壤總氮TN（移栽后30 d），進而影響土壤的碳氮平衡。

2.2 高碳基肥減氮施用對植煙土壤真菌群落僅指數(shù)的影響

高碳基肥減氮施用對土壤真菌群落α指數(shù)的影響如表3所示。采用Illumina Mi Seq測序平臺對36個土壤樣品進行分析，共獲得有效序列3 156 341條，OTUs數(shù)量為4 660個。測序平均覆蓋度達到99%以上，表明樣本包含大部分微生物，測序數(shù)據(jù)較為可靠。

移栽后30 d，高碳基肥減氮施用處理主要影響Chaol指數(shù)和物種數(shù)量。其中，G3處理的Chaol指數(shù)比GCK提高14.99%，G5處理的物種數(shù)量最低，比GCK降低10.09%。移栽后60 d，高碳基肥減氮施用對真菌群落o指數(shù)無顯著影響。移栽后90 d，高碳基肥減氮施用處理主要影響Chaol指數(shù)，而對其他指數(shù)無顯著影響。其中，G3處理的Chaol指數(shù)比對照提高13.53%。以上結(jié)果表明，高碳基肥減氮施用主要影響植煙土壤的真菌豐富度（移栽后30、90 d），對真菌多樣性無顯著影響。

2.3 高碳基肥減氮施用對植煙土壤真菌OTUs的影響

由圖IA看出，高碳基肥減氮施用處理G3、G5、G7和GCK在移栽后30 d特有的OTU數(shù)量分別為274、211、316、278個，共有OTU數(shù)量為397個；移栽后60 d，特有OTU數(shù)量分別為253、247、377、221個，共有OTU數(shù)量為324個（圖1B）；移栽后90 d，特有OTU數(shù)量分別為301、252、356、266個，共有OTU數(shù)量為417個（圖1C）。以上結(jié)果說明，高碳基肥減氮施用處理對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響不同，移栽后90 d，OTUs總量多，各處理共有OTU數(shù)達最大。

對移栽后30、90 d土壤真菌進行主坐標分析（PCoA），結(jié)果如圖2所示。移栽后30 d，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對土壤樣品真菌群落的貢獻率分別為65. 28%和21.60%，二者累計貢獻率為86. 88%。G3和G7位于第一象限，GCK位于第二象限，G5位于第三象限。移栽后90 d，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對土壤樣品真菌群落的貢獻率分別為53.24%和25.99%，二者累計貢獻率為79. 23%。G3和G7位于第一象限，GCK位于第二象限，G5位于第三象限。以上結(jié)果說明，高碳基肥減氮施用在移栽后30 d和90 d對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)影響較大。

2.4 高碳基肥減氮施用對植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 對真菌門水平群落結(jié)構(gòu)的影響

由圖3看出，土壤真菌在門水平歸為9個門類，包括子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、羅茲菌門（Rozellomycota）、球囊菌門（Glomeromy-cota）、絲足蟲門（Cercozoa）、芽枝霉門（Blastocla-diomycota）和新麗鞭毛菌門（Neocallimastigomyco-ta）。其中，相對豐度大于1%的門類為子囊菌門、接合菌門、擔子菌門和壺菌門，優(yōu)勢門類相對豐度之和占所有可注釋菌門的81.69% - 94.47%。移栽后30 d，G5處理子囊菌門相對豐度最高，比GCK提高35.13%：移栽后60 d，高碳基肥減氮施用處理降低了子囊菌門的相對豐度，提高了接合菌門的相對豐度：移栽后90 d，則降低了擔子菌門和壺菌門的相對豐度，其中G7處理的擔子菌門和壺菌門相對豐度較對照分別降低35. 02%和7.55%。該結(jié)果說明，高碳基肥減氮施用通過改變子囊菌門（Ascomycota）、接合菌門（Zygomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和壺菌門（Chytridiomy-cota）相對豐度影響真菌門水平的群落結(jié)構(gòu)。

2.4.2 對真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)的影響

高碳基肥減氮施用對真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)的影響如圖4所示。其中，相對豐度大于1%的優(yōu)勢屬包括腐質(zhì)霉屬（Humicola）、被孢霉屬（Mortierella）、錐蓋傘屬（Conocybe）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、鐮刀菌屬（Fusanum）和油壺菌屬（Solicoccozyma）。移栽后30 d，G5處理的木霉屬、青霉屬和腐質(zhì)霉屬相對豐度較對照分別提高105.55%、18.78%和22. 96%。移栽后60 d，高碳基肥減氮施用明顯降低鐮刀菌屬的相對豐度，各處理比GCK降低64.83% - 85.97%，G5處理的木霉屬相對豐度提高66. 09%。移栽后90 d，G5處理的木霉屬相對豐度提高152.65%。煙苗移栽后不同生育時期，G5處理均提高了腐質(zhì)霉屬和木霉屬的相對豐度，尤其是在移栽后90 d，木霉屬相對豐度提高幅度最大。移栽后30 d和60 d，G3和G7處理降低了腐質(zhì)霉屬的相對豐度，而移栽后90 d則提高了腐質(zhì)霉屬相對豐度。

2.5 土壤真菌群落組成與土壤TC、TN和C/N的關(guān)系

采用RDA分析土壤真菌群落組成與土壤TC、TN和C/N之間的關(guān)系，結(jié)果（圖5）表明，主成分I（PCI）和主成分2（PC2）對真菌優(yōu)勢門水平相對豐度的差異解釋度分別為73. 22%和23.14%，影響真菌門水平相對豐度的土壤因子依次為C/N、TN和TC。其中，子囊菌門（Ascomyco-ta）和壺菌門（Chytridiomycota）相對豐度與TN呈正相關(guān)，與TC和C/N值呈負相關(guān)。接合菌門（Zygomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）相對豐度與TC和C/N呈正相關(guān)，與TN呈負相關(guān)（圖SA）。

土壤真菌優(yōu)勢屬水平的RDA分析結(jié)果（圖5B）表明，主成分I（PCI）和主成分2（PC2）對真菌優(yōu)勢屬水平相對豐度的差異解釋度分別為81.38%和16.55%，影響真菌屬水平相對豐度的土壤因子依次為TN、TC和C/N。其中，被孢霉屬（Mortierella）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Pen-icillium）的相對豐度與TN和TC呈正相關(guān)，而與C/N值呈負相關(guān)。錐蓋傘屬（Conocybe）和腐質(zhì)霉屬（Humicola）相對豐度與C/N值呈正相關(guān)。上述結(jié)果表明，土壤TN、C/N和TC含量對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大。

土壤真菌作為植物根際微生態(tài)的重要組成部分，其多樣性影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)，是指示土壤肥力和監(jiān)測土壤生態(tài)環(huán)境的一個重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，高碳基肥的施用能顯著提高土壤碳含量。本研究中，高碳基肥減氮施用不僅改變了土壤的總碳含量，而且改變了總氮含量和C/N值。外來碳源的加入會刺激土壤呼吸和微生物活動，而G3和G5處理添加的碳源并不能達到其閾值，導致土壤總碳無法積累甚至減少，這可能是在移栽后各時期G3和G5處理的土壤總碳含量均低于GCK的原因。而隨著高碳基肥用量的增加和化肥氮的減少（G7處理），土壤總碳含量增加而總氮含量（移栽后60、90 d）減少，土壤的C/N值提高（移栽后60、90 d），這可能是因為高碳基肥減氮處理使得土壤總碳積累進而促進了植物對土壤氮素的吸收。這些變化表明高碳基肥減氮施用引起的土壤總碳和總氮的改變可能是土壤根際真菌豐富度和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的主要原因。

土壤中的碳、氮組分是植煙土壤的重要指標，其變化常常伴隨著土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。子囊菌門（Ascomycota）和接合菌門（Zygo-mycota）的相對豐度與土壤碳氮循環(huán)功能基因豐度之間呈正相關(guān)，其相對豐度與土壤碳氮循環(huán)息息相關(guān)。本研究中，高碳基肥減氮施用降低了子囊菌門相對豐度，提高了接合菌門相對豐度（移栽后60 d），RDA分析表明土壤總氮與子囊菌門相對豐度呈正相關(guān)，土壤總碳與接合菌門相對豐度呈正相關(guān)。子囊菌門多為腐生菌，通常是難降解物質(zhì)的分解者。接合菌門真菌大多能夠與植株根系形成互惠互利的共生體系，但子囊菌門真菌對于土壤pH值的變化極為敏感，高碳基肥減氮施用能夠通過減少化肥氮的施人提高土壤pH值，土壤pH值的變化可能是高碳基肥減氮施用降低子囊菌門相對豐度的原因。因此，高碳基肥減氮施用可能通過改變土壤pH值影響真菌門水平的群落結(jié)構(gòu)和土壤的氮循環(huán)。

在屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)，移栽后60 d，高碳基肥減氮施用（G5處理）顯著提高木霉屬（Tri-choderma）相對豐度，降低鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度，木霉屬相對豐度與土壤總碳和總氮呈正相關(guān)。木霉屬真菌是一類重要的生防真菌，其分泌的纖維素酶等參與土壤的碳氮循環(huán)，能夠通過競爭和拮抗抑制植物病原菌。鐮刀菌屬真菌是一類全球性分布的致病真菌，可侵染多種植物，造成植物萎焉、莖腐和根腐等各類腐爛病，是生產(chǎn)上較難防治的重要病害之一。高碳基肥中的外源碳能夠刺激真菌對土壤碳素的分解，同時高碳基肥減氮施用能夠提高土壤堿解氮含量，減少作物與真菌的競爭。木霉屬真菌可利用氮素促進菌絲的生長，這可能是木霉屬相對豐度增加的原因。此外，木霉菌相對豐度增加，抑制了病原菌的繁殖，這可能是鐮刀菌屬相對豐度降低的原因。因此，高碳基肥減氮施用可能通過影響土壤總碳和總氮含量進而影響真菌屬水平的群落結(jié)構(gòu)，調(diào)控真菌屬間的關(guān)系。此外，被孢霉屬（Mor-tierella）真菌是許多植物根系的內(nèi)生真菌，其分泌的有機酸能夠改善酸性土壤的養(yǎng)分狀況，而高碳基肥減氮能夠提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量。因此，被孢霉屬真菌可能參與高碳基肥減氮施用后的土壤速效養(yǎng)分調(diào)控，但其關(guān)系有待進一步探究。

4 結(jié)論

高碳基肥減氮施用（G7處理）提高了土壤總碳含量和C/N值（移栽后60、90 d），降低了土壤總氮含量（移栽后60、90 d）。G3處理顯著提高真菌的Chaol指數(shù)（移栽后30、90 d），影響土壤真菌的豐富度和群落結(jié)構(gòu)，高碳基肥減氮施用提高了接合菌門（Zygomycota）相對豐度，降低了子囊菌門（Ascomycota）相對豐度（移栽后60 d）；提高了木霉屬（Trichodernza）相對豐度，降低了鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度（移栽后60 d）。土壤總碳和總氮含量是影響重慶市豐都植煙土壤真菌群落結(jié)構(gòu)演變的重要因素。本試驗條件下，每公頃施用高碳基肥1 050 kg+純氮77.7 kg（G7）對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)以及土壤總碳、總氮和碳氮比影響較大。

基金項目：中國煙草總公司重慶市公司科技項目“提升豐都煙葉云煙品牌工業(yè)可用性關(guān)鍵技術(shù)集成與推廣”[A2020INY01-1303（2）]